ИСТИНА

Актуальность исследования механизмов, регулирующих рост пыльцевой трубки, обусловлена тем, что этот процесс определяет успех оплодотворения и образования семян, и во многом зависит от успеха межклеточной коммуникации (пыльца ↔ спорофит). Вместе с тем, растущая пыльцевая трубка – наиболее перспективная модель для изучения закономерностей полярного клеточного роста, общих для столь разных объектов, как аксон нервной клетки, гифы грибов и корневые волоски. В ходе реализации Проекта впервые будет проведено сравнительное исследование функционирования важнейшего регуляторного механизма (АФК) в двух экспериментальных системах: упрощенной системе короткоживущей клеточной культуры и в системе целого репродуктивного органа (пестик) или его производного (экссудат рыльца, опылительная капля у хвойных). В работе будут использованы представители трех групп растений: покрытосеменные (однодольные и двудольные) и голосеменные. Это позволит выявить роль данного регуляторного модуля в общей картине морфогенеза и полярного роста клетки. На этой основе станет возможным определить конкретные мишени для направленного влияния на свойства растений, в частности, для повышения их продуктивности. Мы исходим из предположения, что активные формы кислорода (АФК), продуцируемые как NADPH-оксидазой плазмалеммы, так и внутри митохондрий, контролируют работу ионных каналов на плазмалемме вегетативной клетки, и тем самым регулируют активацию пыльцевого зерна и полярный рост трубки. Это представление сложилось в литературе последних лет, в том числе на основании наших исследований, проведенных in vitro. Однако развитие этой теории предполагает проверку в условиях более сложных репродуктивных систем и вовлечение объектов из разных систематических групп. В первом блоке работ по Проекту планируется перевести на новый уровень проводимое в лаборатории исследование мишеней для АФК в мужском гаметофите покрытосеменных и голосеменных in vitro. Большие надежды мы возлагаем на протеомные исследования (на базе ИБХ РАН), которые позволят выявить изменения в содержании белков в пыльцевом зерне после обработки АФК. Обнаруженные изменения планируется проверить с помощью вестерн-блота, чтобы получить убедительную картину редокс-сигналинга на уровне белков и белковых систем. На пыльце покрытосеменных в рамках первого блока планируется провести картирование различных эндогенных АФК в пыльцевых зернах и трубках, а также определить вклад радикальных АФК в регуляцию полярного роста трубок (пероксид водорода мы сравнительно хорошо изучили). К первому блоку относятся также планируемые исследования активации метаболизма и запуска полярного роста в пыльце голосеменных растений (они совершенно не изучены).Эти задачи подготовят базу для реализации второго блока, центральной темой которого станет взаимодействие мужского гаметофита и женского спорофита посредством АФК. Для покрытосеменных планируется изучить редокс-свойства рыльцевого экссудата методами спектрофлуориметрии и электронного парамагнитного резонанса (в сотрудничестве с кафедрой биофизики), а также эффективность прорастания трубок in vivo при изменении редокс-среды на рыльце. Для изучения действия рыльцевого экссудата и АФК, содержащихся в нём, на плазмалемму вегетативной клетки планируется привлечь проточную цитофлуориметрию, чтобы собрать большой массив данных по ряду параметров за ограниченное время (в сотрудничестве с кафедрой иммунологии). Физиология прорастания пыльцы хвойных in vivo не изучена, поскольку прижизненное проникновение в женскую шишку – нетривиальная техническая задача, которую осложняет строгая сезонность. Мы планируем собрать опылительные капли с молодых женских шишек и изучить редокс-свойства выделяемой жидкости, в которой оказывается пыльца in vivo, а также ее действие на физиологию пыльцевых зерен. Помимо сотрудничеств с другими научными коллективами в целях расширения методической базы, в работе предполагается использовать отработанные технические подходы: флуоресцентную микроскопию и спектрофлуориметрию. Мы располагаем набором флуоресцентных методов для специфичной детекции различных АФК и определения их субклеточной локализации, количественной оценки мембранного потенциала (авторский метод), рН, содержания анионов и других показателей ионного гомеостаза. Техническую базу и набор доступных методов планируется расширить в процессе реализации Проекта в сторону молекулярных методов (белковой химии). В результате реализации Проекта будет впервые экспериментально проверена гипотеза о ведущей роли редокс-регуляции во взаимодействии мужского гаметофита и женского спорофита в процессе половой репродукции. На этой основе станет возможным предложить стратегии оптимизации репродуктивного процесса, и, как следствие, повышения продуктивности растений и их устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям.

