| Результаты этапа: Cинтезированы конъюгаты классического разобщителя карбонилцианид-м-хлорфенилгидразона (СССР) с липофильным катионом трифенилфосфонием (ТРР), присоединенным через алкильный линкер варьируемой длины: С10, С8 и С12. Эти соединения названы, соответственно, CCCP-С10-TPP, CCCP-С8-TPP и CCCP-С12-TPP. В другой серии синтезированных конъюгатов в качестве липофильного катиона вместо ТРР использован родамин Б. Полученные соединения, имеющие С10 или С4 линкер, названы, соответственно, СССР-C10-RhB и СССР-C4-RhB.
Исследована активность аналогов mitoCCCP на плоской бислойной липидной мембране (БЛМ), а именно CCCP-C10-TPP и CCCP-C10-RhB. На основании измерений индукции ими стационарного тока через БЛМ, переходных токов в ответ на приложение потенциала (релаксация тока), а также диффузионных потенциалов ионов водорода, индуцируемых в ответ на создание градиента рН на БЛМ, сделан вывод о том, что в транспорте протонов участвует протонированная катионная форма CCCP-C10-RhB, которая доминирует при кислом рН, и депротонированная цвиттерионная форма. Обе формы способны к трансмембранной диффузии и соответственно к циклическому переносу ионов водорода через мембрану. Показано также, что CCCP-C10-ТРР в микромолярных концентрациях способен индуцировать транспорт ионов водорода в системе липосом, нагруженных рН-чувствительным флуоресцентным зондом пиранином.
С помощью ион-селективного электрода, чувствительного к тетрафенилфосфонию, продемонстрирована способность mitoCCCP, в частности, его аналога с С8 линкером, энергозависимо, т.е. в ответ на добавление субстрата дыхания (сукцината) накапливаться в изолированных митохондриях. Благодаря способности CCCP-C4-RhB ярко флуоресцировать, энергозависимое накопление этого конъюгата в митохондриях убедительно продемонстрировано методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS).
Впервые тщательно исследована на плоской БЛМ протонофорная активность усниновой кислоты (УК), наиболее известного вторичного метаболита лишайников, обладающего большим количеством полезных терапевтических свойств. Результаты экспериментов на БЛМ и выделенных митохондриях с применением аналогов УК, отличающихся отсутствием одной из трех имеющихся в УК гидроксильных групп, показали, что только при наличии всех трех гидроксильных групп усниновая кислота проявляет высокую протонофорную активность и является эффективным разобщителем окислительного фосфорилирования. Полученные данные объяснены в рамках модели, согласно которой перенос протонов осуществляется димерами УК, образующимися при связывании с УК ионов кальция, для чего и необходимо иметь все три гидроксила в молекуле УК. В пользу такой модели свидетельствуют наши данные о том, что добавление хелатора ионов кальция ЭДТА подавляло ток протонов через БЛМ, индуцированный УК, тогда как добавление ионов кальция приводило к восстановлению тока. Нами также показана способность УК связывать ионы кальция и другие катионы и переносить их в органическую фазу. Существенно, что аналоги УК, лишенные гидроксильных групп, проявляли намного более слабое по сравнению с УК антибактериальное действие в отношении Bacillus subtilis. Сделано заключение о том, что протонофорная активность УК вносит большой вклад в ее антибактериальное действие.
Исследована способность CCCP-С10-TPP, CCCP-С8-TPP и CCCP-С12-TPP снижать мембранный потенциал митохондрий по измерению поглощения потенциал-зависимого красителя сафранина О. В этом ряду наибольшей активностью обладал CCCP-С10-TPP.
Нами впервые обнаружено, что добавление миллимолярных концентраций KHCO3 приводит к восстановлению мембранного потенциала МХ, сниженного после добавления протонофоров СССР или ДНФ. Показано, что это ресопрягающее действие бикарбоната не зависит от присутствия таких ингибиторов аденилат-циклазы МХ как KH7 или LRE1, или ингибитора фосфодиэстеразы IBMX. Таким образом, действие бикарбоната не может быть опосредовано изменением уровня циклического АМФ в матриксе МХ. Показано также, что ресопрягающее действие бикарбоната не чувствительно к ингибитору карбоангидразы митохондрий ацетазоламиду. На основании наших данных можно предположить, что существует общее место связывания бикарбонат аниона и анионов СССР или ДНФ, которое предположительно находится на каком-то белке дыхательной цепи МХ или на белках-переносчиках, таких как дикарбоксилатный переносчик.
