Градиентные макропористые скаффолды нового поколения, созданные с использованием аддитивных технологий, для тканеинженерной реконструкции комплекса различных по жесткости тканейНИР

The new generation of macroporous gradient scaffolds fabricated via additive technologies for tissue-engineering regeneration of a set of tissues with different stiffness

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 20 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. Градиентные макропористые скаффолды нового поколения, созданные с использованием аддитивных технологий, для тканеинженерной реконструкции комплекса различных по жесткости тканей
Результаты этапа: В ходе выполнения работ за отчетный 2020-2021 период был синтезирован твердофазным способом однофазный порошок ТКФ. Показано влияние ПАВ при помоле на возможность получения частиц ТКФ необходимого для стереолитографической печати размера. Разработана методика получения стабильных фотоотверждаемых макроэмульсий на основе ТКФ для стереолитографической трехмерной печати. Было исследовано влияние условий получения (скорость и время перемешивания) фотоотверждаемых эмульсий на стабильность эмульсий и пористость в керамических материалах. Определены оптимальные условия получения эмульсий. Исследованы реологические характеристики разработанных эмульсий. Показана возможность получения керамических материалов с заданной пористостью в широком диапазоне размеров. Продемонстрировано влияние эмульгатора на фоточувствительные свойства эмульсий и были определены основные условия для стереолитографической печати макроэмульсиями на основе ТКФ. Изучено влияние различного содержания дисперсионной среды на размеры пор в керамических изделиях. Отработана технология стереолитографического формования фотоотверждаемых макроэмульсий на основе ТКФ. Продемонстрированы подходы по повышению разрешения трехмерной печати при использовании фототверждаемых эмульсий. Исследована стабильность исследуемых эмульсий во времени и влияние параметров экспозиции на распределение пор по размерам в керамических материалах. Получены керамические ультрапористые материалы с архитектурой типа «Гироид» с многоуровневой системой пор. Продемонстрирована возможность вариации содержания ТКФ в дисперсионной среде для управления размером и долей пор. Исследовано влияние объемной загрузки ТКФ на фоточувствительные характеристики исследуемых систем. Показано влияние концентрации фотопоглащающей добавки на критическую энергию полимеризации и фоточувствительность макроэмульсий на основе ТКФ. Показана зависимость толщины стенок керамического каркаса от объемной загрузки ТКФ. Разработаны трехмерные компьютерные модели конструкций со структурой «Гироид» двух типов. Представлены модели для создания керамических материалов методом стереолитографической трехмерной печати для медико-биологических исследований in vitro и in vivo. Было установлено, что использование фотоотверждаемых эмульсий для стереолитографической печати позволяет получить сквозную многоуровневую систему пор, которая позволяет понизить требования для термической обработки композитных материалов, за счет увеличения площади поверхности для полного удаления всех органических составляющих. В медико-биологических исследованиях in vitro мезенхимные стромальные клетки (МСК) человека пролиферировали в течение 7 дней на всех образцах таблеток. При этом наиболее оптимальным с точки зрения пролиферации и жизнеспособности был образец с порами II моды 100-250 мкм. На этих образцах по данным РЭМ морфология клеток отличается от контроля, у них больше отростков, и, предположительно более активна синтетическая функция (отложение внеклеточного матрикса), что, скорее всего, будет существенно влиять на дифференцировку клеток. Таким образом, данный размер пор является наиболее перспективным для дальнейших исследований по дифференцировке клеток in vitro и остеогенному потенциалу in vivo. Результаты экспериментов по изучению разного размера пор на жизнеспособность и пролиферацию клеток подтвердились в случае образцов типа «Гироид». МСК человека пролиферировали в течение 7 дней на всех образцах гироидов. При этом наиболее оптимальным для пролиферации клеток был образец с размером пор II моды 100-250 мкм. На основании результатов, полученных с помощью РЭМ, было выявлено, что поры большего размера вызывают изменения морфологии МСК, сходные с контролем, поскольку клетки распластываются по всей поверхности поры. Данная характеристика способствует адгезии МСК, за счет чего, вероятно, происходит активная пролиферация на этом образце. Однако, веретеновидную форму, которая по данным литературы способствует стимуляции остеогенной дифференцировке клеток, МСК принимают на образцах с размером пор 100-250 мкм. В ходе исследования была разработана, апробирована и предложена методика выполнения, заполнения и фиксации полного дефекта диафизарного отдела бедренной кости крысы. Кроме непосредственно выполнения оперативного вмешательства, благодаря использованию моделей-фантомов стало возможным проводить обучение нового персонала или усовершенствование методики, или разработку стандартной операционной процедуры по замещению дефекта конструкциями тканевой инженерии. Методика позволяет при отработанных манипуляциях оперативно и без внешних излишне усложненных приборов проводить изучение свойств новых костно-замещающих материалов in vivo с высокой степенью надежности.
