ИСТИНА

Важнейшей целью проекта будет создание комплексного подхода по установлению аминокислотной последовательности природных нетриптических пептидов исключительно методами масс-спектрометрии. Этот подход будет представлять последовательность операций, которая позволит достигать 100% результата при проведении секвенирования смесей природных пептидов. Эти операции будут включать процессы пробоподготовки, дериватизации, требований к используемым масс-спектрометрам и методам инициирования фрагментации в режиме тандемной масс-спектрометрии.

During last 20 years mass spectrometry became a key method of proteomics and protein profiling as well as of the search for the new biomarkers of diseases, study of adducts of proteins with the medicines and protein complexes, etc. There are two main strategies for the mass spectrometry analysis of proteins: "bottom up" and "top down" [Kinter M., Sherman N. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Wiley-Interscience Series on Mass Spectrometry. Desiderio D.M., Nibbering N.M.M., Editors. New York: John Wiley & Sons Inc., 2000, 320 p.; А.Т. Lebedev, К.А. Artemenko, Т.Yu. Samgina “The basics of mass spectrometry of proteins and peptides”, Technosphera, Moscow, 2012, 187 p.]. In the first case proteins are digested (most often with trypsin) to produce shorter peptides with molecular mass up to 2000 Dalton. The latter are identified using mass spectrometry and available data bases. "Top down" approach for the proteins identification involves exclusively mass spectrometry features. Tandem mass spectrometry, high resolution mass spectrometry, various methods of triggering fragmentation become indispensable in that case. "Bottom up" method is more popular being simple and well automated. However, situation becomes more difficult if a peptide is not present in the data bases. Then “de novo” strategy should be used to establish the full sequence of a protein (polypeptide), achieving the cleavages of all peptide bonds in the chain. This problem is partially resolved for the triptic peptides as there many software sequencing algorithms are developed for that purpose. However, for the natural non tryptic peptides the situation is much more complicated, while precisely that type of peptides (usually biologically active) play a key role in the functioning of the living species. In this case more difficult but reliable "top down" approach becomes required. The main problems of the sequencing of the natural non tryptic peptides are as follows: 1. Peptide length. Thus, esculentines of the skin secretion of frogs have up to 47 amino acid residues in the chain. Actually, they are small proteins, while the establishing of the primary sequence of amino acids in their molecules may be achieved applying de novo "top down" approach. 2. The presence of several basic amino acid residues in the chain (arginine and lysine). Tryptic peptides contain only one residue of that type situated at their C-terminus. As a result fragmentation pattern becomes non standard. Besides, that peculiarity interferes with "bottom up" approach resulting in formation of numerous very short peptides or even amino acids, which may be easily lost during analysis. 3. Incomplete sequence coverage. Very rarely one can obtain all required fragment ions forming due to the cleavages of all peptide bonds in one spectrum. To overcome this problem alternative methods of triggering fragmentation resulting in the formation of different arrays of the fragment ions may be applied. 4. The presence of disulfide bridges due to cysteine residues. To overcome that problem one should use derivatization, the search for the specific fragment ion series, or on-line reduction of S-S bonds. 5. The presence of isobaric (lysine/glutamine, phenylalanine/oxidized methionine) and isomeric (leucine/isoleucine) amino acids. In the first case high resolution mass spectrometry should be used, in the second - tandem mass spectrometry or derivatization. 6. Cyclization of short peptides. That process due to "head-to-tail" interaction leads to the formation of cyclic ions, which may reopen due to the cleavage of any peptide bond leading to scrambling. To resolve that problem derivatization again becomes the most appropriate method. Ion cyclotron resonance instruments or orbital traps may resolve some of the mentioned problems. However, cyclization and S-S bonds represent a bottleneck, while the search for new efficient derivatizing agents or alternative methods to trigger fragmentation represent important proteomics tasks. The most interesting fundamental problem, where mass spectrometry has still apply alternative methods (Edman degradation) involves differentiation of isomeric leucine and isoleucine residues. Edman degradation significantly slows down the work and makes it notably more expensive. Moreover, due to sensitivity issues and the necessity to isolate a pure peptide a notable portion of peptides in the complex mixtures remain unknowns. The resolving of the mentioned problem is highly actual as the corresponding solution will allow carrying on complete sequencing of peptides and proteins exclusively by means of mass spectrometry. Development of a rapid and sensitive mass spectrometry method allowing overcoming all the mentioned difficulties is highly demanded. The novelty of the current project involves the development of that particular method to sequence the most various non tryptic peptides in natural mixtures exclusively by means of mass spectrometry. The method should be fast, reliable, sensitive and able to handle complex mixtures. Besides that, the method to be developed in terms of the project will be able to estimate the type of the biological activity of new amphibian peptides [K.A. Artemenko, A.R. Zubarev, T.Yu. Samgina, M.M. Savitski, A.T. Lebedev, R.A. Zubarev. Two Dimensional Mass Mapping as a General Method of Data Representation in Comprehensive Analysis of Complex Molecular Mixtures. Anal. Chem., 2009, 81, 3738–3745; T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, E.A. Vorontsov, O.V. Klykov, S.V. Ogourtsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. Peptides, 2012, 34, 296-302].

