Молекулярные основы фотозащитных механизмов цианобактерий: исследование взаимодействия между каротиноидальными белками и фикобилипротеинамиНИР

Photoprotection mechanism in cyanobacteria: interaction between carotenoid proteins and phycobiliproteins

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 29 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Молекулярные основы фотозащитных механизмов цианобактерий: исследование взаимодействия между каротиноидальными белками и фикобилипротеинами
Результаты этапа: Проект направлен на исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе фотозащитных реакций цианобактерий. Эти реакции включают фоторегулируемое образование комплекса антенны – фикобилисомы с каротиноидным белком, энергетические взаимодействия между хромофорами антенны и каротиноидом, приводящие к переносу энергии электронного возбуждения и диссипация поглощенной энергии в тепло. Наш научный коллектив, наладил научные контакты с группой исследователей из КНР, успешно выполняющей разработку биотехнологических способов получения фикобилипротеинов. В рамках работ 1 года проекта, в соответствии с планом, были выполнены работы по изучению структурных и спектрально-временных характеристик компонентов фикобилисомы. Для выполнения задач проекта были получены препараты фикобилисом, ядер и стержней фикобилисом из дикого типа Synechocystis sp. pcc 6803 и нескольких мутантов. Благодаря обмену опытом с коллегами из Китая были налажены методы получения рекомбинантных препаратов фикоцианина, аллофикоцианина и укороченного варианта терминального эмиттера флуоресценции (ApcE). Рекомбинантные белковые препараты были охарактеризованы с помощью стандартных биохимических методик и использованы в серии экспериментов для изучения процессов преобразования энергии в цианобактериальных пигмент-белковых комплексах. Используя рекомбинантные белковые препараты, нативные фикобилисомы и их фрагменты, а также дикий тип Synechocystis и ряд мутантов, были проведены эксперименты по изучению влияния ОСР на энергетические взаимодействия фикобилисомы с фотосистемой 2. Для этого нами был разработан подход, позволивший установить зависимость эффективного сечения поглощения ФС2 от количества фикобилисом и их состава в клетке. ОСР-зависимое тушение снижает эффективное сечение поглощения ФС2 примерно на 30 %, за счет сокращения времени жизни возбужденных состояний ключевых фикобилиновых пигментов, участвующих в переносе энергии на хлорофилл фотосистем. Однако, по своей величине эффект от ОСР-зависимого нефотохимического тушения не сопоставим с полным устранением фикобилисом или даже фикоцианиновых стержней. Возможным объяснением наблюдаемых эффектов является относительно низкая скорость переноса энергии возбуждения на каротиноид в составе ОСР по сравнению со скоростью переноса энергии на хлорофилл реакционных центров. Иначе говоря, ОСР может предотвратить образование активных форм кислорода в ФБС отсоединенных от фотосистем, однако не обеспечивает полной остановки переноса энергии на реакционные центры фотосистем и, соответственно, не может предотвратить их фотоповреждение на свету высокой интенсивности. Основные результаты исследований легли в основу статьи, опубликованной в 2021 году в журнале BBA Bioenergetics. В рамках проекта была разработана и модернизирована установка для для регистрации мгновенных спектров флуоресценции, работающая в режиме время-коррелированного счета фотонов. При использовании возбуждения в ИК-области (750-780 нм) нами были впервые получены мгновенные спектры антистоксовой флуоресценции фикобилисомы и ее составляющих. Низкая энергия квантов, используемых для возбуждения антистоксовой флуоресценции, значительно ниже энергии перехода S0-S1 основных пигментов фикобилисомы, поэтому в возбужденное состояние S1 переходят только те пигменты, которые находятся на возбужденных колебательных подуровнях основного электронного состояния за счет энергии окружающей среды (kT). Показано, что форма спектра антистоксовой флуоресценции обусловлена комбинацией эмиссии аллофикоцианина и в значительно меньшей степени фикоцианина. При этом полностью отсутствует перенос энергии возбуждения от фикоцианина на аллофикоцианин. Таким образом, кинетическая схема процессов преобразования энергии в антенных комплексах при коротковолновом возбуждении становится значительно проще, что открывает новые возможности для изучения взаимодействия фикобилисомы с ОСР. Исследование свойств индивидуальных компонентов фикобилисомы с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии с возбуждением в ИК позволило обнаружить короткоживущие состояния хромофоров фикоцианина и аллофикоцианина. Вероятно, такие состояния возникают за счет конформационной подвижности хромофоров фикобилпротеинов, влияющих на планарность сопряженной π-системы электронов фикобилина. Вероятно, также что такая конформационная подвижность возникает при нарушении белок-белковых контактов между субъединицами фикобилипротеинов и линкерных белков. Это подтверждается