2 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. Градиентные макропористые скаффолды нового поколения, созданные с использованием аддитивных технологий, для тканеинженерной реконструкции комплекса различных по жесткости тканей
Результаты этапа: 1. Исследованы реологические характеристики фоточувствительной дисперсной системы ГЕМА-вода/ТКФ/«парафиновое масло» для выбора оптимального состава стабильной для стереолитографической трехмерной печати с различным объемным содержанием ТКФ. Определены параметры для стереолитографической трехмерной печати композитных объектов сложной формы на основе дисперсной системы ГЕМА-вода/ТКФ/«парафиновое масло». 2. Исследованы реологические характеристики фоточувствительной дисперсной системы ГЕМА-вода/ТКФ/«парафиновое масло» для выбора оптимального состава стабильной для стереолитографической трехмерной печати с различным содержанием дисперсной фазы – парафиновое масло. 3. В результате проведенных исследований впервые разработана температурная программа для плавного удаления органической составляющей композита (в том числе и дисперсионной фазы) для системы ГЕМА-вода/ТКФ/«парафиновое масло». Данная программа позволяет минимизировать влияние удаления органической матрицы на конечную микроструктуру ультрапористого керамического изделия. 4. Проведены механические испытания полученных материалов, исследованы их вязкоупругие свойства для мягких материалов и жесткость для керамических изделий различной пористости. 5. Проведена оценка биологических свойств полученных материалов с использованием иммортализованных МСК человека с последующей валидацией результатов, оценка жизнеспособности и пролиферативной активности клеток при культивировании на исследуемых образцах материала. 6. Апробированы разработанные на фантоме системы формирования, заполнения и фиксации дефекта бедренной кости крысы in vivo с использованием ультрапористых керамических материалов.
3 1 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. Градиентные макропористые скаффолды нового поколения, созданные с использованием аддитивных технологий, для тканеинженерной реконструкции комплекса различных по жесткости тканей
Результаты этапа: 1. Исследование реологических характеристик фоточувствительных суспензий с различной объемной долей дисперсионной фазы и зафиксированным содержанием ТКФ на основе ГЕМА (гидроксиэтилметакрилат) - гидрогеля. Исследование параметров фоточувствительных характеристик полученных дисперсных систем. Отработка технологии стереолитографического формования полученных дисперсных систем. Реологические характеристики исследуемых фоточувствительных эмульсий на основе ТКФ были исследованы в рамках этапа 2021-2022 гг. Для определения фоточувствительности и критической энергии полимеризации полученных эмульсий строили калибровочную зависимость глубины полимеризации от дозы облучения, которые позволяют быстро определить условия печати. Полученную зависимость аппроксимировали прямой в полулогарифмических координатах, согласно уравнению Джейкобса: C_d=D_p ln⁡(E_0/E_c ), где Cd – глубина полимеризации, Dp – фоточувствительность суспензии (глубина, на которой интенсивность УФ-излучения уменьшается в е раз), E0 – энергия (интенсивность) падающего пучка, Eс – критическая энергия полимеризации (минимальное значение энергии, необходимое для начала полимеризации суспензии). Для приготовления прямых фотоотверждаемых эмульсий (типа «масло в воде») использовали следующие реактивы: ТКФ, ГЕМА (гидроксиэтилметакрилат), воду дистиллированную, парафиновое масло (ρ = 0.8 г/мл), полиакриловую кислоту, эмульгатор Cremophor EL (PECO), фотоинициатор TPO (триметилбензил-дифенилфосфиноксид). В качестве водной фазы выступала смесь ГЕМА:ПЭГДА (1:1) с водой, внутреннюю масляную фазу формировало парафиновое масло. Увеличение количества эмульгатора в эмульсии понижает Dp (фоточувствительность) и повышает Ec (критическую энергию полимеризации) за счет уменьшения размера капель масла, диспергированных в среде суспензии ТКФ в водной смеси ГЕМА:ПЭГДА. Парафиновое масло не поглощает при длине волны 405 нм (длина волны светодиода используемого стереолитографического принтера), поэтому при использовании эмульсий с большим размером капель масла (будущие керамические материалы с большим средним размером пор более 150 мкм) фоточувстивтельность сильно возрастает до значений 500-600 мкм, что отрицательно влияет на разрешение при печати высокодетализированных изделий. Для снижения фоточувствительности и повышения критической энергии полимеризации при трехмерной печати был использован водорастворимый пищевой краситель Е104, который был введен в дисперсионную среду всех исследуемых эмульсий. Введенный краситель в фотоотверждаемую эмульсию поглощает часть энергии, тем самым изменяя характеристики фотоотверждения. Увеличение количество красителя от 10-4 М до 10-2 М повышает Ec с 8.57 до 29.34 мДж/см2, соответственно. При этом