| 1 |
20 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. |
Армированные структуры трохофорных животных: гистогенез радулы и спикул брюхоногих моллюсков |
| Результаты этапа: • Изучение рипидоглоссной радулы. В результате первого года работы над проектом были получены научные результаты по строению, закладке и формированию рипидоглоссной радулы брюхоногих моллюсков на примере двух видов, относящихся к подклассу Vetigastropoda (Puncturella noachina и Margarites helicinus) и одного вида подкласса Neritimorpha (Nerita litterata). Проведен сравнительный анализ оригинальных и литературных данных, подготовлено три статьи, две из который опубликованы, третья «The rhipidoglossan radula: radular morphology and formation in Nerita litterata Gmelin, 1791 (Neritimorpha, Neritidae)» - проходит рецензию в журнале Journal of Morphology. Рипидоглоссная радула состоит их большого количества зубов в поперечном ряду, который образован центральным, латеральным и очень длинными маргинальными зубами. Этот тип радулы (часто вместе с челюстью) обеспечивает подметание органических частиц и является исходным типом питания для брюхоногих моллюсков. Такая радула встречается в трех подклассах гастропод (ветигастроподы, неритиморфы, гетеробранхии) и, вероятно, является плезиоморфной для разных групп брюхоногих моллюсков, включая гетеробранхий. Согласно литературным данным, радулярный мешок у всех ветигастропод разделен на два рога. Наши исследования цитологического строения зоны формирования радулы ветигастропод (по одной из гипотез, базальной группы гастропод) показывают унифицированное строение и формирование рипидоглоссной радулы. В рогах формируются длинные маргинальные зубы, а более короткие латеральные и центральный формируются на перешейке. Для всех гастропод характерна агрегация одонтобластов (клеток, синтезирующих зуб) в группы, количественно соответствующих количеству зубов в поперечном ряду, таким образом, один ряд зубов формируется более или менее одновременно. Однако форма одонтобластов, их количество и тип секреции меняется в зависимости от типа радулы. Одни признаки являются адаптивными, а другие – демонстрируют высокий филогенетический сигнал. Для маргинальных зубов ветигастропод были показаны уникальное расположение и форма одонтобластов. Это клетки округлой формы, выстроенные в ряд вдоль всей длины зуба. Одонтобласты теряют связь с базальной мембраной, формируют стратифицированный эпителий. Радула Nerita litterata (приложение 2, рис. 1) из другого подкласса Neritimorpha также несет большое количество длинных маргинальных зубов в одном ряду, однако внешнего разделения зоны формирования на два рога не выявлено. Наши исследования показали ряд ультраструктурных особенностей, связанных как с удлиненными зубами, так и с большими линейными размерами самой радулы. У Nerita litterata есть внутреннее разделение зоны формирования на две половины, где так же, как и у ветигастропод, формируются маргинальные зубы, так же стратифицированным эпителием. Количество одонтобластов, образующих отдельный зуб, у Nerita litterata значительно выше, чем у исследованных ветигастропод, что, скорее всего, является следствием гораздо большего абсолютного размера радулы в целом и отдельных зубов в частности. Адаптивные характерные особенности зоны образования рипидоглоссной радулы связаны с увеличением секретируемой поверхности при формировании очень длинных зубов в широкой радуле. К ним относится появление внешнего (ветигастроподы) или внутреннего (неритиморфы) разделения зоны формирования на два рога. Следствием адаптации к образованию очень длинных маргинальных зубов также является появление стратифицированного эпителия, синтезирующего маргинальные зубы.
• Изучение тениоглоссной радулы Caenogastropoda. За этот год был собран необходимый материал для начала исследования развития и закладки радулы в онтогенезе Lacuna pallidula. Предварительные исследования развития показали, что на стадии постторсионного велигера радула уже довольно длинная, содержит полный набор зубов в ряду (7, что характерно для всех тениоглоссных радул) (приложение 2, рис. 2). Личинки на стадиях, близких к торсиону, зафиксированы и залиты в смолу. Основным результатом по изучению формирования радулы взрослых животных является сбор половозрелых экземпляров, и заливка материла в смолу. Были изготовлены две серии поперечных срезов через голову, и две серии срезов радулярного мешка половозрелых животных. Предварительные исследования закладки радулы Buccinum undatum показали, что радула личинок не отличается от радулы взрослых животных. Также на стадии постторсионного велигера радула уже имеет взрослые очертания (приложение 2, рис. 3). Основываясь на полученных данных составлен план изучения закладки и формирования буккального комплекса B. undatum на следующий год. Собранные кладки Admete viridula содержали некоторое время в аквариумах, наблюдая за поведением велигеров. Развитие, вероятно, долгое, поскольку за неделю наблюдения не происходило видимых изменений. Исследования окрашенных велигеров на неполимеризованный хитин не показали присутствия хитиновых структур в буккальной полости на всех стадиях (приложение 2, рис. 4), из чего можно сделать предварительный вывод о том, что у Admete, не имеющих радулы, она не закладывается вовсе. Этот факт нуждается в подтверждении, поэтому велигеры Admete на разных стадиях были зафиксированы и залиты для детальных цитологических исследований.
