![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Целью проекта является создание универсальной панели антигенов для иммунологических средств борьбы с коронавирусами. Для достижения поставленной цели планируется решить следующие задачи: 1. На основе анализа информации, полученной из международных баз данных UniProt и GenBank по полноразмерным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям структурных белков различных коронавирусов, а также литературных данных провести поиск и отобрать антигенные детерминанты для различных коронавирусов (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-подобных вирусов летучих мышей, цивет, панголинов и др.), в том числе консервативные последовательности для различных видов коронавирусов. При выборе антигенных детерминант для включения их нуклеотидных последовательностей в генно-инженерные конструкции антигенов учитывать литературные данные об эпитопах, антитела к которым могут вызывать антитело-зависимое усиление инфекции. 2. Создать оригинальные генно-инженерные конструкции различного дизайна. Оптимизировать нуклеотидные последовательности клонированных антигенов для эффективной экспрессии целевых белков в клетках E. coli. 3. Продемонстрировать возможность получения и очистки рекомбинантных белков-антигенов в препаративных количествах в бактериальных клетках. 4. С использованием поликлональных антисывороток к вирионам и/или к полноразмерному Спайк (S) белку коронавирусов исследовать антигенную специфичность полученных рекомбинантых белков.
The world's attention is riveted on the global COVID-19 epidemic. Meanwhile, this is at least the third outbreak of coronavirus infection in the 21st century alone. Despite the "rehearsals" that took place, mankind was not ready for a new epidemic. The spread of the new coronavirus - SARS-CoV-2 – is not comparable to previous cases. As well as the causative agents of two other coronavirus infections - SARS-CoV and MERS-CoV, the new SARS-CoV-2 virus belongs to the genus Betacoronavirus and has 96% homology (by complete nucleotide sequences) with SARS-like CoV RaTG13 of bat origin. Our project is aimed at developing and creating a universal panel of antigens as immunological means to fight various coronaviruses. The main antigen of coronaviruses is the surface glycoprotein S (spike) - one of the structural proteins of the virion, which plays a key role in binding of the virus to receptors and entering the host cell. However, antibodies to certain S protein epitopes cause an antibody-dependent enhancement of viral infection (ADE). Inactivated SARS-CoV vaccines, as well as subunit vaccines based on the full-size S-protein, induced ADE and lung pathology, which stopped their further development. This project provides for the creation of recombinant antigens, bearing in mind the possible risks of disease complications caused by the effect of antibody-dependent enhancement of viral infection (antibody-dependent enhancement, ADE). Taking into account the high structural similarity and 76% homology in the SARS-CoV and SARS-CoV-2 amino acid sequences, we believe that it is possible to predict the antigenic properties of SARS-CoV-2 based on the existing information about SARS-CoV and other betacoronaviruses. During the implementation of the project, experimental data on SARS-CoV-2 epitopes that may appear in the near future need to be considered. It is planned to obtain at least 8 genetic engineering constructs of various designs for the expression of recombinant antigens in bacterial cells. Currently, recombinant proteins obtained in heterologous systems, including E. coli, are widely employed in pharmacological preparations. Antigens will contain protective epitopes of SARS-CoV-2 and MERS-CoV S protein, as well as antigens of other structural proteins that are similar to SARS-CoV, SARS-CoV-2 and various SARS-like CoVs from bats, which are the natural reservoir of the virus. The practical use of genetic engineering constructs is possible only if they are effectively expressed in producing cells. It is proposed to use modern approaches to optimize the heterologous expression of target proteins in E. coli cells, including those based on optimization of the local translation rate. The principal point in the project will be the study of the antigenic specificity of the obtained recombinant proteins with polyvalent sera against coronaviruses, taking into consideration that the expression system is heterologous. The created panel of antigens can form the basis for the development of a universal multivalent vaccine against betacoronaviruses using various adjuvant platforms. Such a vaccine may also be useful in controlling future SARS-like coronavirus infections. The obtained antigens can be employed to diagnose the presence of antibodies to SARS-CoV-2 in the blood by enzyme-linked immunosorbent assay as well.
