![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Настоящий проект нацелен на развитие фундаментальных знаний в области прямого биоэлектрокатализа и его применение для нужд здравоохранения. В настоящее время наиболее востребованный и массовый медицинский тест – определение содержания глюкозы в крови. Этот параметр является главным показателем при заболевании сахарным диабетом, встречающимся у полумиллиарда людей по всему миру. На долю Российской Федерации приходится не менее 4.5 миллионов человек. Основную опасность для больных диабетом представляют его осложнения, приводящие к почечной недостаточности, слепоте, летальным исходам. Для предупреждения этих осложнений диабетики вынуждены несколько раз в день контролировать уровень глюкозы в крови при помощи персональных электрохимических глюкометров. Производимые для них тест-полоски используют медиаторы для генерации тока, пропорционального концентрации глюкозы в крови. Однако другие редокс-активные вещества, присутствующие в крови (парацетамол, аскорбат и пр.), также способны генерировать сигнал, приводя к неверным показаниям. В данном проекте предложено устранить эту проблему при помощи прямого биоэлектрокатализа, при котором электроны туннелируют напрямую от фермента к электроду без вспомогательных переносчиков, нивелируя вклад в величину сигнала других компонентов крови кроме глюкозы. Проведение сравнительного анализа глюкозных биосенсоров, использующих прямой и медиаторный биоэлектрокатализ, позволит создать рекомендации к производству тест-полосок нового поколения для персональных глюкометров. В ходе выполнения исследования будет реализованы рекомендации к технологии массового производства тест-полосок и проведена валидизация метода измерения глюкозы в крови с использованием последних в соответствии с действующими стандартами точности, предъявляемыми к глюкометрам.
Current research is focused on extension of fundamental knowledge in the field direct bioelectrocatalysis and its application for occupational and public health. Nowadays blood glucose test is of great demand and one of the most frequent procedures. Raised blood glucose level is a key indicator of diabetes that about half a billion peoples are suffered from. There are not less 4.5 million of diabetics Russian Federation. The main danger for these people is different complications of diabetes such as kidney failure, blindness, and death. As a precaution, they have to strictly control blood glucose level by personal electrochemical glucometers. The latter use test-strips based on mediators generating current that is proportional to concentration of glucose. However, the other redox active substances in blood (such as ascorbate, paracetamol etc.) are also able to produce signal thus corrupting the measurements. This projected is aimed at avoiding this problem by introducing direct bioelectrocatalysis that eliminates the interference from other redox species in blood sample since electron is shuttled directly from enzyme to electrode. Hence, the resulting signal will depend only on glucose. Comparative investigation of biosensors based on direct and mediated bioelectrocatalysis will result in list of requirements for mass-production of novel glucose test-strips. During the investigations these requirements will be met and the accuracy of elaborated test-strips will be checked in accordance with ISO criteria.
В ходе выполнения плана на 1 год проекта: 1. Разработаны электрохимические платформы на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами, а также электроактивными и проводящими полимерами. Данные платформы, характеризующиеся улучшенной электрохимической кинетикой, необходимы для создания биосенсоров третьего поколения. 2. Исследован ряд азиновых красителей (фенотиазин, феназин, метиленовый зелёный, метиленовый голубой, азур, толуидиновый синий), а также новые производные на их основе в качестве медиаторов электронного переноса для PQQ- и FAD-глюкозодегидрогеназ. Определены наиболее эффективные медиаторы, обладающие лучшими электрокаталитическими свойствами, пригодные для создания биосенсоров второго поколения. 3. Проведена успешная иммобилизация ферментов на поверхностях электродов с различными модификаторами (углеродные материалы, электроактивные полимеры, проводящие полимеры), в результате которой созданы глюкозные биосенсоры второго поколения и впервые разработан биосенсор третьего поколения на основе глюкозодегидрогеназы. 4. Проведено сравнительное исследование прямого и медиаторного биоэлектрокатализа с участием PQQ- и FAD-глюкозодегидрогеназ, в результате которого выявлен способ создания высокоэффективного глюкозного биосенсора. 