• Изучение радулы Heterobranchia. Основным результатом изучения закладки радулы в онтогенезе двух видов гетеробранхий с разными жизненными стратегиями (Limacina helicina (планктонный велигер) и Limapontia senestra (прямое развитие в кладке)) является сбор и первичная обработка материала для гистологических исследований. Получение основных результатов запланирован на следующий год. Данные гистологических исследований радулярного мешка трех видов голожаберных моллюсков с разными радулами (Cadlina laevis, Dendronotus elegans, Onchidoris muricata) показали наличие общего паттерна в формировании радулы: вне зависимости от количества зубов в поперечном ряду (приложение 2, рис. 5-6); у представителей гетеробранхий один зуб синтезируется группой немногочисленных (от 1 до 5 клеток на 1 группу) крупных одонтобластов, что существенно отличается от формирования зубов рипидоглоссной радулы. Вероятно, это является общим паттерном закладки радулы для всех гетеробранхий. Данные по строению буккального комплекса и формированию радулы Cadlina laevis получены в полном объеме для публикации, результаты в процессе оформления для статьи с рабочим названием «Formation of buccal armature of Cadlina laevis (Nudibranchia, Gastropoda)».
• Изучение строения челюстей Eunicida (Oenonidae (Drilonereis filum) и Lumbrineridae (Scoletoma fragilis). Полихеты семейства Oenonidae представляют очень большой интерес для анализа строения и эволюции челюстного аппарата современных и ископаемых Eunicida. Характерные для энонид челюсти прионогнатного типа широко представлены в ископаемых материалах (сколекодонты) Кембрия и Ордрвика. В то же время, энониды очень редкие черви, биология которых остается совершенно неизвестной. Нет никаких данных о характере роста возможной смене челюстного аппарата у этих червей. В результате проекта были получены новые данные по ультратонкому строению челюстного аппарата, которые показали необычное строение челюстей, пронизанных микровиллями. Тем не менее такое строение укладывается в схему трех основных типов тонкого строения челюстей аннелид предложенной в работе Ворцепневой и др. (Vortsepneva et al., 2014). Исследование серийных ультратонких срезов задней части вентрального фарингеального органа (VPHO) D. folum показало, что длинные парные, широко расставленные друг от друга пластинки carriers располагаются на вентральной стороне медианной инвагинации вентрального фарингельного органа и образованы гнатоэпителием, располагающимся соответственно на этой вентральной стороне. Это означает, что положение этих carriers в морфологическом плане соответствует таковому carriers лабидогнат и симмертогнат (Paxton, 2009), хотя в отличие от коротких и широких carriers этих семейств (Eunicidae, Onuphidae, Lumbrineridae), правые и левые части carriers энонид неподвижны относительно друг друга и не складываются как книжка, при раскрытии MI (Dorgan, 2020).
Полученные данные по строению челюстей Scoletoma fragilis показали, что челюсти состоят из изогнутых в трех плоскостях массивных первых максилл, которые функционируют как «щипцы», которые для того чтобы раскрыться должны быть повернуты на 90 градусов, что происходит за счет складывания широких и коротких carriers как книжка, с перегибом на вентральной стороне. Наши данные подтверждают мнение Wolf (1980) и Dorgan (2020) о существовании специальных мышц – сгибателей carriers. Они располагаются на дорсальной стороне медианной инвагинации VPHO. Максиллы и мандибулы представляют собой массивные утолщения кутикулы, при этом в равной степени сильно развит эпикутикулярный слой, а также базальный слой, инкрустированный склеропротеинами (электронно-плотные участки). Внутреннего базального минерализованного слоя без развитой решетки коллагеновых волокон, характерного для челюстных пластинок Eunicidae и Onuphidae (Vortsepneva et al, 2016) не обнаружено. Таким образом весь челюстной аппарат Scoletoma представляет собой систему челюстных пластинок, соединенных между собой более или менее толстой кутикулой. Важно отметить, что во всех случаях гнатоэпителий, подстилающий максиллярные пластинки обладает хорошо развитым синтетическим аппаратом. Это позволяет поставить вопрос о том, что максиллы люмбринерид не сменяются как у других групп Eunicida (Paxton 2009), а растут всю жизнь. Полученные данные поддерживают высказанную авторами проекта гипотезу о трех основных паттернах строения челюстных образований у современных и ископаемых представителей отряда Eunicida.
