| Результаты этапа: В ходе второго года работ по проекту в Кандалакшском заливе Белого моря вблизи Беломорской Биологической Станции им. Н. А. Перцова МГУ имени М.В. Ломоносова нами было отобрано более 200 червей Terebellides stroemi и более 200 червей Scoloplos armiger, а также пробы окружающей среды. Образцы целых червей Terebellides stroemi разделяли на а) щупальца, б) червей без щупалец, в) кишечник червя, г) внутренняя часть трубки червя; черви Scoloplos armiger анализировали целиком. Образцы использовались для высокопроизводительного секвенирования ампликонов V4 участка гена 16S рРНК и полнометагеномного (shotgun) секвенирования на базе Illumina, электронной микроскопии и культивирования.
Анализ таксономического состава микробиомов трубок и кишечников Terebellides stroemi отобранных в 2020 и 2021 году выявил стабильность микробных сообществ, что в свою очередь может указывать на глубокое взаимодействие макро- и микроорганизмов. При этом микробиомы индивидуальных животных отличались на невысоких таксономических уровнях, что подразумевает особенности микробных сообществ у разных индивидуумов.
Результаты метагеномного секвенирования свидетельствуют о большем вовлечении ассоциатов S. armiger в метаболизм углеводов по сравнению с образцами T. Stroemi. С другой стороны, высокий процент (39,7%) белков с плохо предсказываемыми/неизвестными функциями у последних может свидетельствовать в пользу высокой доли новых микроорганизмов с неизвестными функциями.
Детальный анализ метаболических сетей требует сборки индивидуальных геномов из метагеномов (metagenome-assembled genome – MAG), которая будет осуществлена на следующем этапе работы. При необходимости будут отсеквенированы дополнительные метагеномы.
На основании результатов NGS-профилирования сообществ, проведенного ранее, для культивирования были выбраны следующие типы образцов червей Terebellides stroemi и Scoloplos armiger:
1. Особи червя Scoloplos armiger (выявлено доминирование глубокой ветви внутри филума Spirochaetota);
2. Щупальца Terebellides stroemi (обнаружены представители суперфилума DPANN, все известные представители которых являются облигатными симбионтами архей);
3. Кишечник Terebellides stroemi (обнаружены некультивируемые представители Mycoplasmataceae, а также большое общее разнообразие в составах микробных сообществ);
4. Внутренняя трубка Terebellides stroemi (предполагается отличие составов микробиомов внешней трубки и окружающих донных осадков за счет наличия выделяемых организмом червя секретов, влияющих на состав микробиома).
В качестве минеральной основы для приготовления питательных сред использовали морскую воду, в которую добавляли растворы витаминов и микроэлементов и субстраты, характерные для составляющих компонентов покровов червей, – желатин, хитозан, коллоидный хитин, глюкозу и гомогенат самих червей. Культивирование каждого из образцов проводили как в аэробных, так и в анаэробных условиях при температуре +10-15°С.
Полученные при культивировании в аэробных условиях накопительные культуры высевали на чашки с плотной питательной средой того же состава для определения морфологического разнообразия колоний культивируемых микроорганизмов, а также последующего выделения чистых культур. На следующем этапе планируется определение таксономического положения полученных чистых культур и сравнение их с доминирующими микроорганизмами, выявленными с помощью секвенирования ампликонов генов 16S рРНК и метагеномного секвенирования.
|
| Результаты этапа: В акватории Кандалакшского залива Белого моря вблизи Беломорской Биологической Станции им. Н. А. Перцова МГУ имени М.В. Ломоносова нами было отобрано более 800 червей Terebellides stroemi и Scoloplos armiger и проб окружающей среды. Были проанализированы образцы целых червей Terebellides stroemi и их части: а) щупальца, б) черви без щупалец, в) кишечник червя, г) внутренняя часть трубки червя, а также целые особи и отдельно покровы червей Scoloplos armiger. Образцы использовали для высокопроизводительного секвенирования ампликонов V4 участка гена 16S рРНК и полнометагеномного (shotgun) секвенирования на базе Illumina, сканирующей электронной микроскопии и культивирования.