5. Сформулированы рекомендации и методики изготовления тест-полосок для персональных глюкометров на основе разработанных биосенсоров. В ходе выполнения плана на 2 год проекта: 1. Разработаны различные дизайны электродных структур для тест-полосок, изготавливаемых методом трафаретной печати, пригодных для функционирования в режиме генерации мощности (топливный элемент) и для применения кулонометрической детекции. 2. Достигнуты необходимые показатели аналитических характеристик тест-полосок (линейный диапазон определяемых концентраций, срок хранения, операционная стабильность). 3. Создан протокол измерения сигнала тест-полосок в режиме генерации мощности при помощи амперметра (без использования потенциостата). 4. Проведена кулонометрическая детекция глюкозы в модельных растворах при помощи разработанных тест-полосок. 5. Проведена апробация разработанных тест-полосок в ходе измерений образцов крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Валидизация тест-полосок на предмет соответствия критериям точности измерений для персональных глюкометров по стандартам ISO
Команда заявителей принимает участие в развитии направления (био)сенсорных систем, проводимых в лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУ под руководством профессора Карякина А.А., более 10 лет. Исследования, проводимые коллективом заявителей, относятся к приоритетным фундаментальным направлениям развития сенсорики и освещают принципиально новые подходы к разработке электроаналитических систем, в том числе для «умных» носимых устройств и задач медицинской диагностики. Для реализации нового протокола определения аналитов командой заявителей предложен способ работы (био)сенсоров в режиме генерации мощности, позволяющий проводить анализ с помощью простейшего амперметра (без специального электрохимического оборудования). Возможно и дальнейшее упрощение регистрации, при котором световая индикация будет указывать превышение порогового значения концентрации (продемонстрировано как пероксида водорода, так и глюкозы) Помимо упрощения системы регистрации сигнала такой подход обеспечивает более точное и правильное определение концентрации аналита даже в условиях турбулентного перемешивания за счет увеличения соотношения сигнал/шум на порядок. Для имитации пероксидазной активности был осуществлен каталитический синтез наночастиц берлинской лазури (нанозимов «искусственная пероксидаза»), обладающих каталитической константой в реакции восстановления Н2О2, вплоть до 200 раз превосходящей таковую для природного фермента. По сравнению с известными неорганическими нанозимами, наночастицы берлинской лазури могут быть использованы в нейтральных рН и не обладают оксидазной активностью. В рамках создания сенсоров участниками проекта разработаны методы нанесения электрокаталитических покрытий на основе берлинской лазури, их стабилизации, в том числе для создания ультрамикросенсоров, предложен экспрессный недеструктивный подход оценки сплошности покрытий методом спектроскопии импеданса.
1. Проведено исследование биоэлектрокатализа пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы, иммобилизованной на полимеризованных азинах, представлены результаты про прямому переносу электрона от активного центра фермента на электрод. Результаты опубликованы в международном научном журнале верхнего квартиля Analytical Chemistry. 2. Разработаны различные дизайны электродных структур для создания тест-полосок для определения глюкозы 3. Разработаны полимерные материалы для иммобилизации ферментов с целью создания тест полосок - на основе полиазинов, композитные на основе сажи и Нафион. 4. Созданы тест-полоски на основе разработанных электродных структур и модификаторов электродов (полиазины, медиаторы, сажа). 5. Проведено определение глюкозы в образцах цельной крови, а также в образцах пота
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 2 декабря 2019 г.-1 декабря 2020 г. | Разработка глюкозных биосенсоров нового поколения на основе прямого биоэлектрокатализа |
Результаты этапа: 1. Проведена модификация планарных печатных электродов углеродными наночастицами, получаемыми из сажи, и углеродными одностенными нанотрубками. Последние приводят к значительному увеличению фонового сигнала. Показано, что альтернативные способы модификации, направленные на увеличение площади поверхности (различное время выдерживания и циклическая вольтамперометрия в серной кислоте), помимо увеличения предельных токов приводят к увеличению фоновых токов, ухудшая соотношение сигнал/шум. Электроды, модифицированные углеродными наночастицами, сохраняют соотношение сигнал/шум и пригодны для конструирования биосенсоров без предварительной предобработки и гидрофилизации поверхности. 