Эндотелий как солевой сенсор сосудовНИР

Endothelium as a vascular salt sensor

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. Эндотелий как солевой сенсор сосудов
Результаты этапа: В работе исследовано влияние изменения осмолярности внеклеточной среды на объем клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) и внутриклеточное содержание ионов Na+ и K+. При инкубации клеток в течение 1 часа в среде с концентрацией Na+o, равной 85 мМ, в первые 10 мин происходит увеличение их объема в 2 раза с последующим быстрым (в течение 15-20 мин) регуляторным уменьшением объема (RVD); 30-минутная инкубация клеток в такой среде с последующим их переносом в среду, содержащую 135 мМ Na+, приводит к быстрому (в течение 5 мин) уменьшению их объема до 50%, которое затем сопровождается медленным регуляторным увеличением объема клеток (RVI). Для создания гиперосмотических условий мы использовали две среды: одна среда содержала 185 мМ Na+, в другой ионы Na+ были заменены на N-метил-D-глюкамин. В обоих случаях наблюдалось одинаковое уменьшение объема клеток до 50%, которое достигало максимальных значений через 10 мин после помещения клеток в гиперосмотические условия. RVI происходило довольно медленно, в течение 1 ч оно достигло всего лишь 60% от объема клеток, находящихся в изосмотических условиях. Используя метод пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии, мы изучили, как изменение объема клеток отражается на внутриклеточном содержании Na+ и K+. Обнаружено, что увеличение объема клеток, которые находились в течение 1 ч в гипосмотических условиях, не оказывает достоверного влияния на содержание одновалентных катионов. В результате инкубации клеток в гипосмотической среде в течение 30 мин и последующего их переноса в изосмотическую среду с 30-минутной инкубацией в ней наблюдается незначительное, но достоверное уменьшение (на 10%) внутриклеточного содержаниях обоих ионов. Гиперосмотическое сжатие клеток в отсутствие ионов Na+ во внеклеточной среде влечет за собой достоверное уменьшение (на 20%) содержания внутриклеточного Na+; если во внешней среде присутствуют ионы Na+– наблюдается увеличение (на 20%) внутриклеточного содержания этого иона. В обоих случаях внутриклеточное содержание ионов K+ достоверно не изменяется. Наши результаты показывают, что уменьшение объема клеток, т.е. их сжатие, в ответ на изменение осмолярности среды сопровождается последующим медленным регуляторным увеличением объема и влечет за собой возрастание внутриклеточного содержания Na+ только в случае его повышенной концентрации (>135 мМ) во внеклеточной среде. Исследование диапазона [Na+]o-чувствительной модуляции внутриклеточного содержания Na+ в клетках эндотелия показало, что инкубация клеток в среде, содержащей 145 мМ Na+, вплоть до 48 ч не приводит к увеличению внутриклеточного содержания этого иона. Однако через 1 ч инкубации мы регистрировали достоверное уменьшение внутриклеточного содержания Na+, через 2 ч инкубации этот параметр достиг значений контрольных образцов и не изменялся в течение 48 ч. Скорее всего, такое изменение опосредовано активацией Na,K-ATPазы и носит регуляторный характер. Возрастание внеклеточной концентрации [Na+]o до 160 мМ приводит к постепенному увеличению Na+i на 15% в течение 3 ч. Через 6 ч инкубации этот параметр изменился существенно и составил 160% по отношению к контролю. В течение 3 ч инкубации не наблюдалось никаких изменений внутриклеточного