Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функцииНИР

Small noncoding RNAs – 6S RNA transcription products in bacteria: synthesis, properties and functions

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 22 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции
Результаты этапа: В первый год реализации проекта была выделена РНКП α-протеобактерии Rhodobacter sphaeroides, синтезирована соответствующая 6S РНК и показано образование комплекса между двумя молекулами, а также продемонстрирован синтез пРНК в условиях in vitro. Детектированы пРНК с диапазоном длин от 16 до 23 нуклеотидных остатков (н.о.), определена их стартовая точка транскрипции. С помощью сервиса mfold выявлены наиболее вероятные вторичные структуры 6S РНК R. sphaeroides, отличающиеся организацией центральной расплетенной области. Предложен один из вариантов возможных изменений вторичной структуры 6S РНК при взаимодействии с синтезирующимися на ней пРНК. Мы полагаем, что пРНК длиной 18 н.о. достаточно для инициации конформационных изменений 6S РНК. Для изучения этого процесса синтезированы 8-, 12-, 14-, 18- и 22-звенные аналоги пРНК. Основываясь на полученных данных, мы приступили к проверке выдвинутой нами оригинальной гипотезы о возможном существовании ранее не предполагаемой антисенсовой функции пРНК и ее роли в регуляции экспрессии генов в бактериях. Для детекции этих потенциальных мишеней пРНК как антисенсовых олигорибонуклеотидов в бактерии R. sphaeroides под руководством доц. Д.Д. Первушина (Сколковский институт науки и технологий) был проведён биоинформатический анализ её генома и обнаружено 49 генов, мРНК которых содержали комплементарные к пРНК участки длиной 11 н.о. (включая два «мисматча»). Первый этап экспериментальной проверки гипотезы о функционировании пРНК как антисенсовых РНК был выполнен для бактерии Bacillus subtilis. С помощью ОТ-кПЦР было измерено относительное количество мРНК семи генов, содержащих участки комплементарности к пРНК в клетках дикого типа по сравнению с клетками с нокаутом гена 6S-1 РНК и, соответственно, в отсутствие пРНК. Для 6 генов наблюдалось 2-5-кратное увеличение количества мРНК в ответ на отсутствие 6S-1 РНК. Максимальный эффект обнаружен для мРНК гена srfAA, в котором находится наибольшее количество комплементарных пРНК участков.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции
Результаты этапа: 6S РНК - малая некодирующая РНК бактерий, которая взаимодействует с РНК-полимеразой (РНКП) и ингибирует ее активность. РНКП способна использовать 6S РНК как матрицу для транскрипции и синтезировать короткие олигорибонуклеотиды – пРНК (от англ. product RNA). Небольшая часть этих коротких транскриптов остается связанной с 6S РНК и меняет конформацию последней. В результате происходит высвобождение РНКП. В проекте предполагается, что пРНК взаимодействуют с комплементарными им последовательностями мРНК, выступая в роли антисенсовых РНК. Они могут «привлекать» нуклеазы, гидролизующие мРНК, и, следовательно, понижать количество мРНК определенных генов. Отсутствие пРНК должно приводить к увеличению количества мРНК этих генов. Были выбраны 8 наиболее вероятных генов-кандидатов бактерии B. subtilis, в которых содержатся от 2 до 8 возможных участков гибридизации с пРНК6S-1. Для оценки влияния пРНК на стабильность мРНК выбранных генов методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией определяли количества мРНК в клетках дикого типа по сравнению с клетками с нокаутом гена 6S-1 РНК и, следовательно, с отсутствием пРНК6S-1. В поздней стационарной фазе роста клеток и на стадии выхода из нее нокаут гена 6S-1 РНК достоверно приводил к повышению количества мРНК генов gidA, pabC, holB и srfAA. Внесение гена 