ИСТИНА

Разработка биосенсоров - одна из самых актуальных задач биоинженерии. Биосенсоры необходимы для экологического мониторинга, тестирования безопасности и сохранности пищи, проверки соблюдения тех или иных государственных норм на производстве, для поиска новых лекарств и детекции опасных патогенов. На данный момент системы CRISPR/Cas стали активно использоваться не только для редактирования генома, но и в качестве молекулярной основы некоторых биосенсоров. Так, существует несколько способов использования этой системы для детекции нуклеиновых кислот, например, успешно было обнаружено наличие ДНК таких опасных патогенов, как вирусы Зика и Денге с невероятно низкой концентрацией. Использование CRISPR/Cas обеспечивает высокую чувствительность и специфичность биосенсора. Активному использованию dCas белков для диагностики ДНК препятствует неспецифическая активность эндонуклеаз. Чтобы ее исключить, в нашем проекте планируется совместить в одном биосенсере два деактивированных Cas-белка и снабдить данную систему дополнительными репортерными белками, которые будут давать сигнал только в случае корректного взаимодействия dCas пары с мишенью. Цель нашей работы - создание универсальной тест-системы на основе dCas9 и репортерных белков, способной к определению строго заданных специфических фрагментов ДНК.

The development of biosensors is one of the urgent tasks of bioengineering. Biosensors are extremely useful for environmental monitoring, safety standards verification and food security testing, for medical research, drug development and the detection of dangerous pathogens. Nowadays CRISPR / Cas systems are actively used not only for genome editing, but also as a molecular basis of some biosensors. There are quite a lot of ways to use this system for the detection of nucleic acids. For example, the presence of some dangerous viruses such as Zika and Dengue at incredibly low concentrations has been demonstrated recently. The use of CRISPR / Cas guarantees high sensitivity and specificity of the biosensor. The applicability of dCas proteins for DNA diagnostics is hindered by the non-specific activity of endonucleases. To exclude it, we will combine two deactivated Cas proteins and reporter proteins in one device. Thus, the signal will appear only if the protein pair interacts with the target correctly. The aim of our work is to create a universal test system based on dCas9 and reporter proteins, capable of detecting specific DNA fragments.

В ходе работы будут - определены оптимальные расстояния между различными комбинациями Cas белков в зависимости от используемой репортерной системы методами компьютерного моделирования; найдены PAM последовательности и таргетные ДНК - подобраны оптимальные комбинации белков для создания репортерной системы - созданы модифицированные dCas, связанные с репортерными белками - определена способность dCas белков связываться с таргетной последовательностью - измерена эффективность работы системы in vivo По результатам работы будут сделаны доклады на научных конференциях и опубликована статья в международном индексируемом издании.

У Армеева Г.А. иметься большой опыт в части молекулярного моделирования комплексов ДНК-белки, как методом молекулярной динамики, так и методами интегративного моделирования. Alexey K. Shaytan, Grigoriy A. Armeev, Alexander Goncearenco, Victor B. Zhurkin, David Landsman, and Anna R. Panchenko. Coupling between histone conformations and dna geometry in nucleosomes on a microsecond timescale: Atomistic insights into nucleosome functions. Journal of Molecular Biology, 428(1):221–237, 2016. M. E. Valieva, G. A. Armeev, K. S. Kudryashova, N. S. Gerasimova, A. K. Shaytan, O. I. Kulaeva, L. L. McCullough, T. Formosa, P. G. Georgiev, M. P. Kirpichnikov, V. M. Studitsky, and A. V. Feofanov. Large-scale atp-independent nucleosome unfolding by a histone chaperone. Nature Structural and Molecular Biology, 2016. G. A. Armeev, K. V. Shaitan, and A. K. Shaytan and. Conformational flexibility of nucleosomes: A molecular dynamics study. Moscow University Biological Sciences Bulletin, 70(3):147–151, 2015. У Глухов Г.С. имеется большой опыт молекулярно биологической работы над созданием рекомбинантных белков, их экспрессии и последующей оценки свойств данных белков. Voltage-dependent activation in eag channels follows a ligand-receptor rather than a mechanical-lever mechanism / O. A. Malak, G. S. Gluhov, G. Anastasia et al. // Journal of Biological Chemistry. — 2019. — Vol. 294, no. 16. — P. 6506–6521. Detergent-free solubilization of human kv channels expressed in mammalian cells / M. G. Karlova⁠, N. Voskoboynikova⁠, G. S. Gluhov⁠ et al. // Chemistry and Physics of Lipids. — 2019. — Vol. 219. — P. 50–57. The structure of a human voltage-gated potassium kv10.2 channel which lacks a cytoplasmic pas domain / G. S. Glukhov, A. V. Popinako, A. V. Grizel et al. // Biophysics. — 2016. — Vol. 61, no. 4. — P. 591–595.