| Результаты этапа: Проводилось картирование РНК-связывающего сайта белка PS-1 C.maxima (CmPS-1). Выполнено моделирование третичной структуры белка CmPS-1 и предсказание районов поверхности белковой молекулы, взаимодействующих с РНК. Проведен сайт-направленный мутагенез районов белка, предположительно задействованных в связывании РНК. Сконструированы гены химерных белков, в которых фрагменты CmPS-1 заменялись соответствующими фрагментами антитромбина-III человека, сходного по структуре с PS-1, но неспособного связывать РНК. Получены данные, указывающие на то, что CmPS-1 имеет два сайта связывания РНК, расположенные в его N- и С-концевых районах. Проведено изучение РНК-связывающих свойств белка Serpin-1 A.thaliana, являющегося ортологом белка CmPS-1. Показано, что способность специфически связывать РНК не является уникальной особенностью CmPS1 и может быть присуща серпинам растений в целом. С помощью секвенирования нового поколения препаратов тРНК, выделенных из комплексов с CmPS-1 и AtSerpin1, проводилось изучение селективности связывания молекул тРНК. Получены данные, указывающие на то, что взаимодействие с серпинами растений определяется не первичной структурой тРНК, а консервативными элементами третичной структуры, характерными для тРНК. С использованием рекомбинантного белка CmPS-1 и эластазы, протеазы, активность которой ингибирует CmPS-1, проводились эксперименты по изучению in vitro влияния связывания РНК на взаимодействие белка CmPS-1 и протеазы-мишени.
Проводилась работа по получению трансгенных растений A.thaliana для анализа экспрессии генов AtSerpin1 и pri-miR319a. Получены бинарные векторы, несущие репортерный ген GUS под контролем промотерных районов генов AtSerpin1 и pri-miR319a. Проведена трансформация растений A.thaliana методом floral deep, начат отбор трансформированных растений.
Был охарактеризован транскрипт pri-miR319a C.maxima, способный транспортироваться по флоэме. С использованием препарата РНК из флоэмного экссудата C.maxima проведена специфическая амплификации концевых районов и картирование 5'- и 3'-концов pri-miR319a. С использованием экспериментальной системы, основанной на временной экспрессии pri-miR319a A.thaliana в растениях N.benthamiana с помощью агроинфильтрации и субклеточном фракционировании, проводились эксперименты по анализу роли сплайсинга pri-miR319a A.thaliana в ее выходе из ядра. Проводились эксперименты по изучению метилирования остатков цитозина с образованием 5-метилцитозина в составе предшественников миРНК, присутствующих во флоэмном экссудате C.maxima. Проведена бисульфитная конверсия соответствующих препаратов РНК и оценка полноты прохождения реакции дезаминирования. Продукты амплификации подготовлены для секвенирования нового поколения.
Проводился анализ экспрессии ретРНК в растениях N.benthamiana. Показано, что ретРНК детектируется в различных частях растений, включая корни, листья, интеркалярные почки, стебли, апекс и цветки. При анализе экспрессии ретРНК в условиях системных стрессов обнаружено, что засоление и пониженная температура не оказывают влияния на уровень накопления ретРНК в листьях N.benthamiana. Проведено исследование возможности метилирования остатков цитозина с образованием 5-метилцитозина в составе ретРНК N.benthamiana; с помощью бисульфитной конверсии и секвенирования нового поколения показано, что остатки цитозина в проанализированном районе ретРНК не подвергаются метилированию в листьях N.benthamiana. Проводился анализ данных секвенирования нового поколения, целью которого была идентификация ретРНК-специфических малых РНК и сайтов связывания предполагаемых миРНК-подобных ретРНК-специфических малых РНК в клеточных мРНК. Обнаружено, что препараты малых РНК из корней, листьев, стеблей, проростков и цветков N.benthamiana не содержат малых РНК, соответствующих по последовательности ретРНК. Показано, что клеточные мРНК, задействованные в метаболических путях или ответах на стрессы, не содержат мишеней гипотетических миРНК-подобных ретРНК-специфических РНК.
|
| Результаты этапа: Проводился анализ взаимосвязи двух функций белка PS-1 C. maxima, ингибирования протеаз и РНК-связывания. С использованием двух экспериментальных подходов получены данные, показывающие, что связывание РНК серпином PS-1 функционально обособлено от ингибирования протеаз. Проводились эксперименты по идентификации РНК, с которыми белок PS-1 взаимодействует во флоэмном соке. Выделены фракции РНК, взаимодействующих с белком PS-1. Показано, что белок AtSerpin1 связывает in vitro 7SL РНК. Обнаружено, что природа комплекса AtSerpin1 и 7SL РНК отличается от таковой в случае тРНК.
Получены трансгенные растения A. thaliana, несущие репортерный ген GUS под контролем промотеров генов Serpin-1 и pri-miR319a A. thaliana. Проведен гистохимический анализ активности промотеров генов AtSerpin1 и pri-miR319a в листьях трансгенных растений.
Проводилось изучение возможности метилирования предшественников микро-РНК на модели pri-miR319a C. maxima. С помощью бисульфитной конверсии и секвенирования нового поколения показано, что район pri-miR319a, включающий шпилечную структуру-предшественник зрелой микро-РНК, не несет остатков 5mC. Проводился анализ роли сплайсинга pri-miR319a A. thaliana в ее выходе из ядра. Показано, что для эффективного выхода из ядра требуется сплайсинг первичного транскрипта pri-miR319a, содержащего интрон, тогда как вариант первичного транскрипта, не имеющий интрона, не выходит из ядра в цитоплазму. В экспериментах по прививкам проводилось исследование функциональной роли транспорта pri-miR319a A. thaliana.
Проводился анализ последовательностей рет-РНК в геноме и транскриптоме N. benthamiana. Показано, что в геноме присутствуют девять полноразмерных локусов рет-РНК, неполные локусы рет-РНК и фрагменты ретрозимов, содержащие в основном одну последовательность LTR. Обнаружено, что в транскриптоме листа N. benthamiana около половины ретрозимов имеет точное совпадение последовательности с локусами рет-РНК в геноме N. benthamiana, тогда как остальные отличаются от ближайших геномных последовательностей нуклеотидными заменами. Выявлено, что линейные ретрозим-специфические РНК присутствуют в клетках на очень низком уровне. Обнаружено, что в клетках различных органов N. benthamiana имеются рет-РНК-специфические малые РНК длиной 24 нуклеотида. Показано, что район LTR содержит промотер и в значительной степени метилирован. Выявлено, что локальные стрессы (вирусная инфекция, поранение листьев) не влияют на уровень накопления рет-РНК в листьях N. benthamiana.
Проводилось исследование возможной роли ретРНК в сигналинге на уровне популяции. Изучена возможность механического переноса ретРНК с одного растения на другое и ее дальнейшего системного транспорта. Обнаружено, что системный транспорт рет-РНК N. benthamiana растениях огурца не детектируется.
|
