![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Целью проекта является комплексное исследование функционального состояния митохондрий, белок-липидного состава цитоплазмы, пространственно-временных характеристик изменений концентрации внутриклеточного Са2+ и электрических свойств плазматической мембраны клеток глиомы и клеток в околоопухолевой (перитуморальной) области для установления клеточных механизмов опухолеобразования и разработки инновационного методического подхода на основе рамановской спектроскопии, позволяющем диагностировать изменённое состояние глиальных клеток и определять границы опухоли и перитуморальной ткани для эффективного удаления глиом головного мозга у пациентов во время операций. Данный проект является междисциплинарным и для его выполнения в состав коллектива привлечены специалисты из разных областей нейрохирургии, биофизики, нейробиологии и математического анализа данных.
This project is devoted to the comprehensive study of the functional state of mitochondria, the protein-lipid composition of the cytoplasm, the electrical properties of the plasma membrane, dynamics of cellular Ca2+ and the morphology of the processes of glioma cells and cells in the peritumoral region to establish cellular mechanisms of tumor development. The project is also dedicated to the development of the innovative methodological approach based on Raman spectroscopy sensitive to the changes in the state of glial cells and allowing determination of boundaries of the tumor and peritumoral tissue for the effective removal of brain gliomas in patients during surgery. This project is interdisciplinary and for its implementation specialists from different fields of neurosurgery, neurobiology, biophysics and mathematical analysis of data are involved in the team. During the implementation of the project, unique data will be obtained on the redox state of the complexes of the respiratory (electron transport, ETC) chain of mitochondria, reflecting the general activity of ETC, the efficiency of ATP synthesis, and the probability of superoxide anion radical generation and spatial-temporal characteristics of dynamics of cytosolic Ca2+. In addition, we will develop mathematical approach for automatic self-learning analysis of large amounts of data obtained by Raman spectroscopy and a new non-invasive methodological approach based on Raman spectroscopy with two wavelength laser excitation for highly sensitive determination of the boundaries of glioma and peritumoral regions containing cancer cells. The proposed methodology will be unique, since at present there are no optical non-invasive methods that can determine the boundaries of peritumoral regions containing a small number of cancer cells.
1. Будет выполнено исследование электрофизиологических свойств плазматической мембраны клеток из трех исследуемых областей: опухоли, перитуморального пространства и неизмененного кортекса и белого вещества. Будут оценены параметры сопротивления и проводимости, будет построена вольт-амперная характеристика клеток для каждой из интересующих нас областей. 2. В ходе электрофизиологических измерений глиальные клетки будут окрашены зондом AlexaFluor 488 за счет микроэлектродной инъекции зонда в клетки. В дальнейшем эти препараты будут использованы для морфологического анализа степени разветвленности и морфологии отростков астроцитов, а также в одной из серий экспериментов по КР-микро-спектроскопии. 3. Будут получены данные о пространственно-временных характеристиках локальных изменений концентрации ионов Са2+ в теле и отростках клеток в неизмененной области мозга без раковых клеток, в перитоморальной зоне и глиоме. 4. Будут начаты эксперименты по набору больших массивов данных КР-спектроскопии - спектров и изображений КР, полученных на тканях мозга пациентов с разными видами глиомы 2-4 типа. Будут зарегистрированы КР-спектры и КР-изображения клеток в неокрашенных срезах, срезах, окрашенных иммунохимически на астроцитарный белок GFAP, а также на срезах, в которых была выполнена микроэлектродная инъекция зонда Alexa-Fluor488 в глиальные клетки, на которыъ были проведены электрофихиологические измерения. Для перечисленных областей мозга каждого пациента будут зарегистрированы спектры КР (спектральные области 400-3500 см-1) при лазерных возбуждениях 532 и 633 нм и будут получены КР-изображения клеток. На основе изображений, полученных в областях глиомы и перитуморальных зон, а также в ткани здорового кортекса и белого вещества будут построены: (1) КР-карты распределения восстановленных митохондриальных цитохромов; (2) КР-карты, показывающие распределение белков и липидов в клетках. 5. В ходе первого и последующих этапах проекта выявленные параметры спектров КР, демонстрирующие отличия в белок-липидном составе и редокс-состоянии митохондриальных цитохромов, будут сопоставлены с данными электрофизиологических измерений и морфологического анализа. 6. На основе полученных изменений в параметрах, рассчитанных по спектрам КР, будет сделано предположение о возможности их использования в качестве маркеров раковых клеток. 7. Будет проведена оптимизация алгоритма для автоматизированной обработки спектров КР и изображений КР, включающая в себя коррекцию базовой линии с использованием узловых точек и указанных спектральных диапазонов; расчет соотношений интенсивностей или сумм интенсивностей в узком диапазоне указанных пиков КР в спектрах после коррекции базовой линии, автоматизированного поиска низкоразмерных представлений спектров для улучшения результатов классификации.
