![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Изучение плюрипотентных стволовых клеток их дифференцировочного потенциала, позволяет решить проблемы, связанные с их клиническим применением. Актуальными остаются вопросы, связанные с онкогенной опасностью при применении данных клеток. Изучение экспрессионного профиля плюрипотентных клеток и клеток, полученных в результате направленной дифференцировки, позволяет оценить потенциальные риски, связанные с применением данных клеток. Важным представляется изучение везикулярного компонента паракринной секреции клеток, координирующего межклеточную коммуникацию и способного регулировать морфо-функциональное состояние клеток. В последнее время появились данные о наличие в экзосомах онкогенных микроРНК, которые могут приводить к трансформации клеток в тканях при трансплантации производных плюрипотентных клеток. Проект предусматривает изучение экспрессионного профиля плюрипотентных клеток и их производных, полученных в ходе направленной дифференцировки, прежде всего везикулярного компонента данных клеток. В ходе проекта будет разработана методика определения гистотипической чистоты культуры клеток, полученных в ходе направленной дифференцировки клеток с индуцированной плюрипотентностью по профилю везикулярного компонента. Сопоставление профиля микроРНК везикул, секретируемых самими ИПСК и их производными, будет использовано для прогностической оценки онкогенности культуры. Методика позволит обосновать риски, связанные с применением производных плюрипотентных клеток в клинической практике. Будут получены данные о процессах регуляции дифференцировки и проанализированы новые аспекты безопасности клинического применения клеток, производных ИПСК.
The study of pluripotent stem cells and their differentiation potential allows solving the problems which are associated with their clinical application. Questions related to potential tumorigenicity risk of the application of these cells are still relevant. The study of the expression profile of pluripotent cells and of cells, which were obtained by their directed differentiation, allows assessing potential risks of their practical application. It seems very important to study a vesicular component of the paracrine secretion of cells, which coordinates cell-to-cell communication and regulates morpho-functional state of the cells. In recent years, new data appear, according to which oncogenic microRNAs present in exosomes; it can lead to cell transformation in tissues after the transplantation of pluripotent cells derivatives. This project provides the study of the expression profile of pluripotent cells and their derivatives, which are obtained by directed differentiation of pluripotent cells, and, especially, of the vesicular component of these cells. Based on the profile of the vesicular component, we will develop the method for determining the histotypic purity of the cell cultures which are produced by directed differentiation of induced pluripotent cells. We will use comparative analysis of the microRNAs profiles from iPSCs and iPSCs-derived cells for prognostic evaluation of tumorigenicity of cell culture. This technique will allow justifying the risks of the application of pluripotent cells derivatives in clinical practice. We will obtain a new data about the mechanisms of cell differentiation regulation and will analyze new aspects of biosafety of clinical application of iPSCs –derivatives.
Будут изучены основные количественные и морфофункциональные характеристики внеклеточных везикул (экзосом) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) и клеток, полученных в ходе направленной дифференцировки ИПСК в нейральном направлении (НП-ИПСК) методом анализа экспрессии генов (ПЦР в реальном времени), будет разработан на модельных объектах комплексный подход к картированию химического состава ИПСК и НП-ИПСК методами рамановской микроскопии (РМС) (СARS микроспектроскопия) и ToF-SIMS (time of flight secondary ions mass-spectroscopy), что позволит в дальнейшем оценивать структурно-функциональное состояние данных клеток, а так же будут отработаны методики наблюдения и определения химического состава экзосом данными физико-химическими методами. Будут начаты работы по исследованию действия везикулярных частиц индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) и нейральных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (НП-ИПСК) на другие клетки, связанные с разработкой экспериментальных моделей in vitro. Кроме этого будут начаты работы по картированию химического состава ИПСК и НП-ИПСК методами рамановской микроспектроскопии и ToF-SIMS (time of flight secondary ions mass-spectroscopy) и продолжено исследование химического состава внеклеточных везикул ИПСК и НП-ИПСК. На модельных системах in vitro будет продолжено исследование действия экзосом индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) и нейральных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (НП-ИПСК), а так же продолжено изучение химического состава ИПСК, НП-ИПСК и внеклеточных везикул данных клеток методами рамановской микроспектроскопии и ToF-SIMS (time of flight secondary ions mass-spectroscopy) и проведено его сопоставление.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 16 июля 2019 г.-26 июня 2020 г. | Изучение паракринного статуса плюрипотентных стволовых клеток и их производных |