фоточувствительность понижается с 350 до 112 мкм (без красителя составляет 530 мкм). Согласно полученным данным, были выбраны различные условия для каждой эмульсии для трехмерной стереолитографической печати и напечатаны трехмерные композитные объекты со структурой «Гироид» (разработанной на первом этапе проекта). Полученные композитные материалы подвергали температурной обработке для удаления органической матрицы из композита и в дальнейшем обжигали при 1200оС для получения керамического материала с относительной плотностью до 90% и с несколькими модами пор (рис1.1): заданная на стадии компьютерного моделирования порядка 750 мкм, полученная с помощью эмульсии ~150мкм и поры со средним размером 1-2 мкм за счет неполного спекания керамического каркаса. Рис. 1.1. Данные растровой электронной микроскопии для керамического материала со структурой «Гироид», полученного из эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 20 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Вывод по задаче Отработана технология стереолитографического формования фотоотверждаемых макроэмульсий на основе ТКФИсследовано влияние доли дисперсионной среды, а также содержание эмульгатора на фоточувстительные характеристики полученных эмульсий. Получены керамические ультрапористые материалы с архитектурой типа «Гироид» с регулируемой многоуровневой системой пор. 2. Изучение механических и вязкоупругих свойств керамических материалов и полимерных композитов, полученных с использованием фотоотверждаемых эмульсий. Исследование условий термообработки напечатанных композитов для получения керамических изделий заданной геометрии. Для изучения механических свойств материалов были получены керамические материалы с использованием разработанных в отчетном 2021-2022 году фотоотверждаемых эмульсий на основе ТКФ и смеси мономеров ПЭГДА и ГЕМА. Полученные композитные материалы «ТКФ-гидрогель-масло» подвергали температурной обработке по температурной программе, разработанной в ходе предыдущего этапа проекта, что позволяет получать керамические образцы без дополнительных дефектов, которые могут возникать в ходе процесса удаления полимерной матрицы и испарения масла. Спекание керамических материалов проводили при 1200 оС. Испытания на сжатие керамики проводили на одноколонной электромеханической разрывной машине «РЭМ.I-1.0-А» (Метротест, Россия) со скоростью 1 мм/мин из расчета 5 образцов на точку. В результате была определена прочность на сжатие для каждой серии образцов. Были исследованы керамические материалы, которые были получены из фотоотверждаемых эмульсий различного состава. Варьировали содержание парафинового масла от 50 до 80 об% при фиксированном содержании частиц ТКФ в дисперсионной среде – 30 об%. При фиксированном содержании дисперсионной фазы 50об%, варьировали содержание частиц ТКФ в дисперсионной среде от 20 до 40 об%. В каждых группах составов варьировали содержание эмульгатора для определения зависимости размера пор в керамических материалах от содержания эмульгатора. Полученные в ходе данной работы высокопористые керамические структуры показывают высокие значения удельной прочности на сжатие при низких относительных плотностях для керамических материалов на основе ТКФ. Варьирование количества парафинового масла, с учетом использования приема неполного спекания керамики на основе ТКФ была получена мода пор с долей ~30%, позволяет получать керамические материалы с пористостью от 65% до 80%. При использовании эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 20 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА, увеличение количества эмульгатора приводит к уменьшению среднего размера пор в керамических материалах от 100 до 10 мкм (рис.2.1), которые получаются путем удаления выгорающей добавки (парафинового масла). Уменьшение размера пор с сохранением объемной доли ТКФ приводит к утонению керамического каркаса, порой до одного-двух зерен в сечении «перемычки» ячеистого каркаса, что сказывается на механической прочности полученных керамик. Увеличение доли эмульгатора в фотоотверждаемых эмульсиях с 0.05 вес% до 0.25 вес% приводит к снижению предела прочности на сжатие керамических образцов на основе ТКФ с 3.50.6 МПа до 1.10.1 МПа, соответственно. Рис. 2.1 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 20 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Увеличение объемной доли частиц ТКФ в дисперсионной среде позволяет увеличить прочностные характеристики исследуемых материалов. С другой стороны, увеличение доли ТКФ приводит к увеличению вязкости дисперсионной среды, что приводит к нестабильности исследуемых эмульсий. Так при использовании 30 и 40 об% ТКФ использование небольшого количества эмульгатора не позволяет получить стабильную систему, таким образом ограничивая возможности получения керамических материалов со средним размером более 100 мкм. Также нестабильность эмульсии приводит, в случае