The relevance of research into the mechanisms regulating pollen tube growth is due to the fact that this process determines the success of fertilization and seed formation, and largely depends on intercellular communication (between pollen and sporophyte). At the same time, a growing pollen tube is the most promising model for studying the patterns of polar cell growth common to such diverse objects as the axons of neurons, fungal hyphae and root hairs. Within the Project, a comparative study of the functioning of an important regulatory mechanism (ROS) will be conducted for the first time in two experimental systems: a simplified system of short-lived cell culture and in the system of the entire reproductive organ (pistil) or its derivative (exudate, droplet). Three groups of plants will be represented in the study: angiosperms (monocots and dicots) and gymnosperms. This will reveal the role of this regulatory module in the overall scheme of morphogenesis and polar cell growth. We proceed from the assumption that reactive oxygen species (ROS), produced by both NADPH oxidase of the plasma membrane and inside the mitochondria, control ion channels on the plasma membrane of the vegetative cell, and thereby regulate the activation of pollen grain and the polar growth of the tube. This view has developed on the basis of research conducted in vitro in the recent years, including our data. However, the development of this theory involves testing in more complex reproductive systems and the involvement of objects from different systematic groups. In the first part of the Project, we plan to search for ROS targets in the male gametophyte angiosperms and gymnosperms in vitro. We have high hopes for proteomic studies (in collaboration), which will make it possible to identify changes in the protein content of pollen grains after ROS treatment. The detected changes will be tested using Western blot in order to obtain a convincing picture of redox signaling at the level of proteins and protein systems. On the angiosperm pollen we plan to carry out mapping of various endogenous ROS in pollen grains and tubes, as well as to determine the contribution of radical ROS to the regulation of the polar growth of tubes (we have studied hydrogen peroxide to date). The first block also includes studies on metabolism activation in gymnosperm pollen (it has not been studied at all). These tasks will prepare the basis for the second block, the central idea of which is the interaction of male gametophyte and female sporophyte through ROS. For angiosperms, it is planned to study the redox properties of stigma exudate using spectrofluorimetry and electron paramagnetic resonance (in collaboration), as well as the effectiveness of in vivo germination of the tubes when the redox environment on stigma changes. To study the effects of stigma exudate and ROS contained in it, it is planned to use flow cytometry o in order to collect a large array of data on a number of parameters for a limited time (in collaboration). The physiology of germination in coniferous pollen in vivo has not been studied, since the penetration into the female cone is a complex technical problem, which is complicated by strict seasonality. We plan to collect pollination drops from young female cones and study the redox properties of the secreted fluid, which contains pollen in vivo, as well as its effect on the physiology of pollen grains. In addition to cooperation with other research teams in order to expand the methodological base, the work assumes the use of technical approaches which have been developed and used in our lab: fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. We have a set of fluorescent methods for specific detection of various ROS and determination of their subcellular localization, quantitative assessment of the membrane potential (the author's method), pH, anion content and other indicators of ionic homeostasis. The technical base and the set of available methods should be expanded during the Project implementation towards molecular methods (protein chemistry). As a result of the Project, the hypothesis of the leading role of redox regulation in the interaction of male gametophyte and female sporophyte during sexual reproduction will be experimentally tested for the first time. On this basis, it will be possible to propose strategies to optimize the reproductive process, and, as a result, increase plant productivity and their resistance to adverse external influences.