В результате реализации проекта планируется получить следующие результаты: 1. Разработка надежного протокола выделения и сохранения пептидома, получаемого из кожного секрета амфибий. 2. Установление аминокислотных последовательностей нескольких сотен новых природных биологически активных пептидов амфибий, обитающих на территории России, Словении, Кубы. 3. Создание автоматизированного масс-спектрометрического метода идентификации изомерных лейцина и изолейцина при секвенировании пептидов. 4. Создание новых дериватизующих агентов для предотвращения циклизации ионов пептидов в источнике масс-спектрометра и для надежного разрушения дисульфидных связей в структуре пептидов. 5. Создание надежно работающего алгоритма полного сиквенирования природных нетриптических пептидов комплексом методов масс-спектрометрии. 6. Установление межвидовых и межпопуляционных различий пептидного профиля земноводных. Созданный в рамках предлагаемого исследования метод полного масс-спектрометрического секвенирования природных нетриптических пептидов может быть использован в любых исследовательских лабораториях, имеющих дело с пептидными объектами любого происхождения. Разработанный в рамках данных исследований алгоритм масс-спектрометрической дифференциации изомерных лейцина и изолейцина может быть включен в автоматизированные программы секвенирования скорострельной протеомики, что позволит использовать их в научных лабораториях, а также в клиниках по всему миру. Запланированные иследования будут проведены на современном мировом уровне. Результаты будут докладываться на Международных научных форумах и публиковаться в наиболее высокорейтинговых международных журналах индексируемых в базе данных «Сеть науки» (1 и 2 квартили Web of Science) (3-4 статьи в год).

В настоящее время не существует надежного протокола для масс-спектрометрического анализа сложных смесей природных нетриптических пептидов. Благодаря широчайшему диапазону концентраций природных пептидов, их конкурентной ионизации, низкому покрытию сиквенса, большая часть минорных компонентов остается неохарактеризованной. Часто в работах не указывается природа изомерных аминокислотных остатков (лейцина/изолейцина) или отсутствуют целые куски аминокислотной последовательности. Часто остаются неизвестными аминокислотные остатки внутри циклов, образующихся за счет дисульфидной связи. Нет также уверенности, что часть пептидов уже не подверглась воздействию ферментов. В связи с этим научный задел проекта состоит в создании полного протокола секвенирования природных пептидов и нового высокоэффективного метода масс-спектрометрического секвенирования природных пептидов.