Результаты этапа: | ||
2 | 9 сентября 2020 г.-9 сентября 2021 г. | Изучение паракринного статуса плюрипотентных стволовых клеток и их производных |
Результаты этапа: Проведено дальнейшее изучение внеклеточных везикул (ВВ) клеток с индуцированной плюрипотентностью (ИПСК) при изменении функционального статуса клетки в процессе нейральной дифференцировки. Выявлены стабильно экспрессирующиеся гены (GAPDH и ACTb), мРНК которых выявляется как в самих клетках, так и в их ВВ на всех этапах нейральной дифференцировки. Эти гены предложены как референсные при анализе динамики процесса дифференцировки. Показано наличие мРНК характеристических генов-маркеров нейральной дифференцировки (Nestin, Pax6, Map2, TubbIII, S100B) как в самих клетках - нейральных производных (НП-ИПСК), так и в их ВВ. мРНК характеристических генов-маркеров плюрипотентного состояния (Oct4, Sox2, Nanog) сохраняется в популяции гетерогенных клеток, однако, в их ВВ присутствует мРНК только Sox2. Выявлено, что онкогенные микроРНК (микроРНК-486а-5р и микроРНК-151а-5р) присутствуют как в ИПСК человека, так и в их ВВ. То же выявляется в ходе дифференцировки ИПСК (по крайней мере до 35 суток дифференцировки). На предложенной модели для оценки биологического действия ВВ (ИПСК, культивируемые в среде N2B27) выявлена тенденция как везикул ИПСК, так и везикул НП-ИПСК вызывать снижение времени удвоения клеток в популяции. Подобраны концентрации везикул в среде для проявления их биологического эффекта (1х109 и 1х108 част/мл). Методами рамановской микроспектроскопии и ToF-SIMS (time of flight secondary ions mass-specrtroscopy) в ВВ мезенхимных стромальных клеток (МСК) выявлены характеристические пики фосфатидилхолина, холестерина, сфингомиелина и жирных кислот: миристиновой, пальмитоолеиновой, пальмитиновой, линоленовой, стеариновой. В ВВ ИПСК и в ВВ НП-ИПСК предварительно не удалось выявить холестерин и сфингомиелин. Проведение масс-спектрального имиджинга МСК показало топографическое различие ионов фосфатидилхолина, холестерина, в отличие от результатов, полученных для ИПСК и НП-ИПСК. Исследования выполнены согласно плану работ на 2020-2021 год (второй год выполнения проекта) в полном объеме. | ||
3 | 2 февраля 2022 г.-13 января 2023 г. | Изучение паракринного статуса плюрипотентных стволовых клеток и их производных |
Результаты этапа: В проекте было проведено исследование везикулярного паракринного компонента клеточной секреции (ВВ) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека в процессе направленной нейральной дифференцировки. Выявлено изменение контента ВВ в соответствии с направлением дифференцировки клеток. Показано наличие мРНК характеристических генов-маркеров нейральной дифференцировки (Nestin, Pax6, Map2, TubbIII, S100B) как в самих клетках - нейральных производных (НП-ИПСК), так и в их ВВ. мРНК характеристических генов-маркеров плюрипотентного состояния (Oct4, Sox2, Nanog) сохраняется в популяции гетерогенных клеток, однако, в их ВВ присутствует мРНК только Sox2. С нейрогенезом сопряжено появление как в клетках, так и в их ВВ характеристических микроРНК (микроРНК-99а-5р, микроРНК-125b-5p), и отсутствие в везикулярной фракции микроРНК, характерных для ИПСК (микроРНК302b-3p). Тем не менее, ряд онкогенных микроРНК (микроРНК-151а-3р, микроРНК486а-3р и микроРНК20b-5p) выявлялся как в клетках, так и в их ВВ. Показано, что в самих ИПСК и в НП-ИПСК присутствует мРНК прото-онкогена c-Myc и гена, кодирующего теломеразу человека (hTERT), однако в их ВВ мРНК данных генов отсутствует. Показано, что ВВ НП-ИПСК могут вызывать признаки ранней дифференцировки ИПСК, в частности, по появлению экспрессии гена FoxA2. Причем, регуляторный эффект соответствует концентрациии ВВ. Впервые проведенный протеомный анализ внеклеточных везикул в процессе направленной дифференцировки ИПСК показал усложнение протеомного спектра, отражающего ход дифференцировки, на всех уровнях клеточной организации. Показано, что в ВВ-НП-ИПСК присутствуют белки основных сигнальных путей, регулирующих нейральную дифференцировку (NOTCH, Wnt, Hedgehog), белки, контролирующие развитие нервной системы, дифференцировку нейронов, формирование синаптических контактов, белки – компоненты гликолиза, нейропротекторный белок –прогибитин, и др. Методом времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов (Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrom при изучении липидного состава ВВ ИПСК и НП-ИПСК было показано, что различий по липидному составу ВВ, полученных от разных типов клеток, а также везикул и мембран клеток нет. Методом рамановской микроскопии детектировали в ВВ разных типов клеток присутствие триацилглицеринов, фосфолипидов, холестерина и холестериновых эфиров, а также нуклеиновых кислот и аминокислотных остатков, входящих в состав белков. Причем в ВВ-НП-ИПСК более выражены полосы, характерные для нуклеиновых кислот и белков. Повышенное содержание белков во ВВ-НП-ИПСК подтверждено данными протеомного анализа. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".