• Изучение зон кальцификации радулы и спикул. Данные по изучению квалификации радулы Testudinalia testudinalis показали, что кальций откладывается в радулярной мембране в местах крепления зуба, сам зуб минерализируется кремнием и железом, причем распределение неравномерное, кремний составляет центральную часть зуба, железо – коронку (приложение 2, рис. 8). В результате эксперимента по отложению кальция в спикулах Onchidoris muricata (приложение 2, рис. 9), показано, что кальцификация спикул активно происходит у особей размером от 1 до 4 мм (осевшие ювенили) в краевых зонах спикул. Менее интенсивно сигнал кальцеина так же детектируется по всей поверхности спикул. Кальцификация спикул у «взрослых» особей практически не происходит. Таким образом можно предположить, что формирование и закладка спикул происходит на самых ранних стадиях, а укрепление и минерализация на более поздних стадиях, в то время как у взрослых животных спикульный состав постоянный, а сами спикулы не растут. Эти данные нуждаются в верификации, дополнительные исследования запланированы на следующей год.
• Изучение строения ринофора Onchidoris muricata. Были получены новые данные по строению ринофора Onchidoris muricata, на основании которой предложен механизм сжатия ринофора. Эти данные представлены в публикации «New data on nudibranchs rhinophore morphology and their spicule complex in Onchidoris muricata (Doridina, Gastropoda)». Ринофоры – головные парные чувствительные сособные к сокращеню придатки, которые укреплены субэпидермальными кальцитовыми спикулами, по внешней морфологии отличающиеся от спикул стенки тела. Спикулы формируют сложно устроенную сеть «колодцем». Каркас сети сложен рядами спикул, ассоциированными со складками ринофора и смещенными относительно друг друга по окружности. Спикулы образуют плотные скопления с мышцами и нервами ринофора. При сокращении ринофора спикулы складок встраиваются между спикулами центральной части каркаса, таким образом общая спикульная сеть ринофора становится шире, но при этом компактнее в продольной оси. Не смотря на внешние отличия, спикулы ринофора, как и спикулы стенки тела, формируются внутриклеточно в склероците. Полученные данные являются основой для изучения регенерации ринофора и спикул в нем.
• Регенерация ринофора Onchidoris muricata. В летний сезон был отработан эксперимент по регенерации ринофора O. muricata и выстроен ряд морфологических изменений во время регенерации (приложение 2, рис. 10-11). Основные точки: затягивание раны (1 сутки), формирование регенеративной почки (24–36 часов), увеличение линейных размеров регенерата, восстановление мышц, нервов. Первые спикулы детектируются на 5 день после ампутации. Спикулы, образующиеся в регенерате имеют более рыхлую внутреннюю структуры, чем нормальные спикулы. Расположение спикул в регенерирующем ринофоре напоминает их локализацию в здоровом ринофоре, однако для более детального описания необходимы дополнительные исследования, включая трехмерную реконструкцию, изучения цитологического строения на ТЕМ и с помощью cLSM, а также анализ отложения кальция в спикулах регенерирующего ринофора.
• Поиск генов-кандидатов. В результате предварительного анализа имеющихся транскриптомов Testudinalia testudinalis, Onchidoris muricata, Pseudopotamilla reniformis были найдены гены хитинсинтазы (приложение 3). Подробности приведены в разделе 1.3. Сведения о фактическом выполнении годового плана работы.