В результате реализации проекта были получены следующие результаты: 1.Были проведены работы по экспериментальному подтверждению использования метанола для осаждения протеаз, вызывающих деградацию пептидов в процессе пробоподготовки кожных секретов. Известно, что пептиды в растворах кожных секретов подвергаются деградации под действием собственных протеаз, что приводит к полной потере активности кожных секретов. Предотвратить это можно осаждением протеаз, изменив ионную силу растворов кожных секретов, для чего используют кислоты, спирты, ингибиторы протеаз и т.д. Было проведено сравнительное изучение эффективности осаждения протеаз в присутствии наиболее употребляемых для этого реагентов: HCI, HCOOH, CH3OH и фенилметилсульфонил фторида (PMSF). Эксперименты были проведены на кожных секретах особей вида Pelophylax esculentus. Секрет смывали деионизованной водой в отдельные контейнеры, куда были добавлены HCI, CH3OH, HCOOH, 0,1 мM PMSF и 1,0 мM PMSF. Подготовленные образцы далее подвергались анализу методом ВЭЖХ-МС. Эффективность каждого из реагентов оценивалась по степени расщепления ранее изученных дисульфидсодержащих пептидов. К дисульфидным пептидам относят пептиды, содержащие в структуре С-терминальный 6-7-звенный цикл, образованный взаимодействием тиольных групп двух цистеинов («Rana box»). Три из девяти пептидов присутствуют в некоторых пробах секретов в окисленной форме (эскулентины 1, 1R, бревинин 1Ra). Наибольшей деградации во всех пробах подвергаются эскулентины 1 и 1R, имеющие самый большой процент протеоформ. В итоге, метанол оказался наиболее подходящим из протестированных реагентов. В его присутствии степень деградации всех девяти дисульфидных пептидов, отобранных для мониторинга, была наименьшей. 2.Краткий протокол, суммирующий приемы пробоподготовки и de novo секвенирования компонентов кожных пептидомов ранидных амфибий изложен в главе книги "Peptidomics - Methods and Strategies". Methods in Molecular Biology. Наш подход базируется на применении масс-спектрометрии высокого разрешения (МСВР). Помимо точности измерения масс ионов, используемый нами метод top-down (сверху-вниз) подразумевает совокупное применение различных методов инициирования фрагментации полипептидных цепей, что доступно на современных масс-спектрометрах ионно-циклотронного резонанса (ИЦР) и разнообразных орбитальных ловушках (Орбитрэп). Наиболее эффективными среди них являются: диссоциация, активированная столкновениями (ДАС); диссоциация, активированная столкновениями при повышенной энергии (ДАСПЭ); и гибридный МС3 метод EThcD со ступенчатым увеличением энергии столкновений активирующих частиц. Полнота определения компонентного состава кожных пептидомов зависит от точности определения масс ионов, скорости сканирования фрагментных спектров, имеющихся опций сбора масс-спектрометрических данных, использованных параметров хроматографирования образцов и точности соблюдения протокола пробоподготовки образцов секретов. 3.Сформулированный выше протокол секвенирования компонентов кожных пептидомов был применен к изучению кожных секретов ряда амфибий. Так, анализ пептидов, содержащихся в кожном секрете лягушки Rana temporaria из Словенской популяции, был проведен ручной интерпретацией данных, полученных с помощью ДАС, ДАСПЭ, диссоциацией, индуцированной переносом электрона (ДПЭ); и комбинированного варианта ДПЭ-ДАСПЭ (EThcD). В результате, удалось идентифицировать 60 пептидов, в том числе 7 новых: шесть темпоринов и один бревенин 1. Для новых пептидов проведено частичное (31%) дифференцирование в изомерных Leu/Ile по ранее разработанному нами алгоритму, нашедшему реализацию в МС3 эксперименте EThcD (Орбитрэп). В его основе лежит потеря пропильных или этильных радикалов из целевых z-ионов, содержащих N-концевые изомерные Leu/Ile, с образованием соответствующих w-ионов. В работе приведена таблица структурных аналогий темпоринов, идентифицированных в травяных лягушках из Словенской и Московской популяций, обсуждены возможные замены в их структурах. Применение автосеквенирования с помощью PEAKS Studio X с высокой степенью достоверности позволило установить последовательности коротких брадикининов, но лишь в 50% случаев алгоритм сработал для коротких темпоринов. В бревининах 1 программа успешно «прочитывает» линейную часть последовательности только до Rana box, хотя последовательность внутри интактного S-S цикла надежно устанавливается ручной интерпретацией спектров. Кроме того, автосеквенатор «пропустил» секвенирование мелиттин-родственного пептида, но просеквенировал последовательность нового темпорина, пропущенного при ручном секвенировании. Таким образом, использование PEAKS Studio X может стать дополнительным источником полезной информации о структурах пептидов-компонентов кожных секретов амфибий. 