с 40об% ТКФ, к быстрому расслоению системы и в результате получаются плотные керамические материалы без дополнительной моды пор (рис.2.3), что подтверждается высокими значениями предела прочности при сжатии (рис.2.3) керамических материалов полученных с использованием эмульсий с 0.05вес% эмульгатора. Рис. 2.2 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 30 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Рис. 2.3 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 40 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Увеличение количества дисперсной фазы до 80об% не позволяет получить стабильные эмульсии, что приводит к моментальному расслоению после перемешивания. В результате керамические материалы, полученные из данных эмульсий, представляют собой разделенные в объеме плотные керамические части (рис.2.4). Рис. 2.4 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 80 об% парафинового масла, 30 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Использование 60 и 70 об% парафинового масла в эмульсиях позволяет воспроизводимо получать керамические материалы с небольшим средним размером пор (менее 100 мкм). Использование эмульсий с содержанием эмульгатора 0.15вес% приводит к получению керамических материалов с бимодальным распределением пор (рис.2.5). При этом механические характеристики для керамических образцов, полученных из эмульсий с 60 и 70 об% парафинового масла, имеют такую же тенденцию к снижению при уменьшении среднего размера пор (рис.2.5-2.6). Рис. 2.5 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 70 об% парафинового масла, 30 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Рис. 2.6 Зависимость предела прочности при одноосном сжатии для керамических образцов от количества эмульгатора использованного для получения фотополимеризуемой эмульсии, содержащей 60 об% парафинового масла, 30 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Микрофотографии исследованной керамики, полученной из фототверждаемых эмульсий с различным содержанием эмульгатора. Композитные материалы, полученные из фотоотверждаемых эмульсий, также представляют интерес в качестве одного их компонентов сложного градиентного материала с вариацией механических характеристик. Были получены композитные материалы из эмульсий с содержанием 30 об% ТКФ и 50 об% масла. После получения из образцов было удалено масло путем выдерживания в гексане в течение 30 минут и трехкратном смене раствора гексана для полного удаления масла и постоянной массы. Рис. 2.7 Микрофотография композитного материала, полученной из фототверждаемой эмульсии, содержащей 50 об% парафинового масла, 30 об% частиц ТКФ в дисперсионной среде на основе воды и смеси мономеров ПЭГДА:ГЕМА 1:1. Полученные материалы демонстрируют уменьшение модуля Юнга в зависимости от увеличения количества эмульгатора, а то есть уменьшению среднего размера пор в образцах, от 7 до 0.3 МПа для 0.05 и 0.25 вес% эмульгатора, соответственно. Данные значения модуля Юнга соответствуют диапазону значений эластичности материалов для направления дифференцировки клеток в хрящевую или соединительную (связки) ткани и в дальнейшем это может быть использовано для создания градиентного по своим механическим и химическим характеристикам материала. Вывод по задаче Изучены механические характеристики градиентных макропористых керамических материалов на основе β-Ca3(PO4)2, полученных методом стереолитографической 3D-печати. Показаны возможности использования фотоотверждаемых эмульсий для получения керамических материалов пористостью более 80%, а также возможность регулирования распределения пор по размерам в керамических материалах и их механические характеристики. Получены градиентные керамические материалы с заданным размером пор с использованием трехмерной печати фотоотверждаемых эмульсий на основе трикальциевого фосфата. Описано влияние содержания эмульгатора на средний размер пор в керамическом каркасе заданной архитектуры. Изучено влияние пористости, среднего размера пор и архитектуры трехмерной конструкции на прочностные характеристики макропористых керамических материалов. 3. Продолжение исследования биологических свойств полученных материалов для определения его биосовместимости и потенциального влияния на ключевые процессы репарации и регенерации Для создания многоуровневого градиентного материала необходимо быть уверенным в использовании биосовместимых материалов без цитотоксического эффекта. Керамические материалы на основе ТКФ не оказывают негативного эффекта на клетки, в тоже время в литературе продемонстрированы противоположные результаты по биосовместимости материалов на основе ПЭГДА. Для исследования были получены гидрогели с различным содержанием ПЭГДА 10, 30 и 100%. Было апробировано два варианта стерилизации гелей: 1) выдерживание гелей в этаноловом спирте в течение 30 минут с дальнейшей промывкой гелей от спирта PBS и 2) обработка гелей