Коронавирус SARS-CoV-2 был выявлен в человеческой популяции сравнительно недавно и характеризуется широким распространением и весьма значительным эпидемическим потенциалом. Задача разработки эффективной вакцины и средств иммунодиагностики осложняется практически полным отсутствием достоверных данных об антигенном составе его структурных белков и механизме взаимодействия SARS-CoV-2 с иммунной системой. Аналогии с возбудителем атипичной пневмонии 2002-2003 годов вирусом SARS-CoV могут быть только приблизительными, учитывая уровень гомологии полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномных РНК (79,6%) и весьма ограниченную эффективность взаимодействия антител против SARS-CoV с новым возбудителем. Тем не менее, в аминокислотных последовательностях вирионных белков SARS-подобных бетакоронавирусов присутствуют высококонсервативные участки; проект предусматривает экспрессию данных последовательностей в оптимизированной гетерологической системе с последующей иммунологической характеристикой полученных рекомбинантных антигенов. На первом этапе реализации проекта ожидается получить следующие результаты: - Будет проведен анализ научной литературы, направленный на изучение антигенного состава структурных белков различных бетакоронавирусов, в том числе возбудителя глобальной пандемии SARS-CoV-2. - . На основе информации, полученной из международных баз данных UniProt и GenBank, содержащих нуклеотидные и аминокислотные последовательности структурных белков различных коронавирусов с учетом литературных данных будет проведен поиск и отобраны антигенные детерминанты, в том числе консервативные последовательности, для различных бетакоронавирусов. При выборе подобных детерминант будут использованы существующие публикации об эпитопах, антитела к которым могут вызывать антитело-зависимое усиление инфекции. - Будут сконструированы оригинальные генно-инженерные векторы различного дизайна. Предполагается использование "обратной трансляции" in silico с последующей оптимизацией синтетической нуклеотидной последовательности для экспрессии в E. сoli с учетом средней частоты использования кодонов и влияния различных негативных cis-элементов (криптических промоторов транскрипции и последовательностей Шайна-Дальгарно), а также другие современные подходы к оптимизации гетерологической экспрессии целевых белков в бактериальных клетках, основанные на оптимизации локальной скорости трансляции, важной для корректного сворачивания рекомбинантных белков. - Будут получены генно-инженерные конструкции, в составе которых будут присутствовать консервативные последовательности протективных эпитопов структурных белков бетакоронавирусов. Будут созданы не менее 8 генно-инженерных конструкций для получения панели рекомбинантных антигенов, потенциально способных обеспечить иммунную защиту против ряда коронавируов: SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2 и различных видов SARS-подобных CoV летучих мышей, которые являются природным резервуаром вируса. - Будет продемонстрирована возможность препаративной экспрессии полученных генно-инженерных конструкций в клетках E. сoli. Создание панели антигенов широкого спектра действия для иммунологических средств борьбы с коронавирусами и диагностики на антитела против них представляет собой уникальный подход, предложенный авторским коллективом проекта, и полностью соответствует современному уровню разработок в данной области.
У коллектива имеется необходимый задел для успешной реализации проекта. Благодаря проведению собственных актуальных исследований по заявленной теме, у научной группы имеется уникальная возможность приступить к практической реализации проекта, сократив до минимума все подготовительные этапы. Коллектив кафедр вирусологии и молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова обладает большим опытом работы по созданию рекомбинантных антигенов, в том числе патогенов человека и животных, а также их эффективной экспрессии в клетках бактерий и растений. У авторов проекта накоплен значительный опыт проведения подобного вида исследований на всех этапах от создания генно-инженерных конструкций и выделения рекомбинантных белков в препаративных количествах до проверки полученных препаратов на иммуногенность и токсичность. В частности, коллективом авторов сконструирован ряд оригинальных генно-инженерных векторов различного дизайна для экспрессии в E. coli рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминаниы/эпитопы ротавируса А человека. Также авторский коллектив уже успешно разработал кандидатную рекомбинантную вакцину против краснухи, в рамках чего был получен патент РФ на создание антигена для вакцины против этого заболевания (Патент РФ № 2709328 от 17.12.2019); проект был доведен до стадии завершенных доклинических испытаний (государственный контракт от «22» августа 2014 г. № 14411.2049999.19.069). Оригинальность проведенных исследований подтверждается публикациями результатов в высокорейтинговых международных журналах. Авторами проекта создано несколько генно-инженерных конструкций для экспрессии протективного антигена Bacillus anthraсis (возбудителя сибирской язвы) и его мутантных форм в клетках E. coli (грант РНФ, номер 18-14-00044).