|
| 2 |
1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. |
Армированные структуры трохофорных животных: молекулярные основы минерализации радулы и спикул брюхоногих моллюсков, щетинок аннелид |
| Результаты этапа: 1. В результате работы над проектом были получены оригинальные данные по строению взрослой радулы гастропод, а также закладке и формированию радулы в онтогенезе для нескольких видов. В результате были сделаны обобщения формирования и закладки радулы в онтогенезе. Радула гастропод невероятно разнообразна по своей морфологии и функционированию. Общие закономерности закладки радулы едины для всех групп, тем не менее существуют существенные цитологические различия строения зоны формирования в разных филогенетических ветках, которые включают в себя особенности общей топографии зоны формирования, количество одонтобластов и мембранобластов, участвующих в синтезе радулы. Исходя из полученных данных можно сделать следующие обобщения:
• Личиночный радулярный мешок, который закладывается в раннем онтогенезе как выпячивание вентральной части личиночной передней кишки. Радулярный мешок малоклеточный, состоит из недифференцированных однотипных клеток с микровиллярной секрецией. Во всех клетках есть базальные тельца, остаточное явление от ранее ресничной выстилки личиночного буккального эпителия. Малоклеточное строение личиночного мешка не несет филогенетического сигнала, а скорее отражает его личиночное состояние.
• Наоборот, состав зубов личиночной радулы, вероятно, может нести филогенетический сигнал, поскольку для представителей разных групп, описана разная конфигурация зубов в поперечном ряду, что можно объяснить гетерохронией, которая заключается в том, что личиночная радула не отражает предковое состояние, а соответствует конфигурации радулы половозрелых моллюсков. Особенно хорошо это отслеживается на малозубых радулах ценогастропод и гетеробранхий. Широкие (например, рипидоглоссные) радулы не могут сразу закладываться на стадии велигера в полном составе зубов в поперечном раду из-за ограничения линейный размеров, но тем не менее происходит закладка всех типов зубов.
• Клеточная дифференцировка в радулярном мешке происходит постепенно при переходе от личиночного ко взрослому состоянию радулы. Одонтобласты, синтезирующие зуб взрослой радулы существенно отличаются от клеток, выстилающих радулярный мешок. Мембранобласты похожи на одонтобласты и разделить их возможно только по расположению в радулярном мешке и по тому, какую часть радулы (мембрану или зубы) они синтезируют. Таким образом в большинстве случаев функционально можно их считать одной группой клеток.
• Разнообразие одонтобластов, синтезирующих разные радулы заключается в изменении линейных размеров. Этот признак несет четкий филогенетический сигнал.
• Кроме филогенетических трендов в строении одонтобластов, есть и адаптивные особенности внутри группы. Размер одонтобластов может оставаться на личиночном уровне у радул мелких гастропод с небольшими зубами, и наоборот, существенно увеличиваться для синтеза крупных зубов. Это хорошо прослеживается в группе ценогастропод и гетеробранхий.
• Формирование многорядного эпителия в зоне формирования маргинальных зубов рипидоглоссной радулы ветигастропод и неритиморф – это специализация, связанная с формированием крайне длинных зубов, и вероятно, является конвергенцией. Тот факт, что практически все клетки в зоне формирования ветигастропод имеют базальные тельца, а дифференцировка эпителиев в зоне формирования слабая, наводят на мысль, что зона формирования радулярного мешка ветигастропод сохранила личиночные черты. Вероятнее всего исходным состоянием формирования радулы гастропод было состояние слабой дифференцировки эпителиев в мешке и формирование одного зуба небольшим количеством клеток (около сотни), как при формировании центрального и латеральных зубов рипидоглоссной радулы ветигастропод или тениоглоссной радулы ценогастропод. Формирование докоглоссной радулы пателлогастропод при этом кажется более специализированным, поскольку одонтобласты сильно модифицированы.
• Дифференцировка субрадулярного и супрарадулярного эпителия не имеет филогенетического сигнала. Клетки имеют разную форму и цитологическое строение, в соответствии с функционированием (минерализация, участие в формировании финальной формы зуба, поддержание формы радулярного мешка и т.п.)
• В зоне формирования, кроме специализированных клеток с высокой синтетической активность, есть пул недифференцированных клеток способных к митотическому делению, которые, по всей вероятности, восполняют отработанные одонтобласты и мембранобласты.
2. Проведенный анализ данных по глоточному вооружению голожаберных моллюсков дорид выявил основные пути эволюции группы. В результате анализа были выявлены ключевые эволюционные события и анцестральные признаки строения буккального вооружения голожаберных моллюсков Dorida:
• Буккальное вооружение в эволюционной истории было потеряно один раз у представителей надсемейства Phyllidioidea (Рис. 1; 2).
• Анцестральное состояние буккального вооружения у всех Doridina: широкая (>50 зубов в поперечном ряду) симметричная радула, латеральные зубы серповидные гладкие или с зубчиками, маргинальные зубы отсутствуют, есть вентро-латеральная лабиальная кутикула (Рис. 2).