с использованием УФ-излучения в течение 30 минут с каждой стороны. Далее гели помещались в среду для культивирования клеток ДМЕМ (ПанЭко) без антибиотика с 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС). Через 24 и 48 часов гели смотрели на содержание заростов (бактериальные и грибные). Заросты не были обнаружены при использовании данных методик стерилизации, что позволяет варьировать условия стерилизации в зависимости от условий использования данных гелей. Различные образцы гелей в виде дисков помещали в 6-луночный планшет для культивирования клеток, предварительно дно которого покрывали агарозой для избежания адгезии клеток к пластику. К гелям добавляли суспензию дермальных фибробластов человека из рассчета на 1 лунку планшета 30 тыс клеток в 1,5 мл среды ДМЕМ с низкой глюкозой с 7% ФБС (Gibco, ThermoFisher scientific), 1% пенициллина и стрептомицина (Gibco, Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX и пирувата (Gibco). Дермальные фибробласты человека (human dermal fibroblasts, HDF) были получены из клеточной коллекции биобанка Института регенеративной медицины МНОЦ МГУ имени М.В. Ломоносова. Было показано, что фибробласты не адгезируют к поверхности гелей. При концентрации ПЭГДА в гелях 10% клетки формируют стабильные сфероиды (Рис.3.1, А), которые не разрушаются со временем. В целом такая концентрация не показала какого-либо токсического влияния на клетки. При концентрации ПЭГДА 30% сфероиды также формировались, но через сутки начинали разрушаться (Рис.3.1, Б). На гелях со 100% ПЭГДА клетки не выживали (Рис.3.1, В). Рис. 3.1. Фибробласты на гелях на основе воды с разной концентрацией ПЭГДА через 24 часа: А. 10%, Б. 30%, В. 100%. Фотографии получены на инвертированном световом микроскопе (Leica). Шкала 100 мкм. ПЭГДА в составе гелей гидролизуется с выделение в культуральной среде, при высоких содержания ПЭГДА в составе гелей буферной емкости культуральной среды не хватает и рН среды падает, в связи с чем в среде с образцами, содержащими ПЭГДА более 10%, меняются благоприятные условия для жизнеспособности клеток, в следствие чего клетки могут погибать. Использование фибробластов также приводит к образованию сфероидов на поверхности полученных гидрогелевых образцов на основе 10% ПЭГДА (Рис.3.2). Повышение количества ПЭГДА до 30% приводит к гибели клеток в исследовании (Рис. 3.3). Рис. 3.2. Фибробласты, посажанные на гели на основе PBS с 10% содержанием ПЭГДА частично формировали сфероиды, частично погибали. Половина сфероидов деградировало со временем. Рис. 3.3. Фибробласты, посажанные на гели на основе PBS с А. 30% и Б. 100% содержанием ПЭГДА: в обоих случаях клетки не адгезируют и погибают. Для увеличения числа прикрепившихся клеток были апробированы макропористые гидрогелевые образцы. Увеличение площади поверхности положительно повлияло на поведение клеток, однако избыточное содержание ПЭГДА в образцах все равно приводит к гибели клеток. Рис. 3.4. Фибробласты на гелях с порами различного диаметра: А. с 10% ПЭГДА, клетки преимущественно живы, Б. с 10% ПЭГДА, образец с клетками окрашен ядерным красителем Hoechst (фотография получена с помощью Leica DM600Β, снабженного камерой Leica DFC 420Х (Leica Microsystems GmbH)), и В. 100 % ПЭГДА (видны поры между которыми плавает клеточный дебрис). При использовании макропористых образцов на основе 10% ПЭГДА было продемонстрирована частичная вытянутая морфология клеток и их жизнеспособность. Рис. 3.5. Фибробласты человека, вошедшие в поры геля (10% ПЭГДА): наблюдается их жизнеспособность и частично вытянутая морфология, что характерно для адгезированных клеток. А. через 24 часа после посадки, Б. через 7 дней. В качестве защитного слоя на полученных гидрогелях было предложено использование альгината для увеличения жизнеспособности фибробластов. Полученные образцы гидрогелей погружали в раствор 0.1 М CaCl2 на 30 минут. Далее диски без предварительного высушивания окунали в раствор альгината на 30 секунд, давали стечь излишкам раствора альгината и затем дополнительно помещали в 0.1 М раствор хлорида кальция на 30 минут для завершения полимеризации ионной (образуемой альгинатом и ионами Ca2+) гидрогелевой сетки. Таким образом, получали гидрогелевые покрытия толщиной до 0.3 мм. Отмывку гидрогелевого слоя от непрореагировавших мономеров проводили путем выдерживания образцов в 0.1 М растворе CaCl2 в течение 40 часов. Использование альгинатного геля не привело к изменению свойств гелей. Рис. 3.6. Фибробласты на гелях, покрытых альгинатом. А. 10% ПЕГДА формируются сфероиды, клетки преимущественно живы. Б. 30% ПЕГДА, формируются сфероиды, которые со временем дегенерируют, и В. 30% ПЕГДА, клеточный дебрис. Г. 100% ПЕГДА, клеточный дебрис. Вывод по задаче Таким образом, согласно полученным результатам наиболее оптимальным содержание ПЭГДА не более 10% с точки зрения жизнеспособности клеток. Дальнейшие этапы изучения дифференцировки клеток на поверхности материалов с различной жесткостью и химического состава на основе ПЭГДА будут проведены с использованием данных полимерных концентраций для создания градиентных материалов. 