Получение панели рекомбинантных антигенов S-белка коронавирусов для создания рекомбинантных вакцин против коронавирусов
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 21 июля 2020 г.-16 июня 2021 г. | Научные основы разработки универсальной панели антигенов для иммунологических средств борьбы с коронавирусами |
Результаты этапа: Полученные за отчетный период важнейшие научные результаты (с описанием их оригинальности и уникальности, и их соответствие задачам темы исследований) На первом этапе реализации проекта был проведен анализ научной литературы, направленный на изучение антигенного состава структурных белков различных бетакоронавирусов, в том числе возбудителя глобальной пандемии SARS-CoV-2. С помощью информации, полученной из международных баз данных UniProt и GenBank, включающих полноразмерные нуклеотидные и аминокислотные последовательности структурных белков различных коронавирусов, был выполнен поиск и отобраны антигенные детерминанты, в том числе консервативные последовательности, для различных бетакоронавирусов. При выборе подобных детерминант были использованы существующие публикации об эпитопах, антитела к которым могут вызывать антитело-зависимое усиление инфекции. В качестве антигенных детерминант отобраны: 1. Рецептор-связывающий домен (RBD) SARS-CoV-2 и его производные 2. Рецептор-связывающий домен (RBD) MERS-CoV 3. Консервативные последовательности субъединицы S2 SARS-CoV и SARS-CoV-2 4. Фрагменты вариабельной области S-белка, расположенные между RBD и сайтом протеолиза SARS-CoV-2 5. Консервативные последовательности N-белка SARS-CoV-2 1. Рецептор-связывающий домен (RBD) SARS-CoV-2 и его производные Предварительный анализ литературы показал очевидную недостаточность информации о рецептор-связывающем домене (receptor-binding domain, RBD) коронавируса SARS-CoV-2, входящем в состав поверхностного гликопротеина S (spike) и обеспечивающего взаимодействие с клеточным рецептором ACE2 (ангиотензинпревращающий фермент 2) (Wrapp et al., 2020). При этом следует отметить, что аналогичный домен родственного коронавируса SARS-CoV (возбудитель «атипичной пневмонии 2002-2003 годов) связывается с тем же рецептором (Li et al., 2003), но изучен гораздо лучше. Например, пептидное картирование и последующий компьютерный анализ подтвердили высокий иммуногенный потенциал RBD (Tarnovitski et al., 2006). Удалось выделить из мышей, иммунизированных вирусом SARS-CoV, несколько моноклональных антител, специфичных к линейным и конформационным эпитопам RBD (He et al., 2006). Некоторые из них блокировали взаимодействие RBD с рецептором, но эффективность подобной нейтрализации существенным образом зависела от различных точечных мутаций (He et al., 2006). Внутри RBD был картирован нейтрализующий SARS-CoV эпитоп 471-503 (Wang et al., 2016), подтвержденный в опытах на обезьянах. Для филогенетического анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей RBD использовали предварительное выравнивание с помощью программы ClustalW v.2.1, а также методы присоединения соседей (neighbor joining) и максимального правдоподобия (maximum likelihood, версия PhyML 3.0; Guindon et al., 2010). Оба метода показали, что данная область относится к числу «вариабельных» и позволили предположить, что использование RBD SARS-CoV-2 в разрабатываемой панели антигенов может обеспечить эффективный иммунный ответ не только против «исходного» SARS-CoV-2 но и, вероятно, некоторых близкородственных ему вирусов летучих мышей Rhinolofus affinis или Rhinolofus sinicus (например, RaTG13), группирующихся совместно с SARS-CoV-2 (100% вероятности, согласно данным бутстрэп-анализа) и потенциально способных служить источником новых «вспышек» коронавирусных инфекций человека. Этот же вывод относится и к появлению возможных новых изолятов и штаммов SARS-CoV-2, содержащих одну или несколько точечных мутаций в RBD-домене. Напротив, RBD бетакоронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV (возбудитель «ближневосточного респираторного синдрома» 2012 года) образовывали клады, отличные как от SARS-CoV-2, так и друг от друга (значения бутстрэп-анализа – 100%). Таким образом, был сделан вывод о том, что для создания эффективной панели антигенов широкого спектра действия «базовый» RBD SARS-CoV-2 должен быть дополнен консервативными эпитопами из других областей S-белка, обеспечивающих защитный иммунный ответ как