• Наиболее близкое к анцестральному состоянию строение буккального вооружения выявлено у представителей групп Bathydoridoidea, Cadlinidae и Cadlinellidae (Рис. 1).
• В эволюционной истории Doridina один раз произошёл переход от всеядности к питанию губками (подкласс Demospongiae) (Рис. 3), одна группа (Aegiridae) затем перешла к питанию кальциевыми губками, также два раза произошёл независимо переход к питанию мшанками и асцидиями (в группах Onchidoridoidea и Polyceroidea) (Рис. 4).
• В связи с переходом к питанию объектами, не относящимися к губкам, в группах Onchidoridoidea и Polyceroidea буккальное вооружение имеет строение, резко отличное от анцестрального состояния (Рис. 1):
У представителей Onchidoridoidea узкая радула (до 30 зубов в поперечном ряду), появляются маргинальные зубы (в количестве меньше 10) прямоугольной или треугольной формы с зубчиками.
У представителей Polyceroidea радула узкая, но шире, чем у Onchidoridoidea (количество зубов в поперечном ряду может достигать 50), имеется большое количество маргинальных зубов (обычно больше 10) вертикальной прямоугольной формы без зубчиков.
Также для представителей обоих подклассов характерна физическая асимметрия радулы (правый и левый полуряды смещены друг относительно друга).
• Физическая асимметрия радулы также проявляется функционально. Вероятно, в процессе питания мшанками или асцидиями лучше, когда левая и правая половины радулы работают независимо друг от друга. В пользу функционального значения асимметрии также говорит то, что у представителей Polyceroidea и Onchidoridoidea, перешедших от мшанок и асцидий к питанию другими объектами (например, иглокожими, моллюсками или многощетинковыми червями), физическая асимметрия радулы выражена слабее или вовсе отсутствует.
3. Были получены основные данные по закономерностям формирования челюстей Scoletoma fragilis. По данным СЭМ и КТ, общая морфология челюстей (количество пластинок, их форма) постоянна у червей разного размера. Ни у одной особи не было обнаружено признаков недавней смены челюстей, как это описано для представителей некоторых других семейств отряда (Рис. 5).
Рамановская спектроскопия показала, что челюсти S. fragilis минерализованы кальцитом (как максиллы, так и мандибулы), что подтверждает данные статьи Colbath, 1986, о минерализации челюстей эуницид, полученные другим методом (Рис. 6).
Изучение тонкой морфологии челюстей на ТЭМ позволило выяснить особенности строения различных слоев видоизмененной челюстной кутикулы, а также выделить несколько типов строения челюстных пластинок в зависимости от их расположения, размера и предполагаемой нагрузки (Рис. 7, 8). Были выявлены принципиальные различия в тонком строении челюстных пластинок у ювенилей и у взрослых червей, а также предложена гипотеза о возможном механизме их непрерывного роста.
4. В результате морфологических исследований Onchidoris muricata в эпителии были найдены кандидаты предшественников спикул. Гипотетические предшественники локализованы в базальной части эпителия, заполнены мелкозернистом содержимым подобным коллагеновым волокнам в вакуоли склероцитов, часто образуют инвагинации в субэпидермальное пространство (Рис. 9-10). Подготовлена публикация “Role of epithelium in nudibranch spiculogenesis case on Onchidoris muricata”. Получены дополнительные сведения о строении эпителия ринофоров первой размерной группы и ноги первой и третьей размерной групп.
Изучение регенерирующих ринофоров методом микротомографии выявило ограничения метода, размер новообразующихся спикул не соответствует разрешающей способности прибора, поэтому основной метод изучения – световая и электронная микроскопии.
5. Проанализированы транскриптомы трех размерных групп Onchidoris muricata, получены первичные данные о дифференциальной экспрессии генов (Рис. 12). Собран дополнительный материал Onchidoris muricata. Выделена РНК трех размерных групп с помощью тризола в трех повторностях каждая. Пробы отправлены на секвенирование. Ожидается получение сиквенсов для увеличения выборки в дифференциальном анализе. В результате анализа транскриптома трех размерных групп Onchidoris muricata выделена карбоангидраза, участвующая в минерализации (Рис. 12). Подготовлен зонд на ген карбоангидразы Onchidoris muricata. Подобраны условия для in-situ гибридизации на трех размерных группах, отработан протокол (Рис. 13).