4. Изучение поведения материала и его биологических свойств (остеокондуктивность, биорезорбируемость, остеоиндуктивность) при внедрении образцов материала в дефект костной ткани лабораторных животных - гистологические исследования. Работа получила одобрение Комиссии по биоэтике (одобрено на заседании 11.02.2021 г., регистрационный номер 123-ж). Исследование проводили в соответствии с "Руководством по содержанию и уходу за лабораторными животными" (Межгосударственный стандарт ГОСТ 33216-2014 «Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами»). Исследование выполнено на 90 самцах крыс Rattus norvegicus линии Wistar в возрасте 20-22 недели из ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН (Институт цитологии и генетики СО РАН). Животные содержались в виварии по 3 особи в клетке. Доступ крыс к воде и корму был не ограничен. Для введения животных в состояние наркоза внутрибрюшинно вводили препараты «Золетил 50» (Zoletil, Virbac Sante Animale», Франция) и «Ксила» (Xyla, «Interchemie werken «De Adelaar» B.V», Нидерланды) в дозах соответственно 6,25/6,25 мг/кг и 4 мг/кг. Далее в операционной после очистки зоны операции от шести в положении крысы на правом боку на столе с соблюдением правил асептики и антисептики разрезали кожу в проекции левой бедренной кости при общей длине разреза 5,0 см. Далее по межмышечным пространствам остро и тупо выделяли бедренную кость. После осуществления доступа в средней трети диафиза бедренной кости по передней поверхности конической фрезой диаметром 2,3 мм с помощью аппарата Marathon-N2 (Saeyang Microtech, Республика Корея) формировали дефект кости длиной 7-8 мм и радиусом 4-5 мм. Животные были распределены на 4 группы по 16 особей в каждой и одну контрольную группу с 8 особями. У 8 животных в контрольной группе «Хронос» дефект заполняли подготовленным материалом chronOS® (Johnson&Johnson) в виде полуцилиндрического блока. В качестве исходной архитектуры использовали материалы цилиндрической формы- группа «Цилиндры». В этом материале общая пористость по объему составляет около 55%, размер основных пор — 300 мкм, а переходы между ними — 50 мкм, при этом поры располагались без четкой организации. Для формирования материалов с заданной архитектурой типа «Гироид» была выбрана стереолитографическая ЗD-печать с помощью DLP-принтера Ember (Autodesk, США), а трехмерные модели структур были созданы с помощью компьютерных программ Monolith (Autodesk, США) и Fusion 360 (Autodesk, США). Общая пористость созданного материала (материал «Гироид») по объему составляет около 70%, основные каналы имеют размеры 1250 мкм и переходы между ними 750 мкм, что обеспечивает максимальную проницаемость таких архитектур. Использование фотоотверждаемых эмульсий позволяет задавать дополнительную моду пор в заданном керамическом 3D-каркасе. В рамках этапа 2022-2023 гг. были исследованы материалы с дополнительной модой пор со средним размером 50 (материал «Гироид-50 мкм») и 150 мкм (материал «Гироид-150 мкм»). Общая пористость созданных материалов по объему составляет около 85%. Рисунок 4.1 – Ход операции: вид операционной раны с дефектом, заполненным имплантированным материалом (слева, указан стрелкой), и фиксация кости полиэфирэфиркетоновой пластиной и титановыми винтами (справа, пластина указана стрелкой) Для минимизации риска перелома бедренной кости после операции зону дефекта укрепляли полиэфирэфиркетоновой пластиной размером 30*4*4,5 мм. Пластину фиксировали переднебоковой поверхности бедренной кости 6 титановыми винтами длиной 10 мм и диаметром 1,2 мм (Конмет, Россия). После имплантации материала и пластины послеоперационную рану послойно зашивали. Повязки не использовали, также не применяли никакие методы иммобилизации. Средняя длительность операции составила 28 ± 7 мин (от 18 мин до 32 мин). Интраоперационная кровопотеря была не больше 2,0 мл. Через 3 и 6 месяцев после имплантации материалов крыс выводили из эксперимента с использованием СО2-камеры, после чего отбирали левую бедренную кость для гистологического исследования. Фиксацию костей осуществляли в 10%-ном нейтральном растворе забуференного формальдегида в течение 24 – 48 часов, после чего кости погружали в нейтральный раствор трилона Б 25% комнатной температуры на аппарате Orbital Shaker OS20 biosan с целью декальцинации на 3 недели. После выполнения декальцинации по стандартной методике пластину откручивали, производили промывку образцов в дистиллированной воде, гистологическую проводку и заливку. Далее изготовляли поперечные срезы парафиновых блоков толщиной 3-4 мкм, проводили их окраску гематоксилином и эозином. Для оценки результатов проводили слепой гистометрический анализ. Изображения гистологических препаратов получали с