Показано, что CCCP-С10-TPP, CCCP-С8-TPP и CCCP-С12-TPP стимулируют дыхание митохондрий в концентрациях десятков микромолей, причем ряд активности был приблизительно таким же, который наблюдался по способности снижать мембранный потенциал МХ , т.е. наибольшей активностью обладал CCCP-С10-TPP, далее следовал CCCP-С8-TPP и наименее активен был CCCP-С12-TPP. Что касается родаминовых коньюгатов с СССР, то CCCP-C4-RhB был практически неактивен, тогда как CCCP-C10-RhB вызывал стимуляцию дыхания МХ в микромолярных концентрациях. Была исследована способность исследованных производных СССР ингибировать дыхание митохондрий и было показано, что в исследованном диапазоне концентраций, который даже превышал концентрации, вызывающие максимальную стимуляцию дыхания, не наблюдалось ингибирование дыхания митохондрий в разобщенном состоянии.
Изучено действие mitoCCCP и его производных на рост B.subtilis и E.coli. Оказалось, что mitoCCCP не подавлял роста этих бактерий вплоть до концентраций десятков микромолей. В то же время обнаружено, что коньюгат трифенилфосфония с NBD, имеющий децильный линкер (mitoNBD-C10), подавлял рост B.subtilis в субмикромолярных концентрациях. Исследована антибактериальная активность коньюгата флуоресцеина с алкилтрифенилфосфонием, метилзамещенным в пара-положении относительно центральной фосфорной группы (t-mitoFluo), и его предшественника mitoFluo. Оказалось, что как mitoFluo, так и t-mitoFluo подавляли рост бацилл в субмикромолярных концентрациях, при этом действующие концентрации t-mitoFluo были примерно в два раза ниже. Измерения мембранного потенциала бацилл с помощью потенциал-чувствительного красителя DiS-C3-5 показало, что высокая антибактериальная активность t-mitoFluo коррелирует с его выраженной способностью деполяризовать мембрану бактерий. |
| Результаты этапа: Присоединение липофильных катионов к различным малым молекулам широко используется для получения митохондриально-направленных соединений, обладающих специфической активностью. Было показано, что присоединение карбонилцианид-м-хлорфенил гидразона (СССР) к трифенилфосфониевому фрагменту значительно ухудшает протонофорные свойства СССР. Однако такое соединение способно подавлять разобщение митохондрий, вызываемое СССР. Этот результат находится в соответствии с представлением о том, что СССР разобщает митохондрии
через взаимодействие с каким-то белком митохондрий, причем mitoCCCP также способен связываться с этим белком, но не способен вызывать транспорт протона через этот белок. Кроме того, нами была получена серия производных популярного флуоресцентного красителя 7-нитробенз-2-окса-1,3-диазола (NBD). Согласно ранее полученным данным (Denisov et al. Bioelectrochemistry 2014), алкильные производные NBD способны разобщать изолированные митохондрии при концентрациях в десятки микромолей, несмотря на очень высокое значение pKa (~ 11) диссоциирующей группы. Было синтезировано ряд производных трифенилфосфония (TPP), связанных с NBD через углеводородные спейсеры различной длины: C5, C8, C10 и C12 (аналоги mitoNBD). Эти соединения энергозависимо накапливались в митохондриях. NBD-C10-TPP (C10-mitoNBD) проявлял протонофорную активность на искусственных липидных мембранах (липосомах) и разобщал изолированные митохондрии при микромолярных концентрациях, тогда как производное с коротким линкером, NBD-C5-TPP (C5-mitoNBD), практически не проявляло протонофорного и разобщающего действия. В согласии с этими данными, C10-mitoNBD был намного более эффективным, чем C5-mitoNBD, в подавлении роста бактерии Bacillus subtilis. Из изученных аналогов C10-mitoNBD и C12-mitoNBD проявляли наибольшую антибактериальную активность. Кроме того, C10-mitoNBD оказывал нейропротекторное действие на модели травмы головного мозга крысы. |