6. Анализ строения радулярного мешка Testudinalia testudinalis gпозволил определить зоны для отбора на транскриптом. Материал отослан на секвенирование. Проведенные эксперименты по in situ гибридизации показали сродство краски в хитиновой радуле, что не позволило определить сигнал от зонда на хитин-синтазу (Рис. 14). Очевидно, этот метод не может использоваться для выявления экспрессии генов в этом варианте протокола и необходима его существенная модификация. Для выявления дифференциальной экспрессии генов в радулярном мешке был отобран дополнительный материал.
7. СБОРКА ГЕНОМА. Первичная оценка размера генома Pseudopotamilla reniformis при помощи проточного цитофлуориметра не дала точных результатов, а запланированное покрытие генома было недостаточно для создания адекватной сборки. Для иллюстрации полученных результатов приводится статистика наилучших геномных сборок (таблица 2). Анализируя статистику можно заключить, что полученная сборка не может адекватно отражать геномную организацию вида P. reniformis и нуждается в переработке и уточнении (Рис. 16). Видно, что количество получившихся контигов слишком велико, при этом множество консервативных однокопийных генов отсутствует в сборке. Для решения существующей проблемы необходимо получить новые данные, со средним покрытием более 60 для длинных прочтений и 80 для коротких прочтений. Более того, возможно, высокая гетерозиготность и возможная полиплоидизация организма могут существенно ухудшать качество итоговой сборки, а значит эти вопросы должны быть рассмотрены в первую очередь.
В результате а транскриптома P. reniformis был получен хороший референсный транксиптом. Дифференциальная экспрессия генов в участках роста, средней части параподии и зоны выпадения щетинок, достоверно показала разный уровень экспресии, что свидетельствует о значительных отличиях в процессах в этих зонах.
|
| 3 |
1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. |
Армированные структуры трохофорных животных: общие закономерности формирования в развитии и регенерации |
| Результаты этапа: 1) В завершающем году проекта были получены результаты по морфологии и развитию глоточного вооружения двух видов: Admete viridula (Neogastropoda) и Limapontia senestra (Heterobranchia).
По итогам прижизненных наблюдений Admete viridula было описано поведение моллюсков и движение их хобота в илистом грунте. Длинный и тонкий хобот содержит много одноклеточных желез, может превышать длину раковины в 1,5-2 раза и сильно сокращаться за счет тонких продольных мышечных волокон стенки хобота и более мощного ретрактора. Буккальная масса смещена к кончику хобота вместе с протоками длинных парных слюнных желез. Радулы обнаружено не было. Кладки A. viridula прозрачные кожистые, с двумя килями. Появляются, начиная с середины июля, на верхушках домиков аннелиды Pectinaria hyperborea, обитающей в том же биотопе. Ротовое отверстие закладывается довольно рано, ещё на стадии трохофорной личинки. Никаких признаков радулы или зачатка радулярного мешка в развитии обнаружено не было, что свидетельствует о том, что радула не закладывается в онтогенезе.
Согласно результатам исследований развития моллюсков вида Limapontia senestra, радула закладывается на вентральной стороне буккальной полости на стадии позднего велигера (11 день после оплодотворения), до выхода ювенильных особей из кладки. Радулярный мешок состоит из небольшого числа слабо дифференцированных секреторно активных клеток с хитосомами в апикальной части. Один зуб радулы L. senestra, так же, как и у других представителей Heterobranchia, секретируется небольшим количеством одонтобластов с помощью микровиллей. Зуб личиночной радулы L. senestra формируется без внутренней полости, при этом у взрослых особей зуб представляет собой уже полую структуру, куда заходят одонтобласты, что напоминает строение буккальных крючьев крылоногих моллюсков рода Clione.
2) По проведенному анализу было реконструировано анцестральное состояние пищедобывательного аппарата Cladobranchia и выявлены ключевые события в эволюционной истории группы: 1) Для групп, расположенных базально на филогенетическом дереве Cladobranchia, характерна радула с 5 и более зубами в поперечном ряду. Латеральные зубы или представлены узкими лезвиями с зубчиками и без (представители клады Dendronotida), или серповидные гладкие (Tritonioidea, Arminoidea, Proctonotoidea); 2) Для представителей надсемейства Proctonotoidea также характерен рудиментарный рахидальный зуб и отсутствие скульптуры на жевательном крае; 3) Анцестральное состояние радулы для клады Aeolidida следующее: радула узкая (3 зуба в поперечном ряду), средней длины, симметричная. Рахидальный зуб хорошо развит, имеет подковообразную форму. Латеральные зубы треугольные, с зубчиками; 4) Для представителей подотряда Cladobranchia пищевые предпочтения являются филогенетически значимым признаком, при этом общий предок всех Cladobranchia предпочитал в качестве пищевых объектов различных представителей Hydrozoa (Goodheart et al., 2017). Основной характерной тенденцией у голожаберных моллюсков подотряда Cladobranchia является усиление роли центрального зуба в процессе питания и, соответственно, его преимущественное развитие. При этом латеральные зубы могут редуцироваться полностью. Это в корне отличает представителей Cladobranchia от голожаберных моллюсков другого подотряда— Doridina — у которых латеральные зубы имеют большее значение в процессе питания, чем центральный, и развиты гораздо лучше.