4. Кожный секрет особи Rana temporaria из Архангельской популяции был изучен аналогично Словенским пептидомам. Было найдено 23 пептида, четыре из которых из семейства темпоринов (U, V, W, X) имели еще неописанные последовательности. Кроме того, в секрете этой северной популяции впервые обнаружен бревинин 2Td, чья последовательность была предсказана кДНК клонингом почти 20 лет назад итальянскими исследователями. Известно, что транскриптом не эквивалентен кожному пептидому (секретому). В кожном секрете присутствуют только те пептиды, которые необходимы амфибиям для выживания в окружении определенной микробиоты в каждой климатической нише. Было проведено сравнение пептидов, присутствующих в секретах 4-х популяций R. temporaria, с широким географическим разбросом популяций (итальянская, словенская, московская и архангельская популяция). Результаты работы показали, что у всех четырех популяций R temporaria секретируются 10 общих антимикробных пептидов, среди которых наиболее представительным семейством были темпорины – короткие амидированные антимикробные пептиды. Это же семейство является самым изменчивым в их кожных пептидомах: всего 6 темпоринов являются общими для 4-х популяций, что делает их ответственными за адаптацию вида к различной микробиоте и климатическим условиям. Спектры, EThcD в очередной раз показали себя чрезвычайно информативными. В условиях EThcD произошло раскрытие Rana box у бревинина 2d. Выраженная фрагментация в раскрывшемся С-терминальном дисульфидном цикле с немодифицированной S-S связью позволила установить его последовательность: СysLysIleGlyGlyGlyCys, тогда как в условиях ДАСПЭ также наблюдалось раскрытие S-S связи, но с частичной фрагментацией, недостаточной для получения полного сиквенса внутри кольца. В четырех новых темпоринах архангельской R. temporaria по спектрам EThcD идентифицированы 9 из 18-ти изомерных Leu/Ile (50%). Таким образом, спектры EThcD показали высокую эффективность, обеспечив максимум информации: (i) при определении полных последовательностей дисульфидсодержащих пептидов с интактной внутримолекулярной S-S связью, включая С-терминальный цикл; (ii) при секвенировании коротких темпоринов; и (iii) при дифференцировании изомерных аминокислот в парах Ile/Leu. 5.Межпопуляционные изменения кожных пептидомов были продолжены на остромордой лягушке Rana arvalis из Словенской популяции. Анализ образцов проводили методом top-down, минуя стадии трипсинолиза и химических модификаций, на масс-спектрометре Орбитрэп. Для проведения секвенирования были получены тандемные спектры ДАС, ДПЭ и ДАСПЭ и EThcD. De novo секвенирование, выполненное ручной интерпретацией массива комплементарных масс-спектров, позволило установить в секретах словенских особей последовательности 18-ти пептидов, пять из которых оказались новыми. Было проведено сравнение пептидомов словенской и подмосковной популяций R arvalis, которое позволило выявить предположительные маркеры этих двух популяций и вида Rana arvalis в целом. Пять новых, обнаруженных в работе, пептидов были предложены нами в качестве биологических маркеров словенской популяции Rana arvalis: это бревинин 2 AV, ранатуерин 2 AVc, AK-23-1 (MRP), темпорин AV и темпорин Ava. В работе была показана чрезвычайная информативность спектров EThcD для определения последовательностей как длинных дисульфидных пептидов ранидных лягушек, так и более коротких, амидированных мелиттин-родственных пептидов и темпоринов. Применение EThcD позволило установить последовательности внутри Rana box интактных пептидов и последовательности коротких темпоринов, в том числе, установить место произошедшего в их структурах карбонилирования, а также убедиться в уникальной на сегодня замене консервативного Pro3 у темпоринов на Glu3. С их помощью удалось идентифицировать изомерные Leu/Ile, в частности, установить все изомерные аминокислоты в обоих MRPs, которые содержали 5 и 6 пар изомерных Leu/Ile. MRPs – катионные амидированные пептиды амфибий, обладающие высокой цитолитической активностью, в том числе, к эритроцитам. МСВР позволило секвенировать в секрете словенских R arvalis второй мелиттин-родственный пептид AK-23-1 с радикально отличающейся от FQ-22 последовательностью (10 замен), а их разница в массе составляет всего 0,004 Да. В работе рассмотрены варианты возможных замен в структурах известных мелиттин-родственных пептидов 6.