Коллектив авторов проекта активно занимается вопросом изучения проблемы интраоперационной идентификации границ опухолевого роста при глиальных опухолях, в том числе с 2015 разрабатываются принципиально новые подходы, например, на основании методов биофотоники [Yashin, et al., 2019; Медяник и др., 2014]. Проводились исследования методов хирургической антибластики в нейроонкологии, в том числе – в комбинации с персонифицированной иммунотерапией. Наряду с локальным контролем опухоли изучаются подходы к системному лечению опухолей мозга, поиск факторов продолженного роста злокачественных глиом с учетом молекулярно-генетических характеристик опухоли [Kiseleva et al., 2018; Kogan et al., 2017]. В настоящее время в нейрохирургической клиники ПИМУ внедрены все современные интраоперационные технологии, в том числе флуоресцентная диагностика, методы нейрофизиологического мониторинга. Все оперативные вмешательства проводятся с использованием картирования коры и подкорковых структур головного мозга методами прямой электростимуляции в с использованием данных функциональной МРТ и МР-трактографии (с дифференцированным моделированием речевых моторных трактов). У членов коллектива имеется большой опыт по применению спектроскопии КР для исследования функциональных свойств и конформационных изменений различных биомакромолекул в составе интактных клеток, органов в условиях in vitro и in situ. В пилотных экспериментах (n=3), выполненных на фиксированных срезах, приготовленных из тканей глиомы и перитуморальной зоны, удаленных у пациентов во время операций, мы показали, что с использованием лазерных возбуждений с длинами волн 532 и 633 нм можно зарегистрировать интенсивные спектры КР, содержащие пики, наблюдаемые нами ранее на срезах мозга мышей и крыс. Кроме того, в этих пилотных экспериментах мы показали, что высокочастотные области спектров (2800-2950 см-1) существенным образом отличаются для областей коры и глиомы.
В ходе выполнения проекта будут получены новые данные об электрофизиологических свойствах плазматической мембраны клеток в опухоли, перитуморальной зоне и неизмененной области мозга без раковых клеток, и будет выполнено построение вольт-амперной характеристики. Из данных о разветвленности и морфологии отростков астроцитов будут сделаны выводы об эффективности захвата глутамата и калия, необходиомом для обеспечения оптимального функционирования нейронов. Также при выполнении проекта будет получен ряд новых фундаментальных результатов о функционировании и редокс-состоянии комплексов ЭТЦ в митохондриях, изменении белок-липидного состава и конформации белков в клетках глиомы и астроцитах и нейронах перитуморальной области и будут определены спектральные “КР-маркеры” перечисленных изменений, которые будут использованы для дискриминации зон неизмененного мозга и областей, содержащих раковые клетки. Будет выполнен корреляционный анализ электрофизиологических свойств плазматической мембраны, разветвленности и морфологии клеточных отростков, белок-липидного состава цитоплазмы и редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий глиальных клеток из трех исследуемых областей и установлены процессы, наиболее подверженные изменениям при раковом перерождении клеток.На основе полученных данных будет разработан новый методический подход, основанный на спектроскопии КР с использованием лазерного возбуждения при длинах волн 532 и 633 нм, для высокочувствительного определения границ глиомы и перитуморальных зон, содержащих раковые клетки. Предлагаемая методология будет являться уникальной, так как в настоящее время отсутствуют оптические неинвазивные методы, позволяющие определять границы не только глиомы, но и окружающих ее перитуморальных зон, содержащих незначительное количество раковых клеток.
ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России | Соисполнитель |
ИБХ РАН | Соисполнитель |
ННГУ | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 19 февраля 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Изменение функционального состояния митохондрий, белок-липидного состава и электрофизиологических свойств клеток в перитуморальной области и опухоли у пациентов с глиомами II-IV степеней |
Результаты этапа: Во время первого этапа данного проекта мы впервые установили, что спектроскопия комбинационного рассеяния (КР, рамановская спектроскопия) является перспективным неинвазивным методом, который может позволить детектировать границы перитуморальной области для глиом IV степени по КР-сигналу от восстановленных цитохромов митохондрий. Анализ полученных нами данных КР-спектроскопии показал, что в перитуморальной области во всех исследуемых клетках в дыхательной цепи митохондрий достоверно снижено относительное содержание восстановленных цитохромов С, В и А-типов. Мы также показали, что в раковых клетках опухоли достоверно увеличено относительное содержание белков по сравнению с липидами. Мы полагаем, что это связано с интенсивным синтезом белка в раковых быстро делящихся и растущих клетках. Предполагается, что повышенный синтез белка в раковых клетках приводит к быстрому потреблению АТФ и активации ЭТЦ митохондрий (для обеспечения клеток необходимым количеством АТФ). В результате этого электроны быстрее проходят по дыхательной цепи, что выражается как снижение относительного содержания восстановленных цитохромов. Мы впервые показали, что при глиомах II степени, которые характеризуются более медленным ростом опухоли, чем глиомы IV степени, раковые клетки не обладают повышенным уровнем синтеза белка, при этом в митохондриях увеличено относительное содержание восстановленных цитохромов, что свидетельствует о гипоксическом состоянии раковых клеток. Был разработан протокол иммунохимического окрашивания белка GFAP в астроцитах кортекса и перитуморальной области, совместимый с регистрацией спектров КР. В дальнейшем иммунохимическое окрашивание астроцитов будет использовано для их визуализации и регистрации спектров КР от астроцитов в кортексе и перитуморальной области. Впервые было установлено, что в астроцитах перитуморальной области и раковых клетках при глиомах IV степени увеличивается входное сопротивление, что свидетельствует о возможном уменьшении размеров клеток, снижении числа отростков и щелевых контактов между ними. При глиомах II степени подобные изменения свойств клеток не происходят. При глиомах IV степени в раковых клетках наблюдается изменение спонтанной динамики кальция, когда области со спонтанными повышениями концентрации Са2+ становятся меньше по площади, а амплитуда и частота флуктуаций концентрации ионов Са2+ становится выше, чем в нормальных астроцитах, Мы предполагаем, что подобное изменение площади кальциевых событий, их частоты и длительности может быть связано с уменьшением размеров раковых клеток по сравнению с астроцитами нормального кортекса, с изменением метаболизма и энергетического состояния митохондрий и уменьшением числа щелевых контактов между клетками, что в результате приводит к нарушению внутри-и межклеточных сигнальных процессов. | ||
2 | 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. | Изменение функционального состояния митохондрий, белок-липидного состава и электрофизиологических свойств клеток в перитуморальной области и опухоли у пациентов с глиомами II-IV степеней |
Результаты этапа: Во время второго этапа проекта были выполнены исследования морфологии астроцитов в нормальном кортексе и плотных опухолях у пациентов при глиомах II-IV степеней и продолжены детальные исследования изменений белок-липидного состава цитоплазмы и редокс-состояния митохондрий клеток неизмененного кортекса, предопухолевой области и плотной опухоли у пациентов при различных глиомах. Впервые мы установили, что у астроцитов из области нормального кортекса наблюдается наибольшее количество отростков при наибольшой максимальной площади астроцита по сравнению с клетками из области плотной опухоли при глиомах II и III-IV степеней. При этом уменьшение числа отростков происходит по мере увеличения степени злокачественности глиомы. Так, при глиомах II степени у клеток из области плотной опухоли больше отростков и больше площадь максимальной проекции, чем у клеток опухоли при глиоме IV степени. Изменение морфологии клеток может приводить к существенному нарушению их функции. Мы установили, что по параметрам спектров комбинационного рассеяния клеток, характеризующим редокс-состояние цитохромов митохондрий можно отличить предопухолевую область от кортекса и собственно плотной опухоли при глиомах II и III-IV степеней, при этом можно различить типы глиом (ангиогенные, высокой степени злокачественности (III-IV), и неангиогенные, низкой степени злокачественности(II)). Также по КР-параметрам, характеризующим относительное содержание белка, можно определить границы собственно плотной опухоли при глиомах любой степени. При этом полученные результаты не зависят от возраста пациентов и связаны только с типом глиомы. Данный результат является крайне важным для дальнейшего развития дальнейших подходов и методов для определения границ преопухолевой области, содержащей раковые клетки, но неидентифицируемой при помощи других методов, а также для интраоперационного определения границ плотной опухоли и установления ее типа. На срезах мозге мышей с активно растущими метастазами меланомы мы показали, что в околоопухолевой области в астроцитах происходит снижение относительного содержания восстановленных цитохромов, которое тем более выражено, чем меньше расстояние до метастаза. Таким образом, из всех представленных результатов следует, что снижение относительного содержания восстановленных цитохромов митохондрий вблизи опухоли является общим свойством всех активно растущих опухолей и, таким образом, КР-спектроскопия, дающая возможность оценить параметры, характеризующие редокс-состояние компонентов ЭТЦ митохондрий, является перспективным методом для определения границ предопухолевой области. | ||
3 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Изменение функционального состояния митохондрий, белок-липидного состава и электрофизиологических свойств клеток в перитуморальной области и опухоли у пациентов с глиомами II-IV степеней |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Статья | SERS_cytochromeC_mitochondria_paper.pdf | 1,3 МБ | 9 февраля 2021 [NadiyaBrazhe] |