6S-1 РНК B. subtilis в мутантные штаммы приводило к восстановлению количества мРНК этих генов до уровня, характерного для клеток дикого типа. В нокаутном штамме, в который был вставлен экспрессирующийся ген 6S РНК E. coli, количества мРНК генов gidA, pabC, holB и srfAA оставались повышенными. По-видимому, на количество выбранных мРНК влияет именно пРНК6S-1, а не 6S РНК. Изучено влияние ионов Mg2+ и Mn2+ на транскрипцию пРНК с матрицы 6S РНК R. sphaeroides РНК-полимеразой R. sphaeroides в присутствии и в отсутствие σ-субъединицы. Установлено, что кор- и холофермент РНКП R. sphaeroides синтезируют 15-23-звенные пРНК на 6S РНК только при наличии ионов Mn2+. Мы предположили, что CRE-район β-субъединицы РНКП E. coli может быть вовлечен в синтез пРНК на матрице 6S РНК E. coli. Для проверки этой гипотезы были исследованы свойства мутантных форм РНКП. Варианты РНКП с заменами D446A, E546А, W183A в CRE-районе синтезировали 17-19-звенные пРНК с той же эффективностью, что и нативный холофермент. Однако замена 5 остатков 443-451 из петли CRE-района на Gly приводила к преждевременной остановке синтеза пРНК на уровне 14-мера, что свидетельствует о важности этого фрагмента РНКП для эффективной РНК-зависимой транскрипции. Известно, что остаток D446 РНКП E. coli непосредственно вовлечен в специфические контакты с +2G в нематричной цепи промотора. Нами исследовано сродство 6S РНК к нативной и мутантной РНКП(D446A), а также взаимодействие РНКП с 6S РНК E. coli, содержащей замену G143C (соответствует позиции +2G в промоторе), in vitro и in vivo. Показана незначительная роль контактов остатка D446 РНКП с G143 6S РНК в формировании комплекса РНКП с 6S РНК. В ходе работы метод «молекулярных маяков» был адаптирован для анализа сродства 6S РНК к флуоресцентно меченному холоферменту РНКП E. coli, которое понижается в результате синтеза пРНК. Это указывает на разрыв связей между σ-субъединицей РНКП и -10-подобным элементом 6S РНК E. coli. Оказалось, что при нарушении контактов CRE-кармана с G143 происходит двукратное увеличение скорости высвобождения РНКП из комплекса с 6S РНК. Показано, что замена ключевых остатков С в -10-подобном элементе в позициях 132 и 133 6S PHK E. coli на G заметно снижает эффективность связывания такой РНК с РНКП E. coli in vitro и препятствует синтезу пРНК. Для детекции пРНК, образующихся в процессе транскрипции на матрице 6S РНК, предложен метод «зеркального» нозерн-блоттинга. Он позволяет осуществлять быстрый скрининг способности новых 6S РНК или их мутантных вариантов выступать в качестве матрицы для синтеза пРНК, а также оценивать эффективность данного процесса.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции
Результаты этапа: Проведен повторный более детальный анализ имеющихся данных транскриптома мутантных штаммов B. subtilis (∆bsrA, ∆bsrB и ∆bsrAB) в сравнении с диким типом в стационарной фазе с целью подтверждения повышения уровня экспрессии генов gidA, pabC, holB, srfAA. Методом ОТ-кПЦР в клетках R. sphaeroides дикого типа и штамме с делецией гена 6S РНК проведен сравнительному анализу эффективности транскрипции предполагаемых мРНК-мишеней пРНК (гены hmgL, flgK1 и RSP_0333). Осуществлен транскриптомный анализ этих штаммов в экспоненциальной и стационарной фазах роста клеток (в этих фазах в клетках дикого типа присутствует значительное количество 6S РНК). Проведено детальное исследование солевого фенотипа клеток R. sphaeroides с делецией 6S РНК с целью выявления условий, в которых 6S РНК и/или пРНК наиболее важны для клетки (различные концентраций NaCl и KCl, влияние стрессовых агентов на синтез мРНК гена мембранного белка SspA, связанного с солевым стрессом).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".