ИСТИНА

В ходе выполнения предлагаемого проекта мы планируем подробно изучить структуру, физико-химические свойства и способы регуляции активности HspB7. Такое исследование позволит приблизиться к пониманию механизмов кардиопротекторной активности этого белка.

Heat shock proteins (Hsp) form a large group of proteins responsible for protein homeostasis (proteostasis) in the cell. Therefore it is quite understandable that this group of proteins is detected in all living beings from Archaea and viruses to Homo sapiens. Among this diverse group of proteins there is a large group of small molecular weight proteins called small heat shock proteins (sHsp). These proteins prevent aggregation of partially denatured protein targets (demonstrating the so-called chaperone-like activity) and regulate specific degradation of denatured proteins in proteasomes and autophagosomes. Moreover, the small heat shock proteins are involved in regulation of redox state in the cell, control of cytoskeleton functioning, participate in regulation of many enzymes and apoptosis. Human genome contains ten sHsp genes. Some of these proteins (HspB1, HspB5, HspB6, HspB8) are ubiquitously expressed, whereas expression of other proteins is tissue specific. Five sHsp (HspB1, HspB5, HspB6, HspB7 and HspB8) are expressed in human heart and the level of HspB7 also denoted as cardio-vascular sHsp (cvHsp) is the highest. Due to constant mechanical stresses induced by contraction/relaxation the muscle tissues are specifically dependent on proper functioning of heat shock proteins and particular of small heat shock proteins. Indeed the data of literature indicate that expression of HspB7 can enhance cell resistance to heat shock. Furthermore knockout of HspB7 gene is accompanied by distortion of heart development in ontogenesis, sarcomere damage, deregulation of actin polymerization and muscle atrophy. Mutations of potential clients of HspB7 (such as filamin C) correlate with cardiomyopathy. Additionally, mutations in non-cording regions of HspB7 gene are also associated with cardiomyopathy. All above mentioned facts make HspB7 an attractive subject for detailed investigation dealing with analysis of normal heart functioning and cardio-vascular pathologies. Urgency of solving this scientific problem. According to the data of the World Health Organization of 2016 cardio-vascular diseases remain the main cause of human mortality. Therefore understanding of molecular mechanisms underlying cardioprotection induced by HspB7 is required for effective treatment of different cardio-vascular diseases. Scientific novelty. The literature data contain enough information concerning functioning of HspB7 in cell culture and in the course of ontogenesis, however, these data are predominantly phenomenological and do not provide answer how this protein can affect so many different and diverse processes in muscle cells. Therefore in the course of this project we plan thoroughly analyze structure, physico-chemical properties and mechanism of regulation of unmodified (untagged) HspB7. This investigation will help to understand mechanisms of functioning and regulation of HspB7 cardioprotective activity. We suppose that the investigation planned will be important for understanding mechanisms underlying etiology of cadiomyopathies. Understanding of the mechanism of functioning of any protein should be based on detailed knowledge of its structure and physico-chemical properties because protein`s structure determine its function. Therefore we hope that our investigation will feel the gap between earlier obtained phenomenological data and real mechanisms of HspB7 functioning. In the course of this project we plan to solve the following problems. 1. To obtain plasmid construction containing full size human HspB7 gene and to develop effective methods of its expression and purification. 2. By using different methods (such as size-exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation, dynamic light scattering) analyze oligomeric structure of this protein and determine its quaternary structure. 3. To analyze how modification of the single SH group of HspB7 occurring under oxidative stress can affect oligomeric structure of this protein. 4. By using different chromatographic and electrophoretic methods as well as chemical crosslinking we are going to analyze interaction of HspB7 with other small heat shock proteins (HspB1, HspB5, HspB6, HspB8) expressed in the heart. 5. To determine effect of oligomeric structure on chaperone-like activity of HspB7 in vitro using different model protein substrates. 6. To investigate effect of HspB7 on actin polymerization and interaction of HspB7 with different actin-binding proteins (such as tropomyosin, tropomodulin and filamin C). 7. To analyze mechanisms underlying regulation of HspB7 activity. Taking into account that phosphorylation often regulates activity of small heat shock proteins we plan to investigate phosphorylation of HspB7 in vivo (in cultured rat cardiomyocites) and then in vitro by using different protein kinases. We are going to determine the sites of phosphorylation (if any) and protein kinases involved in HspB7 phosphorylation in the cell. We hope that successful realization of this project will help to describe the structure and properties of HspB7 and understand its molecular mechanisms underlying cardioprotective activity in cardiomyocites.