против SARS-CoV так и, предположительно, против SARS-CoV-2. Поскольку аминокислотная последовательность S-белка MERS-CoV имеет незначительный процент гомологии (29,4 % по аминокислотным последовательностям против SARS-CoV-2) с упомянутыми бетакоронавирусами, а его RBD взаимодействует с другим клеточным рецептором (дипептидилпептидаза-4; DPP4, он же CD26; Lu et al., 2013), было принято решение создать отдельный антиген для MERS-CoV (см. ниже). В качестве дополнения к RBD SARS-CoV-2, исходя из опубликованных ранее результатов, были выбраны консервативные эпитопы из субъединицы S2 «зрелого» варианта S-белка SARS-CoV, образующегося при протеолизе его полноразмерного предшественника. Первый из этих эпитопов (EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYI), названный нами epS2-a был экспериментально подтвержден в работе Wang et al. (2016). Антитела, специфичные к нему, были выделены из сыворотки крови людей, переболевших «атипичной пневмонией»; они связывались с вирионами SARS-CoV, а также блокировали инфекцию в культуре клеток Vero E6 и в опытах на обезьянах (макаки-резус). Он имеет протяженность 29 аминокислотных остатков и расположен в C-концевой области субъединицы S2 (координаты 1182-1210). Последовательность второго эпитопа (QLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVD), получившего название epS2-b, была образована при «объединении» экспериментально подтвержденных T-клеточного и В-клеточного эпитопов SARS-CoV, упоминаемых в базе данных NIAID Virus Pathogen Database and Analysis Resource (ViPR; Pickett et al., 2012; Ahmed et al., 2020) (https://www.viprbrc.org/). Она состоит из 31 аминокислотного остатка (а.о.) и также расположена в C-концевой области субъединицы S2 (координаты 1011-1041). С точки зрения основной поставленной задачи (получения панели антигенов широкого спектра действия), важно упомянуть, что при сравнении аминокислотных последовательностей обоих эпитопов уровень гомологии достигает 100% у SARS-CoV (GenBank AAS10463, ADC35483), SARS-CoV-2, коронавирусов летучих мышей Rhinolofus affinis (в том числе ближайшего «родственника» SARS-CoV-2 - RaTG13 (Genbank QHR63300) и пальмовых цивет (ABF68956). Ранее для SARS-CoV был подробно исследован эпитоп 597-603 (LYKDVNC), обеспечивавший антитело-зависимое усиление инфекции (ADE) при иммунизации обезьян препаратом инактивированного SARS-CoV (Wang et al., 2016). Следует отметить, что в последовательности S-белка SARS-CoV-2 присутствует аналогичный (100% гомологии) участок 611-617 (в координатах референсной последовательности SARS-CoV-2). В качестве такого изолята здесь и далее был использован Wuhan-Hu-1 (GenBank YP_009724390.1, Ухань, Китай, декабрь 2019 года, 1273 аминокислотных остатка для S-белка). Несмотря на то, что функционирование эпитопа ADE было продемонстрировано только в случае заражения SARS-CoV, при разработке панели антигенов упомянутый участок и фланкирующие его области были исключены из числа кандидатных последовательностей. При выполнении данной работы были получены три генно-инженерных конструкции в векторе pQE-30 (Qiagen, Германия), предназначенном для экспрессии RBD SARS-CoV-2 и его производных в клетках E. coli. Плазмида (RBD)-SARS-CoV-2 содержала последовательность, соответствующую остаткам 319-541 S-белка, клонированную по сайтам рестрикции BamHI и SalI. Дизайн конструкции предполагал возможность создания любых белков, слитых с С-концевой областью RBD и содержащих, в том числе, выбранные консервативные эпитопы epS2-a и epS2-b. Нуклеотидные последовательности, кодирующие данные эпитопы, были синтезированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице из двух частично перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих сайты рестрикции SalI и HindIII. Далее очищенный продукт ПЦР обрабатывали соответствующими рестриктазами и лигировали с базовым вектором (RBD)-SARS-CoV-2. Таким образом, были получены дополнительные экспрессионные плазмиды (RBD)-epS2-a-SARS-CoV-2 и (RBD)-epS2-b-SARS-CoV-2. Последовательности RBD SARS-CoV-2 и эпитопов epS2-a/epS2-b были подвергнуты «обратной трансляции» in silico с учетом частоты использования кодонов в E. coli. Дальнейшая оптимизация полученной нуклеотидной последовательности предусматривала увеличение вариативности триплетов, кодирующих одну и ту же аминокислоту (в случае сопоставимых значений частоты кодонов в