1. Будут изучены изменения протеома пыльцевого зерна после обработки АФК, имитирующей воздействие женского гаметофита. Тем самым будут впервые идентифицированы мишени для действия АФК и downstream-эффекторы, участвующие в ответе гаметофита на сигнал. Актуальность этого результата не вызывает сомнений, поскольку АФК-сигналинг в мужском гаметофите в частности и в растительной клетке вообще сейчас находится в центре внимания исследователей, а массив наших данных по мембранным мишеням уже опубликован и вызвал большой интерес. Здесь также возможно практическое применение, поскольку кластеры белков, наиболее чувствительные к изменению редокс-статуса, могут стать мишенями для селекционной работы и/или генетической инженерии. 2. Картирование различных эндогенных АФК в пыльцевых зернах и трубках позволит ответить на вопрос о природе конкретных АФК, точках их преимущественной продукции и накопления, который на данный момент для покрытосеменных является дискуссионным, хотя попытки ответить на него делались различными группами. Определение вклада радикальных АФК в регуляцию полярного роста трубок расширит понимание восприятия сигнала АФК, а возможные различия в действии двух радикалов продемонстрируют избирательную чувствительность к ним клеточных компонентов, тогда последующие (см. 4) измерения содержания радикалов в экссудате позволят построить модель редокс-сигналинга на рыльце с участием всех присутствующих там АФК. 3. Впервые будет изучена динамика активации метаболизма и запуска полярного роста в пыльце голосеменных растений. Особое внимание будет уделено редокс-регуляции и ионному транспорту на этом этапе. Данный блок результатов будет совершенно новым, поскольку физиология ранних этапов прорастания пыльцы хвойных вообще не изучена, но без этого невозможно перейти к изучению взаимодействия с женским спорофитом. 4. Будет проведено комплексное исследование редокс-регуляции взаимодействия между мужским гаметофитом и женским спорофитом. Впервые рыльцевый экссудат и опылительная капля будут изучены физиологически, с точки зрения редокс-статуса и воздействия на пыльцу, с привлечением современных методов. Это позволит проверить предположение о наличии в жидкостях-производных спорофита АФК, воздействующих на пыльцу, оценить их природу и количество, а также значение этих соединений для прорастания. Эти результаты могут использоваться для повышения устойчивости/эффективности репродуктивных процессов за счет направленных изменений редокс-статуса цветков.

В рамках предыдущих Проектов была разработана оригинальная методика мониторинга мембранного потенциала с помощью быстрого красителя Di-4-ANEPPS (Брейгина и др., 2010. Цитология. 52:334), которая позже успешно применялась для лилии (Podolyan, Breygina, в печати) и ели (Maksimov et al. 2018. Plant Reprod. 18:761). Ряд общепринятых методик был адаптирован для пыльцевых трубок табака и лилии, например метод регистрации внутриклеточной концентрации кальция (Максимов и др., 2015. Цитология. 10:720; Podolyan, Breygina, в печати), а также для ели, например, сканирующая электронная микроскопия с использованием мягкой подложки и флуоресцентная визуализация различных слоев и структур клеточной стенки (Breygina et al. 2019. Protoplasma. DOI 10.1007/s00709-018-01333-3). Заявитель руководит небольшой лабораторией, в которой работают исключительно молодые ученые. В последний год мы продолжаем развивать контакты с другими лабораториями, в которых есть современное оборудование: получены первые результаты в протеомных исследованиях на базе лаборатории протеомики ИБХ РАН с участием А. Мамаевой А. и И. Фесенко; эти исследования планируется развить в рамках данного Проекта; начато сотрудничество с кафедрой иммунологии и получены первые данные о действии АФК в комплексе с различными ингибиторами на протопласты из пыльцевых трубок табака на проточном цитофлуориметре, в рамках настоящего Проекта планируется перейти к воздействию рыльцевым экссудатом – данный метод очень удобен для наблюдений за большими популяциями клеток по целому ряду параметров.