2. Для осуществления эффективного переноса электронов между активным центром фермента и поверхностью электрода были применены диффузионно-подвижные медиаторы на основе азиновых красителей. В настоящей работе для создания биосенсоров на основе пироллохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы предложено использовать в качестве редокс-медиаторов проводящие полимеры азиновых красителей. PQQ-GDH иммобилизовали путем адсорбции на поверхности полимера, синтезированного из азура А, метиленового синего, метиленового зеленого, кумасси, бриллиантового синего и толуидинового голубого в режиме циклической вольтамперометрии. Для указанных полимерных красителей исследована электроактивность и найдено оптимальное число циклов электрополимеризации для достижения максимальных значений биоэлектрокаталитических токов в диапазоне от 10 до 250 мкА/кв.см. В частности, для поли(метиленового зеленого) оптимальное число циклов – 15, тогда как для поли(метиленового голубого) – 7-8. Наиболее перспективные для создания биосенсоров – полимеры на основе метиленового зеленого и голубого, поскольку обеспечивают более высокие предельные токи, чем другие электрополимеризованные азины. Проведена иммобилизация флавинадениндинуклеотид-зависимой глюкозодегидрогеназы на немодифицированные углеродные электроды, показано, что потенциал полуволны совпадает с таковой для PQQ-GDH. С учетом меньшей удельной активности фермента и схожих предельных биоэлектрокаталитических токов, для дальнейших исследований предпочтительно использование PQQ-GDH. Проведено исследование термодинамики каталитического процесса на электродах, модифицированных различными полиазиновыми красителями. Показано, что для полимеров метиленового голубого, азура А, кумасси наблюдается одна полуволна в координатах предельный ток – потенциал. В то же время для поли(метиленового зеленого) наблюдается две полуволны, что указывает на разделение стадий переноса электрона с участием кофактора и улучшение стабилизации переходного семихинонного (полуокисленного) состояния пирролохинолинхинона. Предположительно, данный феномем, а также ориентационный эффект, известный для систем с полиазинами и другими дегидрогеназами, обуславливает столь драматическое улучшение биоэлектрокатализа в случае поли(метиленового зеленого). Исследована электрохимическая кинетика переноса заряда в присутствии феррицианида калия в рН 6.0 через интерфейсы на основе поли(метиленового синего) и поли(метиленового зеленого). Полимеры обладают схожей константой гетерогенного переноса заряда порядка 1 мкм/с. 3. Разработанный метод получения углеродных наночастиц и научный задел по иммобилилизации ферментов из сред с высоким содержанием органического растворителя позволил реализовать одностадийный способ получения глюкозного биосенсора третьего поколения на основе пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы (PQQ-GDH). Для мембраны проведена оптимизация состава по параметрам содержания сажи и мембранообразующего полимера. Для мембранообразующих растворов, предназначенных для изготовления биосенсоров третьего поколения, исследована стабильность при хранении при различных температурах. 4. Проведено сравнительное исследование характеристик разработанных биосенсоров на основе концентрационных зависимостей откликов в режиме хроноамперометрии. Наиболее высокие электрокаталитические токи зарегистрированы для биосенсоров на основе полиметиленового зеленого – до 220 мкА/кв.см. При этом предельный ток окисления глюкозы на интерфейсе полиметиленовый зеленый|PQQ-ГДГ примерно в 1000 раз выше, чем для биосенсора на основе фермента, адсорбированного на немодифицированном электроде. Предельное значением биоэлектрокаталитического тока для биосенсоров на основе полиметиленового зеленого в присутствии подвижного медиатора феназина метосульфата всего в 5 раз выше (1150 мкА/кв.см), чем таковое для электрополимеризованного медиатора. В то же время предельные токи для немодифицированного и модифицированных электродов (для полимеров на основе метиленового синего и зеленого, азура, толуидинового голубого, кумасси и др.) совпадают, указывая на одинаковое количество каталитически активного фермента. Таким образом, электрополимеризация азиновых красителей, впервые примененная для биосенсоров на основе PQQ-GDH, позволяет увеличить эффективность переноса заряда на 3 порядка величины. | ||
2 | 2 декабря 2020 г.-1 декабря 2021 г. | Разработка тест-полосок для персональных глюкометров |
Результаты этапа: 1. По результатам проекта опубликована статья в наиболее цитируемом международном журнале в области аналитической химии Analytical Chemistry (Американское химическое общество). 2. Разработаны различные дизайны электродных структур для создания тест-полосок для определения глюкозы 3. Проведена иммобилизация фермента при помощи различных модификаторов поверхности (полиазины, сажа, иные полимеры) с целью создания глюкозных биосенсоров. 4. Созданы образцы тест-полосок для определения глюкозы в цельной крови, а также в поте 5. Проведены измерения глюкозы в образцах цельной крови и пота с помощью разработанных тест-полосок. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".