E. coli), «мутагенез» различных cis-элементов, негативно влияющих на эффективность экспрессии в бактериальных клетках (криптические промоторы транскрипции и последовательности Шайна-Дальгарно, A/T – богатые участки, прямые повторы), а также, в случае необходимости, возникающих сайтов рестрикции, используемых при клонировании в вектор pQE-30 (Ryabchevskaya et al., 2021). В частности, при оптимизации были использованы алгоритмы IDT (https://eu.idtdna.com/CodonOpt) и GenScript (https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization). Поиск промоторов сигма54 и сигма70 проводили с помощью с помощью специальных сервисов (http://lin-group.cn/server/iPro54-PseKNC и http://server.malab.cn/70ProPred/). Анализ «первичной» нуклеотидной последовательности RBD SARS-CoV-2 выявил скрытую минимальную последовательность Шайна-Дальгарно (GAGG) в области 64-67 нуклеотидов (нт), через 6 нт после которой располагается стартовый кодон ATG. Такое расположение указанных элементов может приводить к альтернативной инициации трансляции и снижать эффективность биосинтеза целевого белка в E. coli. Помимо этого, в 3’-концевой части кодирующей последовательности выявлено два участка по пять аденинов подряд, способных приводить к сбою рамки считывания. 2. Рецептор-связывающий домен (RBD) MERS-CoV Последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса MERS-CoV соответствовала аминокислотным остаткам (а.о.) 367-606 выбранной референсной последовательности (GenBank YP_009047204, штамм HCoV-EMC, Саудовская Аравия, июнь 2012 года, 1353 а.о.; van Boheemen et al., 2012). После «обратной трансляции» и оптимизации нуклеотидной последовательности синтетический ген клонировали в вектор pQE-30 по сайтам BamHI и HindIII. Согласно алгоритму IDT, «первичная» нуклеотидная последовательность содержала два скрытых элемента Шайна-Дальгарно в положениях 1-4 и 37-41, причем в последнем случае в 6 нуклеотидах от SD располагался стартовый кодон ATG. Кроме того, в участках 115-247 и 403-483 нт были обнаружено несколько участков, являющихся криптическими промоторами для сигма-70 (с вероятностью от 90% до 99%). Анализ, предложенный алгоритмом GenScript, выявил две скрытых последовательности Шайна-Дальгарно в областях 1-4 (без близлежащих ATG) и 439-442 (ATG через 14 нуклеотидов). Первая скрытая SD-последовательность может быть убрана путем замены G3A в третьем положении кодона глутаминовой кислоты, а вторая – аналогичной заменой G на A в 441 положении. Значимые криптические промоторы для РНК-полимеразы E. coli не были обнаружены. 3. Консервативная последовательность S2 SARS-CoV и SARS-CoV-2 Были выбраны консервативные участки 950-1041 и 1157-1210 из субъединицы S2 поверхностного гликопротеина S, которые совпадают (до 100% гомологии) у SARS-CoV (GenBank AAS10463, ADC35483), SARS-CoV-2 (NC_045512), коронавирусов 4-х видов летучих мышей, включая RaTG13 (Rhinolophus affinis - QDF43830; Rhinolophus sinicus - AIA62320, Rhinolophus ferrumequinum - ATO98145, Chaerephon plicata - AGC74176), пальмовых цивет (AAV97990, AAU04664), панголинов (Manis javanica, QIA48641), а также SARS-CoV после пассирования на хорьках (AFR58714) или клеточной культуре Vero E6 (BAE93401). Первый из этих участков содержит эпитоп epS2-b, а второй - эпитоп epS2-a; последовательности этих эпитопов также были использованы при создании слитых белков на основе RBD-домена SARS-CoV-2 (см. выше). Оба участка также включали ранее предсказанные Т-клеточные и В-клеточные эпитопы, частично перекрывающиеся друг с другом (Ahmed et al., 2020; Grifoni et al., 2020). Предполагаемые антигенные области соединили гибким глицин-сериновым линкером GSAGSAAGSGEF (Waldo et al., 1999), не содержащем повторяющиеся мотивы, в том числе типичные для подобных структур (G3S), (G4S) или (G3A). Основными критериями при выборе были экспериментальная подтвержденность эпитопов и степень консервативности аминокислотной последовательности. Последовательность слитого белка (S2)-CoV также прошла процедуру «обратной трансляции». «Первичная» нуклеотидная последовательность (S2)-CoV согласно алгоритму IDT, не содержала cis-элементов, способных препятствовать эффективной трансляции, за исключением пяти аденинов в области 313-317. Согласно алгоритму GenScript, были выявлены несколько потенциально влияющих на эффективность трансляции cis-элементов. В первую очередь, к таковым относится альтернативный стартовый кодон ATG в положении 2-4, что может приводить к использованию рамки считывания +2 и образованию дипептида Met-Leu, препятствуя синтезу целевого белка. Помимо этого, нами была обнаружена скрытая последовательность Шайна-Дальгарно в положении 120-124, способная препятствовать эффективному биосинтезу белка в E. coli. После оптимизации полученной нуклеотидной последовательности синтетический ген, кодирующий (S2)-CoV, лигировали с вектором pQE-30, используя сайты BamHI и HindIII. 