3) Сравнительно-морфологический анализ челюстей гастропод показал, что челюсти присутствуют во всех подклассах брюхоногих моллюсков, за исключением Neritimorpha. Обычно челюсти расположены в буккальной полости латерально или дорсо-латерально напротив рабочего края радулы, что говорит о высокой потенции буккального эпителия формировать челюсть по всему периметру буккальной полости и заставляет задуматься о гомологии челюстных образований внутри всей группы трохофорных животных. Полученные в результате этой работы данные по ультратонкому строению позволили впервые определить основные паттерны синтеза и возобновления челюстей (Рис. 14). Все челюсти, вне зависимости от локализации и функции, синтезируются специализированным буккальным эпителием — гнатоэпителием. Основная характеристика клеток гнатоэпителия — это хорошо развитый синтетический аппарат. По своему ультратонкому строению они схожи с одонто- и мембранобластами, без базальных телец. Основной тип секреции — микровиллярный; 2) Простая (однородная) челюсть формируется складкой гнатоэпителия. Латеральные части челюсти, погружены в эпителиальные складки, а наращивание челюсти идёт от заднего конца к переднему, обращённому в буккальную полость; 3) Составная челюстная пластинка (из родлетов) формируется отдельными клетками гнатоэпителия, при этом каждый гнатобласт формирует одну единицу челюсти. Таким образом, гнатоэпителий, синтезирующий верхний слой, характеризуется постоянной синтетической активностью, как и мембранобласты, а гнатобласты, которые формируют родлеты, характеризуются периодической синтетической активностью, как и одонтобласты. Это аналогичные процессы, но вполне вероятно, что механизм периодического выключения синтеза зубов радулы и родлетов челюсти имеет единую природу. На основании анализа клеточного состава зоны активного синтеза радулы были выявлены основные типы клеток, а также предложен путь клеточной дифференцировки (Рис. 15).
4) Основная часть работы, посвященная тонкому строению челюстей Scoletoma fragilis была проведена в предыдущем году. В результате анализа данных по тонкому строению челюстей S. fragilis был предложен механизм роста челюстей. Согласно этому механизму, в разных участках челюстного аппарата рост челюстей происходит по-разному. Ювенильные челюсти состоят из склеропротеинов, пронизанных живыми микровиллями, и способны расти как в толщину, так и интеркалярно. У взрослых червей наблюдается дифференцировка челюстных пластинок на жесткие и эластичные. Жесткие минерализованные пластинки не способны к вставочному росту и могут только утолщаться и нарастать по краям. Возможность вставочного роста сохраняется в зонах, так называемой, «фестончатой склеротизации», лишенных минерализованного слоя.
Анализ литературных данных по тонкому строению челюстей отряда Eunicida показал, что челюсти люмбринерид в целом укладываются в общий паттерн, но при этом имеют и уникальный тип челюстных пластинок – «зоны фестончатой склеротизации». Плезиоморфным для группы (и, вероятно, для всех аннелид) можно считать план строения ювенильных челюстей.
5) На основании дополнительных экспериментов по регенерации ринофоров Onchidoris muricata с удалением его верхушки и трех складок, клавуса и ринофора целиком была выбрана модель для детального изучения регенерации методом ТЭМ – полностью удаленный ринофор. Показано, что спикулы формируются de novo. На ранних стадиях в основании регенерата наблюдаются многочисленные деления клеток, а также большое количество вероятно недифференцированных амебоидных клеток. В эпителии регенератов найдены икс-клетки — предшественники склероцитов. На более поздних стадиях в регенерате формируются структурные триады, состоящие из спикулы, нервов и мышц.