помощью светового микроскопа Leica DM LB2 (Carl Zeiss) и цифровой камеры AxioCam ICc3 (Carl Zeiss). Оцифрованные изображения переводили в формат JPEG. Гистометрическую оценку проводили с помощью программы Fiji на увеличении 10 раз с измерением площади новообразованной костной ткани в лакунах материалов в мм2. Новообразованную костную ткань определяли по характерной структуре и окраске. Далее площадь новообразованной костной ткани выражали в процентах к площади среза образца. Для каждого образца проводили вычисление на 2 препаратах, всего для каждой группы получалось 16 значений на каждый срок наблюдения. Результаты каждой группы представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения. Для установления статистической достоверности различий использовали вычисление непараметрического критерия Kruskal-Wallis с помощью программы StatSoft Statistica 10.0 (2011) отдельно для групп со сроком вывода 3 месяца и со сроком вывода 6 месяцев. В ходе проведения эксперимента от осложнений, связанных с наркозом, погибло 2 животных. Остальные животные перенесли оперативное вмешательство и дожили до вывода из эксперимента без особенностей. В процессе наблюдения за животными масса тела увеличивалась. Средняя масса крыс на моменте ввода в эксперимент была 488 ± 54 г, на момент вывода через 3 месяца – 611 ± 32 г, через 6 месяцев – 653 ± 56 г. Значимая разница между группами по массе и её приросту не зафиксирована (Таблица 4.1). В процессе наблюдения за животными в послеоперационном периоде изменений поведения зафиксировано не было. Все крысы перемещались на четырех лапах без попыток ограничивать нагрузку. Гнойных осложнений зафиксировано не было, раны заживали первичным натяжением, волосяной покров восстановился полностью. При отборе образцов для гистологического исследования при осмотре зоны имплантации не было обнаружено признаков нагноения, повреждения или миграции фиксаторов, переломов кости. Результаты, полученные при анализе гистологических препаратов в группах исследования, представлены ниже. Таблица 4.1 – Масса животных в группах на момент проведения операции и вывода из эксперимента Группа Масса на момент включения в эксперимент Масса на момент вывода из эксперимента Через 3 месяца Через 6 месяцев Хронос 416 ± 21 585 ± 70 636 ± 55 «Цилиндры» 460 ± 38 606 ± 59 649 ± 71 «Гироид» 453 ± 42 616 ± 45 645 ± 83 «Гироид-50 мкм» 513 ± 26 620 ± 34 709 ± 72 «Гироид-150 мкм» 507 ± 36 589 ± 40 692 ± 74 В группе «Хронос» через 3 месяца на срезах четко различимы границы материала в зоне дефекта без тенденции к резорбции (Рисунок 4.2). Поры материала частично выполнены костной тканью, при этом процент заполнения на срезах составляет в среднем 54 ± 7%. Отмечен рост кости вокруг имплантата, в связи с чем он оказывается окруженным со всех сторон дефекта костной тканью. Со стороны мягких тканей на срезах прослеживаются мышечные волокна и соединительная ткань. В группе «Хронос» через 6 месяца материал прослеживается фрагментарно, с утраченной структурой пор, при этом пространство между участками имплантата заполнены зрелой костной тканью, площадь которой составляет в среднем 73 ± 5% (Рисунок 4.3). Рисунок 4.2 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяца после имплантации материала chronOS®, окраска гематоксилин-эозин, х10 Рисунок 4.3 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 6 месяца после имплантации материала chronOS®, окраска гематоксилин-эозин, х10 В группе «Гироид» через 3 месяца в зоне дефекта отмечаются зоны сохраненной структуры материала, представленные серыми зонами с единичными клетками по периметру и крупными порами на месте резорбции материала. В имплантат врастает со стороны мягких тканей жировая и соединительная ткань, а со стороны кости – компактная костная ткань. Поры материала выполнены соединительной тканью с единичными врастаниями костной ткани. Со стороны костномозгового канала материал отграничен компактной костной тканью (Рисунок 4.4). Рисунок 4.4 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяца после имплантации материала Гироид, окраска гематоксилин-эозин, х10 Группа «Гироид» через 6 месяцев в зоне дефекта можно различить крупноячеистую сеть пустот, оставшуюся на месте материала после декальцинации. Кроме того, отмечаются зоны резорбции материала от краев к центру по форме, напоминающей языки, которые заполнены зрелой костной тканью, врастающей из окружающей кости (Рисунок 4.5). По всей площади среза отмечается прорастание костной ткани мелкими островками до 0,08 мм в диаметре, суммарная площадь островков составляет в среднем 29% от площади дефекта (Рисунок 4.6). Рисунок 4.5 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 6 месяца после имплантации материала Гироид, окраска гематоксилин-эозин, х10 Рисунок 4.6 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 6 месяца после имплантации материала Гироид, окраска гематоксилин-эозин, х10 В группе «Цилиндры» через 