4. Вариабельная область S-белка, расположенная между RBD и сайтом протеолиза SARS-CoV-2 Анализ базы данных “The Immune Epitope Database and Analysis Resource” (IEDB; https://www.iedb.org/; Vita et al., 2019), проведенный для SARS-CoV и других бетакоронавирусов с использованием нескольких алгоритмов, в том числе BebiPred 2.0 (В-клеточные эпитопы; Jespersen et al., 2017) и NetMHCpan EL 4.0 (Т-клеточные эпитопы; Jurtz et al., 2017) и Discotope 2.0 (структурный анализ; Kringelum et al., 2012), выявил несколько областей S-белка, теоретически обладающих высоким иммуногенным потенциалом. В первую очередь, среди них необходимо выделить протяженный иммунодоминантный участок (510-586 в координатах SARS-CoV), а также участки 587-628, 784-803 и 870-893 (также в координатах SARS-CoV) (Grifoni et al., 2020). Данное теоретическое предсказание получило подтверждение при исследовании сывороток крови пациентов, переболевших COVID-19. Нейтрализующие антитела S14P5 и S21P2 эффективно связывались с линейными пептидами, соответствующими участкам 553-570 и 809-826 в координатах последовательности S-белка изолята Wuhan-Hu-1 (Poh et al., 2020). Использование последовательности 809-826 при создании генно-инженерных конструкций затруднено тем, что внутри нее расположен сайт протеолиза (815/816) субъединиц S1/S2, а также гидрофобный пептид слияния (fusion peptide, 816-833), расположенный в N-концевой области S2. Анализ гомологичных аминокислотных последовательностей показал, что области 510-586 SARS-CoV соответствует участок 524-598 S-белка SARS-CoV-2. Данный вариабельный участок был включен в состав полиэпитопного белка (PE2) вместе с другим вариабельным участком 785-814 (78,7% и 80,0% гомологии с последовательностью SARS-CoV соответственно), а также консервативным участком 888-913 (в координатах SARS-CoV-2; гомологичен иммунодоминантному участку 870-893 SARS-CoV). Участок 888-913 имеет до 100% гомологии у SARS-CoV, SARS-CoV-2 и коронавируса летучих мышей Rhinolophus affinis RaTG13. При дизайне белка (PE2)-SARS-CoV-2 три упомянутые антигенные области были соединены в единый слитый белок с помощью двух глицин-сериновых линкеров. Первый (12 а.о.) был аналогичен линкеру, использованному в белке (S2)-CoV (Waldo et al., 1999), при этом последовательность второго (EGKSSGSGSESKST, протяженность 14 а.о.) отличалась от первого и, по аналогии, также не содержала повторяющихся мотивов (GnS) или (GnA) (Bird et al., 1988). Поскольку последовательность белка (PE2)-SARS-CoV-2 содержала участок 785-814, расположенный близко к сайту протеолиза S1/S2, был проведен компьютерный анализ последовательности с помощью программ PeptideCutter (https://web.expasy.org/peptide_cutter/) и PROSPER (https://prosper.erc.monash.edu.au/webserver.html), который показал, что в клетках E.coli предполагаемый белок (PE2)-SARS-CoV-2 не должен быть чувствителен к протеолизу. Тем не менее, при дизайне альтернативного белка (PE3)-SARS-CoV-2 участок 785-814 из последовательности был исключен, а иммунодоминантная область 524-598 (75 а.о.) и расширенный участок 867-913 (47 а.о.) были разделены единственным глицин-сериновым линкером (Waldo et al., 1999). Далее, после «обратной трансляции» и оптимизации, аминокислотные последовательности слитых полиэпитопных белков (PE2)-SARS-CoV-2 и (PE3)-SARS-CoV-2 были преобразованы в нуклеотидные. Анализ «первичной» нуклеотидной последовательности (PE2)-SARS-CoV-2 по алгоритму IDT выявил скрытую минимальную последовательность Шайна-Дальгарно в области 352-355, не имеющую в непосредственной близости стартового кодона ATG. Помимо этого, в начале кодирующей последовательности (нуклеотиды 13-18) был выявлен полиА тяж, способный вызывать «скольжение» рибосомы и сбой рамки считывания. Анализ предполагаемого гена (PE2)-SARS-CoV-2 с помощью GenScript показал наличие криптической последовательности Шайна-Дальгарно в положении 352-355, а также наличие альтернативного стартового кодона ATG в положении 3-5. Кроме этого, был выявлен криптический промотор в области 19-90, с 95% вероятностью являющийся промотором для сигма70. Наличие высоковероятной промоторной последовательности в кодирующей области может приводить к снижению эффективности транскрипции полноразмерной мРНК, а также снижать эффективность ее трансляции. Все синтетические гены клонировали в экспрессионную плазмиду pQE-30 по сайтам BamHI и HindIII. 