содержания K+, тогда как через 6 ч оно увеличилось на 15%. Таким образом, увеличение внеклеточной концентрации Na+o в диапазоне 145-160 мМ (что наблюдается при некоторых патофизиологических состояниях) приводит к диссипации трансмембранного градиента одновалентных катионов. В дальнейшем мы планируем изучить влияние Na+o в этом диапазоне концентраций на транскрипцию генов раннего ответа. В соответствии с данными других авторов увеличение концентрации Na+ во внеклеточной среде может изменить механические свойства клеток эндотелия. Мы исследовали влияние 145 мМ [Na+]o на поверхностную жесткость клеток методом силовых кривых и путем оценки флуктуаций плазматических мембран. Измерения проводили через 0,5, 24 и 48 ч инкубации клеток эндотелия в среде с повышенным содержанием Na+ как в отсутствие, так и в присутствии 1 нМ альдостерона. В условиях наших экспериментов мы не обнаружили ни увеличения значения модуля Юнга поверхности клетки, ни уменьшения флуктуаций ее мембран при увеличении осмолярности внеклеточной среды, что могло бы указывать на увеличение жесткости клеток. По всей видимости, и изменение поверхностной жесткости клеток эндотелия, и увеличение внутриклеточного содержания Na+ в ответ на увеличение концентрации этого иона во внеклеточной среде происходят параллельно. Этот вопрос мы будем изучать дальше. Ранее мы установили, что увеличение внутриклеточного соотношения [Na+]i/[K+]i приводит к изменению транскрипции генов. С целью идентификации Na+i/K+i-чувствительных генов мы исследовали кинетику изменения экспрессии генов в клетках эндотелия в ответ на изменение внутриклеточного содержания этих ионов с помощью технологии Affymetrix. Мы обнаружили, что увеличение внутриклеточного соотношения [Na+]i/[K+]i является достаточным условием для изменения транскрипции генов. Кроме того, количество таких генов, а также уровень их экспрессии коррелируют с величиной соотношения [Na+]i/[K+]i. Среди генов раннего ответа обнаружены RNU6-447P и RNU6-747P, кодирующие малые ядерные РНК U6, которые являются ключевыми компонентами сплайсосомы. В этом наборе были также гены SNORD32B, SNORA20, MLF1, NR4A2, FOSB и FOS. SNORD32B и SNORA20 кодируют соответствующие малые ядрышковые РНК, которые необходимы для созревания других молекул РНК. MLF1, NR4A2, FOSB и FOS являются транскрипционными факторами. Гены среднего ответа включали в себя те, продукты которых участвуют в сплайсинге мРНК и регуляции транскрипции (RNU-1263P, SNORD13E, TSC22D2, SNAPC1, HOXA9), в формировании провоспалительного ответа (Il1а, CXCL8, Il1RL1), канцерогенезе (SPRY4, CD274). Анализ активации сигнальных путей с участием протеинкиназы В (Akt) и ее мишени – транскрипционного фактора CREB – показал, что на ранних этапах диссипации градиента ионов Na+ и K+ происходит активация сигнальных путей, которые обеспечивают выживание клетки, что является твуже необходимым для реализации провоспалительного ответа. Наши результаты позволяют нам предполагать, что микроРНК, транскрипционные факторы, а также гены, участвующие в формировании иммунного и воспалительного ответа, могут являться ключевыми компонентами системы сопряжения возбуждения и транскрипции, обусловленного диссипацией градиента одновалентных катионов в результате увеличения внеклеточной концентрации [Na+]o. Необходимо отметить, что наличие воспалительной реакции рассматривается в настоящее время как один из факторов возникновения гипертонической болезни.