В продолжение изучения кожных пептидомов ранидных лягушек был исследован секрет Rana dalmatina из Словенской популяции. Несмотря на известное зоологическое описание, состав кожного секрета этих лягушек до сих пор не был изучен. Был лишь известен выделенный ранее бревинин 1Da с высокой активностью в отношении St. aureus (7 μM) и умеренной против E. coli (30μМ). Был реализован аналогичный описанному выше подход анализа сверху вниз. В секрете R. dalmatina обнаружены два бревинина 1 (один новый), два бревинина 2 (один новый), один мелиттин-родственный пептид (MRPs), десять темпоринов (один новый) и брадикинин-родственные пептиды (BRPs) (суммарно 29 пептидов). Как и у травяной лягушки, в секрете Rana dalmatina присутствует 33-звенный бревинин 2: это новый бревинин 2D, с единственной заменой относительно бревинина 2Т у R. temporaria: His12→Val12. Наряду с бревинином 1Da, чья последовательность была установлена ранее, обнаружен новый 24-звенный бревинин 1Db. В секрете обнаружен мелиттин-родственный пептид FQ-22, полностью идентичный выделенному из секрета R. temporaria, а также десять темпоринов. Последовательности бревининов 1, 2 установлены ручной интерпретацией спектров EThcD, включая последовательность С-концевого цикла. По числу пептидов из семейства темпоринов R. dalmatina почти вдвое уступает Rana temporaria. Вопреки литературным данным о практически полном отсутствии брадикинина в коже R. dalmatina, мы обнаружили в ее секрете 19 брадикинин-родственных пептидов (BRPs). Это, прежде всего, сам брадикинин и агонист его рецептора [desArg9]BR, а также структурный аналог [Thr6]Br. Состав и общее количество BRPs и их протелолитических копий в секрете R. dalmatina в сравнении с R. Temporaria оказался беднее. В работе было проведено сравнение имеющегося в литературе транскриптома R. dalmatina из хорватской популяции с реально секретируемым кожным пептидомом особей словенской популяции. Единственным пересечением транскриптома с пептидомом R. dalmatina является бревинин 1D, чья структура была установлена Конлоном в 2004 году. Причина этого, по нашему мнению, кроется в том, что успех процедуры кДНК клонирования в значительной степени зависит от изученности кожных секретов объектов клонирования, поскольку именно этим определяется правильность конструирования праймеров считывания генетически закодированных последовательностей пептидов. Кожный секрет R dalmatina не был изучен, и это одна из главных причин расхождения ее предсказанного транскриптома с реально секретированным кожным пептидомом. Проведенный нами прицельный поиск всех предсказанных для R. dalmatina пептидов дал единственное пересечение – бревинин 1Da, чья структура была заранее определена. 7.В процессе интенсивного изучения особенностей фрагментации пептидов в условиях EThcD, мы обнаружили новую фрагментацию, связанную с раскрытием Rana box. Была предложена схема образования С-концевой серии с-катион-радикалов, проходящих через «Rana box», и быстро затухающей короткой серии циклических z-ионов. Образование циклических z ионов и с-катион-радикалов было предложено в работе С.Р. Коула с соавторами [Cole S.R., Ma X., Zhang X., Xia Y. Electron Transfer Dissociation (ETD) of Peptides Containing Intrachain Disulfide Bonds // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012. Vol. 23, № 2. P. 310–320]. Разрыв пептидной связи N-Cα внутри Rana box в условиях переноса электрона (EThcD) инициируется захватом его аминогруппой боковой цепи лизина, находящегося внутри цикла, с последующим переносом электронного центра на карбоксильный атом углерода, как это и предполагалось в механизме ДЗЭ, предложенном Зубаревым и МакЛафферти. Возникший радикальный центр инициирует разрыв связи N-Cα, а последующая дополнительная ДАСПЭ (в методе EThcD) активация вызывает гомолитический разрыв S-S связи. В результате, образуется серия с-ион-радикалов и короткая быстро затухающая серия z-ионов. Образование серий c-ионов, соответствующих последовательностям внутри «Rana box», происходит за счёт миграции радикального центра в раскрывшемся цикле. Масса уходящего внутреннего цистеина в «Rana box» составляет 102,001 Да, то есть уходящий цистеин уносит на себе радикальный центр. Образующиеся далее классические с-ионы уже не являются катион-радикалами. Наш отказ от предварительного раскрытия S-S связей путем их химического модифицирования, к которому мы вынужденно прибегали в течение долгого времени, базируется на комплементарности двух обнаруженных нами фрагментаций, протекающих внутри интактных «Rana box». В условиях ДАС и ДАСПЭ активации фрагментации у интактных дисульфидсодержащих пептидов происходит разрыв пептидной связи СО-NH, образованной предпоследней аминокислотой последовательности пептида и С-терминальным цистеином «Rana box». В результате такого разрыва С-конец пептида становится доступным для фрагментации, при этом внутренний цистеин превращается в цистин (т.