Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1НИР

The role of SFPQ and NONO proteins in HIV-1 replication

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1
Результаты этапа: Основная работа 1-го этапа проекта была направлена на определение стадии экспрессии репортерного белка в модельной системе, на которую влияет белок SFPQ, и изучении механизма этого влияния. Для этого был определен уровень мРНК люциферазы светлячка, экспрессирующейся с вектора pGL3-LTR-HIV, в условиях повышенной внутриклеточной концентрации белка SFPQ. Также был сконструирован вектор на базе вектора pGL3-LTR-HIV с делецией лидерного региона ВИЧ-1, закодированного в LTR, но с интактным вирусным промотором, и проверено влияние SFPQ на стабильность мРНК люциферазы, содержащей и не содержащей лидерный регион мРНК ВИЧ-1. Кроме того, исследовалось изменение экспорта мРНК при суперэкспрессии SFPQ, для этого с помощью ПЦР в реальном времени определялось количество мРНК люциферазы светлячка в ядерном и цитоплазматическом лизатах при нормальном и измененном уровне SFPQ. Еще одним направлением работы был подбор условий экспрессии в Е.coli рекомбинантных белков SFPQ и NONO с тагами для аффинной очистки. В результате были получены индивидуальные гомодимеры и гетеродимер SFPQ/NONO и изучено in vitro их взаимодействие с РНК и ДНК.
2 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1
Результаты этапа: Были проведены исследования по изучению влияния клеточных белков SFPQ и NONO на ранние стадии репликативного цикла ВИЧ-1. Для решения поставленной задачи мы трансдуцировали клеточную культуру HEK 293T (клетки эмбриональной почки человека) с нормальным и пониженным уровнем SFPQ или NONO псевдовирусными частицами. Далее, с использованием количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), измеряли уровень различных форм вирусной ДНК в клетке. Снижение уровня SFPQ или NONO в клетках HEK 293Т достигалось с помощью коротких интерферирующих РНК (siРНК). Эффективность изменения уровня белка была подтверждена с помощью Вестерн-блота. Через 48 часов, когда уровень белков в клетках падал, мы трансдуцировали клетки с помощью псевдовирусных частиц. Через 24 часа клетки лизировали, выделяли ДНК и с помощью кПЦР измеряли общий уровень вирусной ДНК и уровень интегрированной формы для оценки эффективности процессов обратной транскрипции и интеграции соответственно. Показано, что нокдаун как SFPQ, так и NONO приводит к снижению количества общей вирусной ДНК на 55% и 40% соответственно. Таким образом, снижение уровня SFPQ и NONO в клетке влияет на обратную транскрипцию ВИЧ-1. При этом, уровень интегрированной ДНК вируса при нокдауне этих белков также снижался, и уровень снижения коррелировал с уровнем снижения общей вирусной ДНК. Другими словами, нокдаун SFPQ или NONO не влияет на стадию интеграции вирусной ДНК. Полученный результат говорит о том, что SFPQ является положительным фактором обратной транскрипции ВИЧ-1. Далее методом со-осаждения с использованием рекомбинантных белков с аффинными тагами показано, что SFPQ не взаимодействует с обратной транскриптазой, но взаимодействует с интегразой ВИЧ-1.
3 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1
Результаты этапа: С использованием метода пептидного фишинга, а также делеционных и точечных мутантных форм интегразы и SFPQ был охарактеризован комплекс интегразы с SFPQ. Определены аминокислоты в составе SFPQ, участвующие во взаимодействии с ИН. Показано, что влияние SFPQ на интеграцию и обратную транскрипцию действительно обусловлено его взаимодействием с ИН.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".