Всего в ходе проекта было проанализировано более 100 профилей микробных сообществ аннелид и образцов их среды обитания. Филогенетический анализ выявил значительные отличия таксономического состава микробиомов обоих видов червей друг от друга и от микробиома внешней среды. Анализ таксономического состава микробиомов T. stroemi выявил стабильность микробных сообществ (на уровне таксонов высоких таксономических рангов), что в свою очередь может указывать на глубокое взаимодействие макро- и микроорганизмов. При этом микробиомы индивидуальных животных иногда отличались на невысоких таксономических рангах, что подразумевает индивидуальные особенности микробных сообществ у разных индивидуумов. Были выявлены специфические компоненты микробиомов кишечников и щупалец этого червя. В щупальцах T. stroemi было обнаружено значительное количество (до 17% от всех прокариот) микроархей, представлющих группу филумов DPANN (Diapherotrites, Parvarchaeota, Aenigmarchaeota, Nanoarchaeota, Nanohaloarchaeota), все известные представители которых живут за счет симбиотических/паразитических взаимоотношений с другими археями. Поскольку иных архей в образцах обнаружено не было, мы предполагаем новые, неизвестные до настоящего времени, ассоциации для обнаруженных представителей DPANN. Результаты таксономического анализа микробиомов червей S. armiger выявили доминирование представителей новых глубоких ветвей филума Spirochaetota и протеобактерии Endozoicomonas, для которых известны симбиозы с морскими животными. При этом у некоторых особей обнаруживались только спирохеты, у других – только Endozoicomonas или обе группы одновременно.
Для уменьшения количества эукариотической ДНК в препаратах щупалец T. stroemi и целых червей S. armiger при метагеномном анализе были применены техники разделения прокариотических и эукариотических клеток в градиенте Перколла, а также с использованием буфера для мягкого лизиса эукариотических клеток, не затрагивающего целостность эукариотических ядер и прокариотических клеток, с последующим центрифугированием при различных оборотах для их разделения. ДНК, выделенная из прокариотической фракции, служила для полнометагеномного (shotgun) секвенирования с применением технологии Illumina. Полученные результаты метагеномного секвенирования свидетельствуют о высокой метаболической вариативности ассоциантов S. armiger. Во всех исследуемых метагеномах наблюдался высокий процент белков с плохо предсказываемыми/неизвестными функциями (от 16 до 39,7%), который может свидетельствовать в пользу высокой доли новых микроорганизмов с неизвестными функциями. Детальный анализ метаболических особенностей, представленных в данных микробных сообществах микроорганизмов требует сборки и анализа индивидуальных геномов из метагеномов (metagenome-assembled genome – MAG), которые не удалось провести в первую очередь ввиду большого количества эукариотической ДНК, что снизило глубину секвенирования прокариотной компоненты и не позволило собрать индивидуальные геномы достаточного для анализа качества. Использованные в работе техники для уменьшения количества эукариотической ДНК в препаратах оказались недостаточно эффективными в работе с данными организмами, что определяет необходимость их улучшения.
С помощью сканирующей электронной микроскопии была установлена локализация представителей некультивируемых представителей филума Spirochaetota (по характерной для них морфологии), которые находились на покровах особей Scoloplos armiger. Данные флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) подтвердили локализацию данной группы на поверхности, а также внутри кутикулы червей.
На основании результатов NGS-профилирования и данных микроскопии следующие типы образцов были выбраны для культивирования: особи червя Scoloplos armiger, отдельные покровы S. armiger, щупальца Terebellides stroemi, кишечник Terebellides stroemi, внутренняя трубка Terebellides stroemi. Были получены аэробные и анаэробные накопительные культуры, растущие на среде Difco Marine Agar 2216 для культивирования морских гетеротрофных микроорганизмов, а также на синтетических средах и средах с морской водой в качестве минеральной основы, в которые были добавлены субстраты, являющиеся компонентами покровов червей и/или окружающей среды: коллаген, желатин, коллоидный хитин, хитозан, глюкоза, гомогенаты исследуемых червей. Наиболее разнообразными по морфологии микроорганизмов накопительными культурами как в аэробных, так и в анаэробных условиях оказались культуры, полученные из образцов червей S. armiger и растущие на желатине в качестве единственного субстрата.
Таким образом, в результате работы удалось определить составы микробиомов кольчатых червей типа Annelida с использованием классических микробиологических и современных молекулярно-экологических методов и выявить уникальные микробные сообщества, включающие глубокие филогенетические группы архей и бактерий (в т.ч. некультивируемые). Отбор и анализ образцов проводили несколько раз в течение всего проекта, и профили микробных сообществ одних и тех же объектов разных лет были схожи, что подтверждает достоверность полученных результатов. Помимо этого, сопоставимыми были результаты, полученные разными методами исследования. Так, результаты NGS амликонов гена 16S рРНК, показавшие доминироваение спирохет в образцах червей Scoloplos armiger подтвердились сканирующей электронной микроскопией и FISH, а метагеномный анализ образцов подтвердил результаты NGS-профилирования по гену 16S рРНК. Данные метагеномики выявили наличие большого количества белков с плохо предсказываемыми или неизвестными функциями, что может свидетельствовать о принадлежности этих микроорганизмов к новым таксономическим группам. Проведенные в ходе проекта работы с применением разносторонних методов исследования позволили сложить достаточно целостное представление о составе микробиомов исследуемых аннелид, определить локализацию наиболее интересных микробных ассоциантов и внести некоторые предположения об их функции.
|