в модельных экспериментах в которых нами было нарушено нативное олигомерное состояние фикоцианина за счет внешних воздействий. Роль таких состояний, вероятно, может быть связана с диссипацией энергии. Для изучения процессов преобразования и диссипации энергии в фикобилипротеиновых антенных комплексах, взаимодействующих с каротиноидными белками, нами был разработан план установки для регистрации спектрально-временных характеристик флуоресценции единичных молекул в режиме MDF-PIE. За счет комбинации конфокальной микроскопии и время-разрешенной детекции единичных фотонов метод позволяет получать информацию о концентрации и коэффициентах диффузии флуорофоров в растворе, аналогично флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS), однако отличается тем, что позволяет одновременно детектировать времена жизни возбужденных состояний и эффективность переноса энергии возбуждения. Мы планируем использовать данную установку для экспериментов на комплексах фикобилисом с ОСР в ходе дальнейших этапов проекта.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Молекулярные основы фотозащитных механизмов цианобактерий: выделение комплекса ОСР и фикобилисомы
Результаты этапа: 1. Отработаны методики и выделение ФБС и комплексов ФБС с фотосистемами. В результате выделения получены препараты в необходимых количествах для выполнения структурных и функциональных исследований. 2. Проведены эксперименты по регистрации мгновенных спектров флуоресценции комплексов ФБС с различным возбуждением флуоресценции (Стоксовая и антистоксовая). С помощью методов корреляционной флуоресцентной спектроскопии на единичных комплексах исследована гетерогенность состояний ФБС и их комплексов. Выделенные препараты ФБС с фотосистемами охарактеризованы с помощью методов позволяющих оценивать скорость восстановления первичных акцепторов электронов. 3. Проведены исследования структуры нативных и рекомбинантных фикобилипротеинов, в условиях индуцирующих появление короткоживущих возбужденных состояний хромофора, с помощью методов малоуглового рассеяния рентгена (SAXS). Получены структуры с низким пространственным разрешением. 4. Отработаны и методы пробоподготовки и получения электронных микрофотографий комплексов ФБС. Основной задачей является сохранение целостности нативного комплекса ФБС. Для этого опробованы несколько методик, в том числе использованы сетки с дополнительной подложкой из ультра-тонкого углерода. 5. С помощью оптических методов, в том числе спектроскопии единичных молекул изучена конформационная подвижность хромофоров фикобилипротеинов в составе белковой матрицы в различных условиях.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Молекулярные основы фотозащитных механизмов цианобактерий: исследование структуры комплекса ОСР-фикобилисома
Результаты этапа: Цианобактерии играют важную роль не только в поддержании экосистем, в настоящее время они являются перспективным объектом биотехнологий, как в качестве источника биомассы и специфических биомолекул, так и перспективного экологически чистого источника энергии. В рамках проекта совместно с нашими коллегами из Китая мы изучаем фотозащитные механизмы цианобактерий, которые снижают эффективность фотосинтетических процессов в условиях повышенной освещенности, а, следовательно, и вероятность продуцирования активных форм кислорода. Механизм основан на регуляции передачи энергии от светособирающих антенн (Phicobolisome, PBS) к фотосистеме оранжевым каротиноидным белком (Orange Carotenoid Protein, OCP). Под действием интенсивного облучения он переходит из неактивного оранжевого состояния в красное, которое при взаимодействии с фикобилисомой принимает энергию электронного возбуждения ее пигментов на молекулу каротиноида, после чего избыточная энергия рассеивается в тепло. Дезактивация OCP, приводящая к восстановлению фотосинтетической активности, ускоряется белком FRP (Fluorecence Recovery Protein, FRP), что обеспечивает быструю реакцию цианобактерий на изменения условий среды. Местом взаимодействия OCP с PBS считается зона ядра, однако конкретный сайт взаимодействия долгое время оставался неизвестным, как и механизм миграции энергии от пигментов ядра PBS на каротиноид OCP. Механизмы регуляции нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом были изучены и уточнены в рамках данного проекта. С начала проекта мы развиваем возможности применения антистоксовой флуоресценции, (эмиссия коротковолнового фотона при возбуждении более длинноволновыми квантами), для изучения фикобилисом и их взаимодействия с OCP. Такой подход упрощает интерпретацию результатов, так как исключает из рассмотрения самые многочисленные пигменты стержней, поглощающих в более коротковолновой области спектра. Одним из результатов третьего года работ стало подтверждения гипотезы, объясняющей передачу энергии от пигментов ядра фикобилисомы на каротиноид OCP за счет их прямого контакта, который формируется из-за встраивания N-домена OCP между аллофикоцианинами ApcA и ApcE. Такие выводы были