6) Был проведен анализ дифференциальной экспрессии генов. Показано, что в первой группе O. muricata (ювенили после метаморфоза) идут активные процессы сплайсинга и процессинга РНК, ее транспорт, что свидетельствует о высокой активности процессов трансляции, а также фолдинг белков. Вторая группа (ювенили до половозрелости) в отличие от моллюсков первой группы демонстрирует высокий уровень процесса синтеза и протеолиза белков внеклеточного матрикса. Наблюдается высокий уровень транскриптов таких белков как коллаген, фибриллин, матрилин и нидоген. В группе 3 (половозрелые особи) в отличие от первой и второй групп преобладают транскрипционные факторы, в том числе связывающиеся с ДНК специфично последовательности, а не коровые компоненты транскрипционной машины. Это свидетельствует об активном процессе дифференцировки и определения судьбы клеток. Проведена дополнительная whole mount in situ гибридизация (WMISH) на ранних ювенилях O. muricata. Показана активная экспрессия карбоангидразы в мантийной борозде особей. Данные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о закладке спикул в мантийном эпителии O. muricata, подобно закладке раковины и других армированных структур моллюсков.
7) При дифференциальном анализе экспрессии генов радулы Testudinalia testudinalis было применено два подхода. Первый подразумевает попарное сравнение зон радулы, второй – сравнение разных зон с ногой, который позволяет выявить транскрипты, специфичные для той или иной зоны радулы. В результате первого подхода были выявлены оверэкспрессирующиеся гены в разных участках радулы. В первой зоне (формирования) радулы экспрессируются хитинхсвязывающие гены, потом гены хитиназы и NOTCH-сигналинга. Если говорить о биологических процессах, то в первой зоне в топе экспрессии будет деление клеток, репликация ДНК, митотическое деление клеток и только потом уже катаболизм хитина, а далее дифференцировка нервов и коммитирование клеток (ограничение возможного пути дифференцировки клеток). Был проведен анализ всех транскриптов (около 50), которые входят в группу, участвующую в клеточном делении. Согласно этому анализу показано, что в зоне 1 оверэкспрессируются около 10 генов, участвующих в делении, в отличие от других зон (зоны созревания и минерализации). Также в зоне 1 экспрессируются гены, участвующие в клеточной дифференцировке и нейронной дифференцировке. Менее сильно, то также значимо показана экспрессия генов WNT, отвечающих в том числе за контроль пролиферации, дифференцировки, направленного движения клеток, поддержания стволового состояния клеток, генов SLIT и NOTCH. Показанная оверэкспрессия этих генов отражает общие процессы, которые описаны для зоны формирования радулы, а именно постоянное возобновление клеточного состава разных типов клеток из одного пула недифференцированных плюрипотентных клеток (Рис. 15). Во второй зоне (созревания) в топе экспрессированных генов оксидоредуктазная активность и связывание хитина. В этой зоне происходит формирование и созревание зубов. Оксидоредуктазная активность наиболее вероятно связана с началом минерализации зубов, при котором трехвалентное железо переходит в состояние двухвалентности, необходимое для создания основного вещества зубов моллюска – гетита. Также для второй зоны характерна экспрессия генов, участвующих в катаболизме целлюлозы. В третьей зоне экспрессируются гены, кодирующие трансмембранные транспортеры, обмен моноамилов, рецепторы к каннабиноидам, что может свидетельствовать о нейронной активности. В этой зоне происходит биоминерализация и транспортеры принимают активное участие в переносе минералов сквозь клетки.
8) При анализе корреляции образцов параподий Pseudopotamilla reniformis можно заметить, что образцы из соседних реплик (реплик из одной зоны) хорошо коррелируют между собой, при этом корреляция между зоной выпадения и роста наименьшая. Данные результаты, во-первых, отражают представленную схему эксперимента (Рис. 8), а во-вторых, отражают биологическую сущность проведенного эксперимента.
При анализе характера экспрессии в разных зонах невроподии можно несколько важных особенностей (Рис. 10). Во-первых, выделяется достаточно большое количество генов, экспрессия которых повышена в зоне роста, но при этом существенно снижена в зоне выпадения. С другой стороны, существует также группа генов, экспрессия которых наоборот повышена в зоне выпадения, но не в зоне роста. Промежуточная зона представляет собой своеобразный буфер, который позволяет проследить изменение экспрессии между зонами выпадения и роста.
Представленный набор дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) можно кластеризовать и выделить в нём определенные группы генов, которые представляют особый интерес (Рис. 11). Так, хорошо выделяется кластер генов, которые экспрессируются либо в зоне роста, либо в зоне выпадения. |