е. S-S связь сохраняется), а серии b/y ионов проходят до конца. Интенсивность С-концевой фрагментации, как фрагментации, протекающей в условиях EThcD, зависит от наличия лизинов и их положения в структуре «Rana box». Оказалось, что сумма этих двух фрагментаций и структурно заданное наличие пары лизинов в составе «Rana box» позволяют для подавляющего большинства дисульфидных пептидов прочесть С-концевую последовательность полностью. На этом основании мы и отказались от предварительного модифицирования S-S связей в дисульфидных пептидах кожных секретов ранидных амфибий. Тем не менее мы провели сравнение результатов секвенирования последовательностей внутри «Rana box» для интактных пептидов и пептидов с предварительно модифицированной S-S связью (дитиотреитол/иодацетамид). Было показано, что любое модифицирование, даже самое щадящее, приводит к искажению результата в следствие низкой селективности реакции, невысоких выходов и неполного ее протекания, возможных побочных реакций, в том числе, в присутствии примесей у модифицирующего реагента. Но, главное, неизбежна потеря части компонентов исходной пептидной смеси в процессе очистки (потеряны пять из десяти дисульфидных минорных пептидов кожных секретов R. arvalis и R. temporaria). Наши многочисленные исследования показывают, что комплементарность данных, полученных при фрагментациях, протекающих в «Rana box» у дисульфидных пептидов в условиях EThcD и ДАС/ДАСПЭ, подтверждает обоснованность и эффективность top-down секвенирования интактных дисульфидных пептидов. Результаты наших работ показывают, что раскрытие интактного дисульфидного цикла в EThcD происходит стабильно и чаще, чем в ДАСПЭ. Как правило, одна и та же фрагментация в ДАСПЭ протекала чаще, чем в ДАС. Для пептидов из семейства бревининов 1, в силу особенностей их «Rana box» (два С-терминальных Lys), фрагментация с раскрытием интактного S-S цикла протекала и в ДАСПЭ, и в EThcD. Информация, полученная двумя этими методами о сиквенсах внутри интактных «Rana box», была взаимодополняющей, дающей в сумме полную последовательность (бревинин 1Т, 1Та, 1Тb). Аналогично в спектрах EThcD происходит раскрытие S-S связей для бревининов2Т, 2Тd и 2AV, а также ранатуеринов. Высокая информативность спектров EThcD была вновь продемонстрирована для решения основных проблем секвенирования пептидных компонентов кожных секретов ранидных амфибий (покрытие полного сиквенса длинных дисульфидных пептидов, сиквенс внутри Rana box, сиквенсы коротких темпоринов и идентификация в изомерных парах Leu/Ile). 8.В заключительном этапе выполнения работ по гранту основной акцент был сделан на изучении новых методов масс-спектрометрической фрагментации, способных раскрыть дисульфидные связи в интактных пептидах, чтобы избежать их предварительного химического модифицирования. Методы активации фрагментации с помощью УФ и ИК облучения (UVPD и IRMPD) являются комплементарными к традиционной ДАС. Оба этих метода являются мягкими в сравнении с ДАС, и, следовательно, пригодными для определения сайтов пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в белках и пептидах. Полученные спектры UVPD и IRMPD дисульфидных пептидов амфибий оказались низко интенсивными и, как следствие, мало информативными. Незначительная оригинальная информация могла быть использована только в качестве дополнения классическим вариантам фрагментации. Таким образом, эти два метода фрагментации показали себя менее эффективными в секвенировании компонентов кожных секретов ранидных лягушек, чем представлялось изначально. Совсем иначе в секвенировании дисульфидных пептидов показал себя метод фрагментации EThcD, описанный ранее. Представлялось интересным сравнить полученные в EThcD (Орбитрэп) результаты с новым методом фрагментации, основанном также на захвате электрона протонированной молекулой пептида в специальной камере. Конструкция такой ячейки позволяет применить захват электрона на приборах разного типа, в отличие от классического варианта, работающего исключительно на приборах ИЦР. В проведенных нами экспериментах метод, получивший название ExD, конструктивно реализован в ячейке е-MSion на квадрупольно-времяпролетном (Q-TOF) масс-спектрометре. Покрытие сиквенсов 18-ти дисульфидных пептидов (с S-S терминальной связью) из секрета ростовской Pelophylax ridibundus в среднем составило 97%. В