сделаны на основе сравнения антистоксовой флуоресценции PBS и комплекса PBS-OCP. Ранее на примере фикобилипротеинов мы показали, что величина длинноволнового сдвига максимума антистоксовой флуоресценции относительно обычной зависит от гетерогенности конформационных состояний хромофоров, которое является следствием их большей подвижности в белковой матрице и взаимодействия с растворителем. При добавлении OCP сдвиг увеличивается с доли нм до 20 нм, что говорит о появлении подвижной популяции хромофоров, в следствии уменьшения стабильности PBS. Результаты экспериментов опубликованы в журнале BBA – Bioenergetics (https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2023.149014). Еще одной проблемой, решенной на третьем году проекта, является построение достоверной согласованной модели фотоиндуцированных переходов OCP и взаимодействия его интермедиатов с FRP. Применяя абсорбционную и флуоресцентную спектроскопию с временным разрешением, мы установили, что регуляторные взаимодействия происходят в начале фотоцикла. Взаимодействуя с компактным оранжевым состоянием OCP, FRP полностью предотвращает возможность разъединения доменов OCP и формирования активного состояния, взаимодействующего с антенной. Структурным элементом, препятствующим связыванию FRP и образованию комплекса, является короткий α-спиральный участок в начале N-концевого домена OCP, который маскирует основной сайт связывания в C-концевом домене OCP. Мы определили скорость открытия этого сайта и показали, что он остается открытым даже после релаксации красных состояний OCP. Было показано, что регуляция FRP не ограничивается прекращением взаимодействия OCP с фикобилисомой и ускорением его релаксации, но и позволяет предотвращать появление этих самых состояний, способных тушить флуоресценцию. Наблюдения переходов ОСР в миллисекундном временном диапазоне показали, что релаксация оранжевых интермедиатов фотоцикла сопровождается усилением взаимодействия кетогруппы каротиноида с донором водородной связи Tyr-201. Результаты экспериментов опубликованы нами в журнале The Journal of Physical Chemistry B (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.2c07189). До настоящего момента хорошо изученным являлся только один представитель семейства белков OCP – OCP1. Недавно открытые OCP2 и OCP3 изучены не так хорошо. В ходе проекта мы получили первые две кристаллические структуры OCP2, которые завершили палитру структур всех семейств OCP (OCP1, OCP2 и OCP3). Благодаря этому стало возможным проведение исследования и сравнения их спектроскопических и функциональных свойств. В частности, мы определили, что вибронная структура, характерная для OCP2, возникает вследствие наличия лишь одной водородной связи кольца каротиноида с Tyr201, тогда как вторая связь с Trp288, характерная для OCP1 и OCP3, отсутствует, что сказывается также на ускорении перехода OCP в красную форму. В структуре OCP3, напротив, помимо двух классических водородных связей была обнаружена халькогенная с метионином-251. Ранние исследования демонстрировали отсутствие взаимодействия OCP2 с FRP, однако нам удалось заметить контрпродуктивный эффект при добавлении к нему FRP, заключающийся в замедлении релаксации активированного состояния. Еще одна общая закономерность заключается в необходимости образования солевого мостика на поверхности контакта OCP-PBS для образования стабильного комплекса. В структуре OCP1, OCP3 и некоторых представителей OCP2 за это отвечает аргинин-155, его замена на глутамин и приводит к снижению эффективности тушения флуоресценции такими представителями семейства, как TolyOCP2 и GcapOCP2. Результаты экспериментов были опубликованы нами в журнале International Journal of Biological Macromolecules (https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813023047736?via%3Dihub). OCP-зависимый механизм фотозащиты цианобактерий не является единственным, еще один механизм (State transition) зависит от локализации самой антенны возле фотосистемы 1 или фотосистемы 2 и изменения потока электронов по цепи переносчиков. Мы обнаружили что два процесса, направленных на уменьшение эффективности фотосинтетического процесса, происходят независимо и State transition начинаются примерно через 10 с после начала световой адаптации клеток цианобактерий. Так же, мы показали важность ядерного компонента фикобилисомы – ApcD для протекания State transition. Результаты этой работы опубликованы нами в Photosynthesis Research (https://doi.org/10.1007/s11120-023-01019-9) Обобщенным результатом работ третьего года проекта стало уточнение многих, ранее неизвестных, но важных механизмов и взаимодействий, приводящих к регуляции фотосинтетической активности цианобактерий. Кроме того, предложенные подходы и методики могут быть применены для оценки стабильности фикобилипротеинов, как продуктов биотехнологии, а глубокое понимание фотоцикла оранжевого каротиноидного белка может открыть новые возможности его использования в оптогенетике.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".