3 месяца на гистологических срезах в зоне дефекта определяется прямоугольное образование серого цвета, по структуре соответствующее имплантированному материалу. В области имплантата есть участки округлой формы, лишенные заполнения, что соответствует местам резорбции материала. В порах имплантата выявляются участки врастания костной ткани (Рисунок 4.7), общая площадь которых составляет в среднем 11% от площади материала. Рисунок 4.7 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяца после имплантации материала «Цилиндры», окраска гематоксилин-эозин, х10 В группе «Цилиндры» через 6 месяцев на гистологических срезах в зоне дефекта определяется прямоугольное образование серого цвета, по структуре соответствующее имплантированному материалу. В области имплантата есть участки округлой формы, лишенные заполнения, что соответствует местам резорбции материала, которых значительно больше в половине, примыкающей к мягким тканям, прилежащим к зоне дефекта. Отмечена утрата контуров имплантата четкости, отмечается их сглаженность на фоне резорбции, однако языкообразных вдавлений не отмечается. В порах имплантата выявляются участки врастания костной ткани (Рисунок 4.8), максимальное количество которых отмечается в области костнозамещающего материала, примыкающего к костномозговому каналу. Общая их площадь составила 11%. В динамике по сравнению с 3 месяцами можно отметить увеличение прорастания кости в поры материала, что свидетельствует об остеокондуктивных свойствах данной структуры. Рисунок 4.8 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 6 месяца после имплантации материала «Цилиндры», окраска гематоксилин-эозин, х10 В группе «Гироид-150 мкм» через 3 месяца отмечено врастание кости в поры между элементами материала, повторяющее архитектуру имплантата. В зоне, прилегающей к костномозговому каналу, отмечена массивная резорбция материала и замещение его зрелой костной тканью (Рисунок 4.9). Общая площадь костной ткани, вросшей в толщу материала, составила в среднем 39%. Рисунок 4.9 - Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяца после имплантации материала Гироид-150 мкм, окраска гематоксилин-эозин, х10 В группе «Гироид-150 мкм» через 6 месяцев отмечено врастание кости в поры материала, однако резорбции материала не отмечается (Рисунок 4.10), поэтому статистически значимого различия в площади новообразованной костной ткани по сравнению с образцами через 3 месяца не выявлено. В группе «Гироид-50 мкм» через 3 месяца четко прослеживается имплантированный материал с врастанием со стороны костномозгового канала островков костной ткани (Рисунок 4.11). Со стороны дефекта отмечено врастание в материал соединительной ткани. Площадь новообразованной костной ткани составила 17 ± 7%. Рисунок 4.10 – Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 6 месяцев после имплантации материала Гироид-150 мкм, окраска гематоксилин-эозин, х10 Рисунок 4.11 – Гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяцев после имплантации материала «Гироид-50 мкм», окраска гематоксилин-эозин, х10. В группе «Гироид-50 мкм» через 6 месяцев в динамике отмечается увеличение числа и площади островков кости в толще имплантата, а также появление зон резорбции материала по всей толще в виде округлых пустот (Рисунок 4.12). Со стороны костномозгового канала отмечается обрастание имплантата костной тканью, соответствующей по структуре кортикальной кости. Суммарные данные по площади новообразованной костной ткани представлены в Таблице 4.2. В группе «Хронос» отмечено статистически значимо большая площадь костной ткани, заполняющей материал, как на сроке 3, так и на сроке 6 месяцев после операции. Также статистически значимо больше площадь новообразованной костной ткани по сравнению с остальными группами исследования в группе «Гироид-150 мкм». При этом следует отметить, что во всех группах наблюдается прорастание кости внутрь материала, что свидетельствует о выраженных остеокондуктивных свойствах всех исследуемых материалов. Таблица 4.2 – Площадь новообразованной костной ткани в зоне дефекта в группах исследования, проценты Группа Площадь новообразованной костной ткани на момент вывода из эксперимента, % Через 3 месяца Через 6 месяцев Хронос 54 ± 7 73 ± 5 «Цилиндры» 11 ± 4 31 ± 6 «Гироид» 14 ± 5 29 ± 4 «Гироид-50 мкм» 17 ± 7 27 ± 8 «Гироид-150 мкм» 39 ± 5 41 ± 7 Вывод по задаче Результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что добавление у керамических материалов на основании трикальциевого фосфата в структуру гироида дополнительной моды пор до 150 мкм в диаметре позволяет статистически значимо увеличить количество новообразованной костной ткани и улучшить остеокондуктивные свойства материала. Все работы выполнены в срок и в полном объеме. Получены новые фундаментальные и прикладные результаты, способствующие решению задач из стратегий НТР РФ.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".