Мы предполагаем, что успешная реализация предлагаемого плана позволит дать ответы на следующие вопросы. 1. До последнего времени не было получено однозначных данных об олигомерном состоянии HspB7. Этот вопрос представляется особенно важным потому что функционирование малых белков во многом определяется именно их олигомерным состоянием и склонностью образовывать разные по размеру олигомеры. 2. Известно, что малые белки теплового шока участвуют в регуляции окислительно-восстановительного потенциала в клетке и предотвращают последствия окислительного стресса. Детальный механизм действия малых белков теплового шока в этом направлении остается мало исследованным. Известно, что единственная SH группа HspB7 обладает необычайно высокой реакционной способностью. Можно предположить, что модификация этой группы может влиять на олигомерное состояние HspB7 и таким образом влиять на функционирование этого белка. Мы надеемся, что запланированные эксперименты смогут проверить это предположение. 3. В сердце и гладких мышцах одновременно экспрессируется сразу несколько малых белков теплового шока (HspB1, HspB5, HspB6, HspB7, HspB8). Некоторые из этих белков могут образовывать гетероолигомерные комплексы, свойства которых отличаются от свойств соответствующих гомоолигомеров. По этой причине представляется целесообразным исследовать способность HspB7 взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока и изучить свойства таких гетероолигомеров, если они будут образовываться. 4. Шапероноподобная активность является главной отличительной особенностью и физиологически важным свойством малых белков теплового шока. В этой связи актуальным является исследование шапероноподобной активности HspB1 с использованием различных модельных белков субстратов и сравнение шапероноподобной активности HspB7 с аналогичной активностью других малых белков теплового шока. 5. Показано, что HspB7 каким-то образом участвует в поддержании гомеостаза сократительного аппарата. Однако имеющиеся в литературе данные достаточно отрывочны и зачастую противоречивы. По этой причине мы попытаемся дать ответ на вопрос, способен ли HspB7 влиять на процессы полимеризации актина, способен ли HspB7 взаимодействовать с несколькими актин-связывающими белками и как такое взаимодействие, если оно существует, может влиять на сборку и функционирование актинового цитоскелета. 6. В литературе нет экспериментальных данных, касающихся регуляции активности HspB7, однако, высказываются предположения, что HspB7 может быть фосфорилирован, например, протеинкиназой С. Мы надеемся, что в результате анализа процесса фосфорилирования эндогенного HspB7, выделенного из кардиомиоцитов крысы, мы сможем установить, какие именно участки в последовательности HspB7 фосфорилируются в норме и при гипертрофии. Помимо этого мы надеемся установить, какие именно сигнальные каскады приводят к фосфорилированию HspB7 и подтвердить полученные in vivo результаты в экспериментах in vitro. Реализация указанного плана позволит подробнее охарактеризовать функционирование HspB7 в мышечных клетках и приблизиться к пониманию, как устроена кардиопротекторная система у человека, что необходимо для поддержания функциональности сердечно-сосудистой системы и успешной борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

За время свой работы руководитель проекта участвовала в нескольких научно-исследовательских работах (НИР). НИР "Малые белки теплового шока и врожденные заболевания человека" был посвящен исследованию влияния малых белков теплового шока на развитие врожденных заболеваний человека. В ходе выполнения данного проекта были отработаны некоторые молекулярно-биологические и биохимические методы, в частности, клонирование генетических конструкций, экспрессия рекомбинантных белков в бактериальной системе, выделение и очистка малых белков теплового шока HspB1 и HspB6, методы исследования олигомерного состояния, шапероноподобной активности, фосфорилирования HspB1 in vitro. Исследования в области малых белков теплового шока были продолжены в рамках НИР «Особенности строения и свойств точечных мутантов малых белков теплового шока, экспрессия которых коррелирует с некоторыми врожденными заболеваниями человека». В течении этого проекта были получены точечные мутантные формы белка HspB1, экспрессия которых коррелирует с развитием нейропатии Шарко-Мари-Тутса II типа. Помимо уже указанного выше, руководитель настоящего проекта отработал методики фосфорилирования HspB6 in vitro и исследовал процессы фосфорилирования HspB5. Далее работа была продолжена в ходе НИР "Роль N-концевого домена в формировании структуры и белок-белковых взаимодействиях малых белков теплового шока". Кроме указанных выше НИР, руководитель настоящего проекта участвовал в проектах совместно с Медицинским научно-образовательным центром МГУ ("Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств". В результате был налажен тесный контакт между научными группами и врачами-клиницистами. Помимо этого, руководитель настоящего проекта разработала методы исследования влияния посттрансляционных модификаций на свойства и функции малого белка теплового шока HspB6.