условиях ExD также наблюдается раскрытие Rana box c активной фрагментацией внутри него, которая продуцирует, в основном, серии c/z ионов (95% покрытия внутри S-S цикла). Элиминирование в процессе фрагментации дегидроцистеиновых фрагментов косвенно подтверждает гомолитический разрыв S-S связи. Наиболее информативными при анализе кожного секрета Pelophylax ridibundus оказались спектры ExD бревинина 1Е, 1Ra, 2Еc и эскулентина 1a/b. Отличительной особенностью спектров ExD от EThcD является повышенное образование серии а-ионов, способных продуцировать d-ионы, которые аналогично z- и w-ионам можно использовать для идентификации изомерных Leu/Ile. В результате, 48 из 87 изомерных аминокислотных остатков, присутствующих в структурах 18-ти дисульфидных пептидов, были надежно определены по спектрам ExD (55%). Таким образом, ExD фрагментация оказалась высоко эффективной и пригодной для top-down de novo секвенирования пептидов ранидных лягушек. При анализе спектров секрета Pelophylax ridibundus было обнаружено большое количество пептидов, в которых произошло образование Nɛ-формиллизина и/или формилирование N-концевой NH2 группы. Анализ спектров кожного секрета P. ridibundus показал, что формилированию подвергались аминогруппы лизинов, находящихся в С-концевых циклах интактных дисульфидных пептидов. Такое формилирование является результатом ПТМ, происходящей под действием 3'-формилфосфата, продукта 5ʹ-окисления дезоксирибозы ДНК. Причиной его мог стать окислительный стресс, которому подверглись особи при длительной транспортировке от места отлова до лаборатории. Формилированные N-концевые аминогруппы не могли быть продуктом ПТМ, поскольку N-концевое формилирование как энзиматическая ПТМ известно только для N-метионина, тогда как в нашем эксперименте формилированиию подверглись N-концевые глицины, фенилаланины и аланины. Известно, что использование 0,1% муравьиной кислоты в элюентах при хроматографировании пептидов способно приводить к преимущественному формилированию боковых цепей серинов (60%), треанинов (30%), 10% N-концевых аминогрупп и не затрагивать аминогруппы лизинов [Lenco, J., Khalikova, M.A., Svec, F.: Dissolving peptides in 0.1% formic acid brings risk of artificial formylation. J. Proteome Res. 19, 993-999, (2020)]. Это объяснение формилирования N- концевых аминогрупп может быть принято лишь как рабочая гипотеза, т.к. в наших экспериментах полностью отсутствовало формилирование гидроксильных групп серинов и треонинов. 9.В работе с R. arvalis из новосибирской популяции был опробован рекомендованный в литературе метод получения кожного секрета в полевых условиях – ручное стимулирование. Как показало проведенное МС исследование компонентного состава полученного таким образом образца, в секрете практически отсутствовали интактные дисульфидные пептиды. Все они содержались в виде протеолитических фрагментов. Секвенирование вынужденно велось по выявлению пересекающихся N- и С- концевых протеолитических фрагментов, обеспечивавших полные последовательности исходных пептидов. Из-за высокой сложности ручной обработки секрета с таким большим содержанием протеолитических фрагментов тандемные спектры были секвенированы программой Novor.cloud. Из ~ 9,5 тысяч МС2 спектров в базе данных UniProt были найдены структурные соответствия для 85 пептидных сиквенсов. Дальнейшее сопоставление результатов автоматического и ручного секвенирования выявило в секрете 8 пептидов. Сравнение их с пептидами особей из подмосковной и словенских популяций показало, что общим для всех трёх популяций являются бревинины 1AVa и 1AVb. Полевой способ получения кожного секрета ручным стимулированием кожных желез амфибий признан нерелевантным. 10.В рамках проекта планировалось, что накопленные в процессе выполнения работ данные позволят нам подойти к разработке автоматизированной идентификации изомерных лейцинов/изолейцинов в структурах кожных пептидов амфибий. Программа должна по заданной последовательности пептида автоматически определять целевые z-ионы, в которых Leu/Ile находятся на С-конце. Идентификация изомерных Leu/Ile должна проводиться по наличию w-ионов, образованных потерей изопропильного (43,055 Да) или этильного (29,039 Да) радикалов из этих целевых z-ионов. Программное обеспечение (ПО) создано на языке программирования С++ с использованием MS ToolKit. Оно работает с *.mzML-файлами — универсальным форматом протеомных файлов на основе XML. Помимо заданной последовательности пептида в программе задаются возможные ПТМ или другие модификации. В настоящее время программа находится на стадии отладки (обкатки, апробации).