2 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. Эндотелий как солевой сенсор сосудов
Результаты этапа:
3 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. Эндотелий как солевой сенсор сосудов
Результаты этапа: Мы изучили влияние увеличения осмолярности внеклеточной среды в диапазоне 150-170 мМ Na+ на внутриклеточное содержание одновалентных катионов, на экспрессию некоторых Na+i/K+i-чувствительных генов и на поверхностную жесткость клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). При кратковременном воздействии внеклеточной концентрации Na+ в диапазоне 150-170 мМ наблюдалась тенденция к внутриклеточному накоплению этого иона. Поскольку в клетке содержится довольно большое количество K+, то его небольшие изменения трудно зафиксировать. В связи с этим для оценки изменения транспорта K+ мы использовали его аналог, Rb+. Мы обнаружили, что как кратковременная инкубация HUVEC в присутствии 150-170 мМ Na+ приводила к усилению буметанид-нечувствительного транспорта Rb+ внутрь клеток на 25-30%. Мы предположили, что такие изменения транспорта одновалентных катионов связаны с активацией Na,K-ATPазы вследствие усиления входа Na+ внутрь клетки через амилорид-чувствительные Na-каналы. Действительно, инкубация HUVEC в течение 3 ч в среде с повышенным содержанием Na+ в присутствии 1 мкМ амилорида не отразилась ни на внутриклеточном содержании Na+ и K+, ни на транспорте Rb+. Кроме того, ингибирование Na,K-ATPазы уабаином приводило к дополнительному увеличению внутриклеточного содержания Na+ в случае, если клетки содержались в среде с повышенным содержанием этого иона независимо от времени инкубации. Другими словами, мы установили, что амилорид-чувствительные Na-каналы и Na,K-ATPаза являются главными ион-транспортирующими системами, обеспечивающими адаптацию клеток эндотелия к условиям повышенной концентрации Na+ во внеклеточной среде. Задачей данного исследования было изучение эффекта диссипации градиента Na+i/K+i на транскрипцию некоторых Na+i/K+i-чувствительных генов в клетках эндотелия в ответ на гиперосмотическую стимуляцию. Мы исследовали, как инкубация клеток в присутствии Na+ в концентрации 150-170 мМ в течение 3 ч влияет на транскрипцию генов FOS, ATF3, PAR2, NOS3, PTGS2 и IL1α. В качестве контроля влияния осмолярности внеклеточной среды на транскрипцию этих генов использовали маннитол. Продолжительная инкубация HUVEC (96 ч) приводила к увеличению уровня мРНК FOS, IL6 и PAR2 в присутствии 150-170 мМ Na+, тогда как количество мРНК PTGS2 и IL1α изменялось также в присутствии изоосмолярной концентрации маннитола. Мы установили, что что транскрипция FOS, ATF3 и PTGS2 имеет Na+i-зависимый характер, тогда как транскрипция IL1α зависит от осмолярности внеклеточной среды. Регуляция транскрипции PAR2, по всей видимости, определяется внеклеточной концентрацией Na+. Одним из участников сигнального каскада, приводящего к изменению транскрипции генов в клетках, подверженных осмотическому стрессу, является осмопротекторный транскрипционный фактор NFAT5. Его мишенью, в частности, может являться PTGS2. Несмотря на то, что мы детектировали увеличение мРНК этого гена в клетках, подверженных действию уабаина и 160-170 мМ Na+, нам не удалось зафиксировать достоверного изменения экспрессии NFAT5 как на уровне мРНК, так и на уровне содержания белка. Поскольку увеличение осмолярности внеклеточной среды приводит к изменению объема клеток, это может сказаться на изменении амплитуды колебаний клеточных мембран, что может вносить свой вклад в изменение поверхностной жесткости клеток. Исследование влияния повышенной осмолярности внеклеточной среды на константу упругости мембран клеток эндотелия пупочной вены человека показало, что инкубация HUVEC в среде, содержащей 150-170 мМ Na+, приводит к уменьшению значения эквивалентной константны упругости клеточных мембран, что указывает на увеличение поверхностной жесткости клеток. В то же время увеличение осмолярности внеклеточной среды посредством добавления маннитола не оказывало влияния на этот параметр. Таким образом, мы установили, что поверхностная жесткость эндотелиальных клеток зависит