ИСТИНА

Установление взаимосвязи между микроструктурой и микродинамикой матриксов на основе термочувствительных полимеров и закономерностями роста и открепления клеточных структур на примере сополимеров поли(N-изопропилакриламида) (PNIPAM).

The therapy using stem cells opens up new possibilities for the restoration of the functions of organs and tissues. A significant step towards the introduction of cellular technologies in practical healthcare is the creation of standardized three-dimensional structures containing a large number of interconnected cells: cell spheroids and cell layers. Such products form their extracellular matrix, which in turn significantly increases the therapeutic effect. An important aspect of creating three-dimensional cellular structures is the establishment of a relationship between the perculiarities of growth and detachment of cell layers with the microstructure and microdynamics of thermoresponsive polymer scaffolds used for their growth. Based on a comparison of the EPR data with the data of macroscopic methods (turbidimetry, mechanical properties, measurement of the contact angle) and the results of molecular dynamic simulations, the main mechanisms of the influence of microstructure and microdynamics on the formation of cellular structures will be determined in the proposed project. In the framework of the project: - methods for the synthesis of copolymers of N-isopropylacrylamide with a hydrophobic monomer N-tert-butyl acrylamide with different contents of a hydrophobic monomer controlled by molecular weight and polydispersity, including the synthesis of poly (N-isopropyl acrylamide) containing a nitroxide spin label will be developed. - the dependences of the temperature and temperature range of the coil-globule transition on the composition and structure of the copolymer by turbidimetry will be established. - the microstructure and microdynamics of the copolymers were monitored during the coil-globule transition using spin probe and spin label EPR spectroscopy, the relationship with the patterns of changes at the macro level, as well as with the results of molecular dynamics calculations will be established. - correlations between the features of the formation and detachment of cellular structures and the structure and composition of the scaffold (monomers ratio of, molecular weight, polydispersity, water content) will established. The basic principles for the design, storage and use of thermoresponsive copolymers as scaffolds to obtain cell structures will be formulated, those, in turn, will lay the foundations for the development of a commercial product - smart plastic for cell cultures.

1. Метод синтеза ряда сополимеров N-изопропилакриламида с различным содержанием N-третбутилакриламида и нитроксильной спиновой метки, варьируемой молекулярной массой и полидисперсностью. 2. Метод контролируемого нанесения тонких пленок синтезированных сополимеров на культуральный пластик, включая контроль микроструктуры и механических свойств нанесенных пленок. 3. Температурные интервалы растворения и набухания синтезированных сополимеров на макроуровне, выбор сополимеров, оптимально соответствующих физиологическим условиям. 4. Температурные интервалы перехода клубок-глобула методом ЭПР путем анализа соотношений сигналов спиновой метки или зонда в гидрофильных и гидрофобных доменах. 5. Характеристики локальных неоднородностей полученных полимеров, оценка их размеров, полярности микроокружения, плотности упаковки полимерных цепей на разных этапах коллапсирования, характеристических времен вращательной корреляции, а также обмена между гидрофобными и гидрофильными доменами с использованием спектроскопии ЭПР. 6. Корреляции между особенностями формирования и открепления клеточных структур и структурой скаффолда на макро- и микроуровне. 7. Молекулярно-динамические модели поверхности скаффолда с различной структурой, волокнистостью, кристалличностью и степенью рептации при использовании полимеров разного строения. 8. Модели структуры координационных комплексов и предварительные оценки энергии координации моделей протеина на поверхностях полимерных пленок. 9. Параметры влияния температуры и ионной силы раствора на структуру внутримолекулярных связей и кинетику координации. 10. Основные принципы дизайна, хранения и использования термочувствительных сополимеров как основы для разработки коммерческого продукта – отечественного смарт-пластика для клеточных культур.