5. N-белок SARS-CoV-2 Нуклеокапсид (nucleocapsid, N-белок) бетакоронавирусов включает множество консервативных Т-клеточных и В-клеточных эпитопов (Ahmed et al., 2020). Биоинформатический анализ N-белка SARS-CoV-2 позволил выделить три предполагаемых иммунодоминантных В-клеточных области имеющих высокий уровень гомологии в сравнении с SARS-CoV: 43-65, 154-175, 356-404 (в координатах последовательности SARS-CoV; Grifoni et al., 2020). Для создания слитого белка (NA)-SARS-CoV-2 были выбраны вторая и третья области (153-171 и 354-400 в координатах последовательности SARS-CoV-2 Wuhan Hu-1, 95% и 90% гомологии соответственно). Данные участки были дополнены следующими предсказанными T-клеточными эпитопами, совпадающими (100% гомологии) у SARS-CoV и SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (базовый геном для нумерации аминокислотных остатков): ALNTPKDHI (138-146), FFGMSRIGMEV (314-324), MEVTPSGTWL (322-331), а также эпитопом NFKDQVILL (345-353, 78% гомологии). Полученные таким путем антигенные области с координатами (138-171) и (314-400) объединяли с помощью примененного ранее глицин-серинового линкера (12 а.о.; Waldo et al., 1999). Итоговая аминокислотная последовательность слитого белка (NA)-SARS-CoV-2 (133 а.о.) служила матрицей для «обратной трансляции». После оптимизации нуклеотидной последовательности синтетический ген, кодирующий белок (NA)-SARS-CoV-2 клонировали в вектор pQE-30 по сайтам BamHI и HindIII. 6. Экспрессия рекомбинантных антигенов в клетках E. сoli Методами генной инженерии получен набор плазмидных конструкций для экспрессии в клетках E.coli восьми рекомбинантых белков: 1. (RBD)SARS-CoV-2, содержащий последовательность рецептор-связывающего домена S-белка SARS-CoV-2. 2. (RBD)-epS2-а-SARS-CoV-2 – слитый белок, включающий последовательность RBD и консервативный эпитоп epS2-a из субъединицы S2 S- белка SARS-CoV-2. 3. (RBD)-epS2-b-SARS-CoV-2 – слитый белок, включающий последовательность RBD и консервативный эпитоп epS2-b из субъединицы S2 S- белка SARS-CoV-2. 4. (RBD)MERS-CoV, содержащий последовательность рецептор-связывающего домена S-белка MERS-CoV. 5. (S2)-CoV, содержащий высококонсервативные эпитопы (до 100% гомологии) S2 субъединицы S-белка SARS-CoV-2, SARS-CoV и других SARS-подобных коронавирусов 6. (PE2)-SARS-CoV-2 – слитый белок, содержащий три антигенные области, расположенные между RBD и сайтом протеолиза SARS-CoV-2. 7. (PE3)-SARS-CoV-2 – слитый белок, содержащий две антигенные области, расположенные между RBD и сайтом протеолиза SARS-CoV-2. 8. (NA)-SARS-CoV-2 – слитый белок, включающий две консервативные для SARS-CoV-2 и SARS-CoV антигенные последовательности N-белка. Аминокислотные последовательности белков (RBD)-SARS-CoV-2, (RBD)-epS2-а-SARS-CoV-2 (RBD)-epS2-b-SARS-CoV-2, (S2)-CoV, (RBD)-MERS-CoV; (PE2)-SARS-CoV-2, (PE3)-SARS-CoV-2 и (NA)-SARS-CoV-2, а также их молекулярные массы рассчитанные с помощью программы EditSeq v.11.1.0 с учетом 6хHis, сайтов рестрикции и других последовательностей, кодируемых вектором pQE-30 представлены в файле с дополнительными материалами (Приложение 1). Генетические карты, полученных экспрессионных плазмид, представлены в файле c дополнительными материалами (Приложение 2). Полученные генно-инженерные конструкции экспрессированы в клетках E.coli, при этом был осуществлен подбор наиболее эффективного штамма-продуцента, а также оптимальных условий культивирования бактериальных клеток для повышения выхода целевых белков. Экспрессия генно-инженерных конструкций (RBD)SARS-CoV-2, (RBD)-epS2-а-SARS-CoV-2, (RBD)-epS2-b-SARS-CoV-2, (RBD)MERS-CoV, (S2)-CoV, (NA)-SARS-CoV-2 осуществлялась в клетках E. coli штамма SG13009, а конструкций (PE2)-SARS-CoV-2 и (PE3)-SARS-CoV-2 – в клетках E. coli штамма M15. Для индукции использовали различные (0,5 – 2,0 mM) концентрации IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактозид), в