именно от внеклеточной концентрации Na+, а не от осмолярности внеклеточной среды. Уже давно показана связь между соль-чувствительными заболеваниями и эндогенными кардиотоническими стероидами. Поскольку эти соединения во внеклеточных средах организмах находятся в субнаномолярных концентрациях, то их действие в качестве ингибиторов Na,K-ATPазы представляется маловероятным. В этой связи мы решили исследовать эффект уабаина на функционирование HUVEC в условиях продолжительной (96 ч) инкубации в присутствии 160 мМ Na+ и 0,3 нМ уабаина. Ранее мы показали, что 0,3 нМ уабаина активирует Na,K-ATPазу. Мы обнаружили, что в присутствии 160 мМ Na+ не происходило дополнительного усиления транспорта Rb+, отражающего активность Na,K-ATPазы, и не изменяло внутриклеточного соотношения Na+i/K+i по сравнению с клетками, инкубированными в присутствии 160 мМ Na+. В то же время наличие уабаина во внеклеточной среде увеличивало выживаемость клеток HUVEC в условиях гиперосмолярности. Таким образом, мы можем предположить, что уабаин в субнаномолярных концентрациях, скорее всего, способствует выживаемости клеток в условиях гиперосмотического стресса. Эти результаты коррелируют с нашими предыдущими исследованиями, в которых мы показали, что низкие концентрации уабаина увеличивают пролиферацию клеток млекопитающих, в частности HUVEC. Гиперосмотическая стимуляция эндотелиальных клеток может приводить к активации сигнальных путей с участием CREB, SGK1 и SIK1. Тем не менее, нам не удалось обнаружить какого-либо существенного изменения количества этих белков, а также степени их фосфорилирования при продолжительной инкубации HUVEC в высокосолевой среде. Анализ профиля изменения протеома клеток HUVEC при изменении внутриклеточного соотношения Na+i/K+i показал, что уменьшение этого соотношения (в случае активации Na,K-ATPазы) приводит к увеличению представленности белков, принимающих участие в регуляции синтеза белка, формировании межклеточных контактов, перестройки цитоскелета, что, вероятно, указывает на усиление пролиферативной клеточной активности. При увеличении внутриклеточного соотношения Na+i/K+i также возрастает представленность белков, участвующих в регуляции трансляции, хотя и в меньшей степени; в то же время идентифицируются белки, вовлеченные в адаптацию клетки к клеточному стрессу. На наш взгляд, все эти данные указывают на то, что главными (и первыми) мишенями внутриклеточного дисбаланса одновалентных катионов являются регуляторы транскрипции. Глобальной задачей нашего исследования является идентификация молекулярной природы Na+i/K+i-чувствительного механизма сопряжения возбуждения и транскрипции. В этой связи мы обратили наше внимание на структуры нуклеиновых кислот, которые по-разному связывают ионы Na+ и К+ и способны к изменению конформации. Это так называемые G-квадруплексы, неканонические вторичные структуры, которые образуются при наличии в их последовательностях областей, обогащенных гуанином. Используя онлайн-базы данных, мы обнаружили, что многие Na+i/K+i-чувствительные гены содержат последовательности, которые гипотетически могут формировать G-квадруплексы, в том числе в области промоторов. Затем мы исследовали влияние внутриклеточного соотношения Na+i/K+i на состояние G-квадруплексов in vivo, используя микроскопию времен жизни флуоресценции. В качестве флуорсецентной метки использовали лиганд, специфически связывающийся с G-квадруплексами ДНК. Оказалось, что среднее время жизни флуоресценции этого лиганда изменяется по мере увеличения внутриклеточного соотношения Na+i/K+i. В экспериментах in vitro мы установили, что среднее время жизни флуоресценции лиганда, связанного с различными G-квадруплексами, зависит от соотношения ионов Na+ и K+ в среде. Эти данные в совокупности указывают на изменение количества стабильных G-квадруплексов и/или типов их структуры вследствие диссипации градиента одновалентных катионов. Таким образом, мы предполагаем, что G-квадруплексы могут являться внутриклеточными сенсорами ионов Na+ и K+. Однако этот вопрос требует дальнейшего экспериментального изучения.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".