Участники проекта имеют опыт в области синтеза полимеров методами анионной полимеризации с раскрытием цикла, катионной и радикальной полимеризации, а также в области тканевой инженерии, биомедицинского материаловедения, спектроскопии, владеют современными методами анализа поверхности и внутренней структуры высокомолекулярных соединений и оценки их влияния на культуру клеток, теоретически подходами, в том числе методами молекулярной динамики. Авторским коллективом активно ведутся разработки методов синтеза новых функционализированных полимеров для использования их в биомедицине. Коллектив обладает большим заделом в области регенеративной медицины, дизайна и применения скаффолдов. Участники коллектива имеют большой опыт применения метода ЭПР в рамках методики спиновых зондов для интерпретации строения и динамики различных сред. Рабочий коллектив проекта имеет обширный задел в области использования сверхкритических флюидов для формирования полимерных композиционных и пористых материалов, в том числе опыт импрегнации биосовместимых полимеров парамагнитными молекулами.

1) Разработана эффективная методология получения PNIPAM, его сополимеров с NTBA и графт-сополимеров P(NIPAM-g-PLA) с регулируемой молекулярной массой и низкой полидисперностью. Показано, что как молекулярная масса, так и полидисперсность (со)полимера слабо влияют на НКТР. Значения НКТР, определенные методом турбидиметрии, хорошо согласуются с данными, полученными методом ДСК по кривым нагрева. Использование кривых охлаждения для определения НКТР дает заниженные значения, причем для сополимера разница в НКТР, полученных по данным нагрева и охлаждения, увеличивается с увеличением доли гидрофобного сомономера в цепи сополимера. 2) Разработана методика синтеза полимера с PNIPAM ковалентно пришитой спиновой меткой при помощи радикала 4-амино-ТЕМПО. Методом ЭПР показано, коллапс полимерных глобул протекает в температурном диапазоне 304-310K. 3) Методом ЭПР в рамках методики спинового зонда показано, что гидрофобная модификация PNIPAM приводит к уменьшению НКТР, уширению температурного интервала перехода клубок-глобула и появлению неоднородностей ниже НКТР (на 5-10 градусов ниже), измеряемой методом турбидиметрии. Показано, что природа образующихся неоднородностей в ходе фазового перехода зависит состава полимера. Для графт-сополимеров P(NIPAM-g-PLA) наблюдается образование динамических неоднородностей при температурах выше 323 K, что приводит к обмену зондовыми молекулами между глобулой и внешним водным раствором. Для гомополимера PNIPAM и стастического сополимера PNIPAM-NTBA происходит образование жёстких статических неоднородностей, причем в случае статического сополимера PNIPAM-NTBA образующиеся глобулы имеют большую жесткость, чем у гомополимера. 4) Разработана методика формирование ультратонких полимерных пленок толщиной 130-180 нм на поверхности культурального пластика путем центрифугирования (спинкоутинга, от англ. spin coating) спиртовых растворов полимеров. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показано, что механические (модуль Юнга) и поверхностные(шероховатость) свойства обратимо меняются в ходе полного цикла нагревание-охлаждение-нагревание. 5) Показано, что у полимеров PNIPAM и PNIPAM-NTBA отсутствует цитотоксичность. Разработан протокол нанесения ультратонких пленок на поверхность культурального пластика, позволяющий достигать контролируемых параметров формируемого покрытия и хорошей воспроизводимости клеточных экспериментов по прикреплению/откреплению. 6) Разработана методика получения волокнистых полимерных пленок на основе и PNIPAM-NTBA методом электроформования. Показано, что открепление клеточной структуры от таких пленок происходит в течение 5 минут, в отличие от тонких пленок, полученный методом спин-коутинга, где открепление происходило в течение 1 ч. 7) Расчетами методом молекулярной динамики показано, что при 45 °С цепочка PNIPAM в воде постепенно сворачивается в клубок, однако при температурах в 35 и 40 °С система остается развернутой на протяжении 100 нс. По-видимому, система имеет очень узкий температурный интервал сворачиваемости, либо ей не хватает 100 нс на сворачивание, и сама свернутая конформация имеет «статистический» характер, т.е. некоторое время существует в развернутом и свернутом состоянии.