большинстве случаев – 1 mM. Белки разделяли в 15 % полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием Кумасси. Предварительные результаты показывают, что уровень экспрессии рекомбинантных белков можно охарактеризовать как высокий (3-5 мкг в мкл) для (RBD)-epS2-b- SARS-CoV-2, (S2)-CoV и (RBD)-MERS-CoV; средний (около 1 мкг в мкл) для (RBD)-SARS-CoV-2; умеренный (около 0.5 мкг в мкл) для (RBD)-epS2-а- SARS-CoV-2, (PE3)-SARS-CoV-2 и (NA)-SARS-CoV-2. При экспрессии белка (PE2)-SARS-CoV-2 уровень синтеза был незначительным (0.2-0.3 мкг в мкл), электрофорез показал наличие дополнительной полосы с подвижностью, примерно соответствующей 14 кДа, количество этого белка было сопоставимо с основным продуктом. Можно предположить, что белок (PE2)-SARS-CoV-2 недостаточно стабилен в E. coli; перспективы его дальнейшего использования остаются неясными, необходимы дальнейшие эксперименты по очистке и хранению полученного препарата. Таким образом, в рамках данной работы на основе анализа информации из международных баз данных UniProt и GenBank по полноразмерным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям структурных белков различных коронавирусов, а также литературных данных впервые предложена и разработана панель рекомбинантных антигенов широкого спектра действия против различных бетакоронавирусов, включая высокопатогенные SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV. В проекте использованы современные подходы к оптимизации гетерологической экспрессии целевых белков в клетках E. coli, в том числе основанные на оптимизации локальной скорости трансляции, оптимизации кодонов с учетом частоты использования в E. сoli, «мутагенезе» различных cis-элементов, негативно влияющих на эффективность экспрессии в бактериальных клетках. Все полученные генно-инженерные последовательности оригинальны и содержат нуклеотидные последовательности, обеспечивающие высокий уровень экспрессии антигенов бетакоронавирусов в клетках E. сoli. По результатам исследований подготовлена к печати статья в журнал «Vaccines» (издательство MDPI), Special Issue "Vaccine Candidate against SARS-CoV-2" Создание панели антигенов широкого спектра действия в качестве иммунологического средства борьбы с коронавирусами представляет собой уникальный подход, разрабатываемый авторским коллективом проекта и соответствующий самому современному уровню разработок в данной области. | ||
2 | 9 сентября 2021 г.-14 июля 2022 г. | Научные основы разработки универсальной панели антигенов для иммунологических средств борьбы с коронавирусами |
Результаты этапа: В рамках данной работы на основе анализа информации из международных баз данных UniProt и GenBank по полноразмерным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям структурных белков различных коронавирусов, а также литературных данных впервые предложена и разработана панель рекомбинантных антигенов широкого спектра действия против различных бетакоронавирусов, включая высокопатогенные SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV. В проекте использованы современные подходы к оптимизации гетерологической экспрессии целевых белков в клетках E. coli, в том числе основанные на оптимизации локальной скорости трансляции, оптимизации кодонов с учетом частоты использования в E. сoli, «мутагенезе» различных cis-элементов, негативно влияющих на эффективность экспрессии в бактериальных клетках. Все полученные генно-инженерные последовательности оригинальны и содержат нуклеотидные последовательности, обеспечивающие высокий уровень экспрессии антигенов бетакоронавирусов в клетках E. сoli. Разработана новая, не имеющая аналогов, кандидатная вакцина против COVID-19. Кандидатная вакцина включена в список ВОЗ (Draft landscape of COVID-19 candidate vaccines.WHO). Создание панели антигенов широкого спектра действия в качестве иммунологического средства борьбы с коронавирусами представляет собой уникальный подход, разрабатываемый авторским коллективом проекта и соответствующий передовому современному уровню разработок в данной области. В ходе выполнения проекта все поставленные задачи решены в полном объеме. Получены дополнительные результаты по проверке вакцинного кандидата, созданного на основе разработанных рекомбинантных антигенов и сферических частиц вируса табачной мозаики в качестве платформы- адьюванта. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".