ИСТИНА

Проект направлен на разработку универсальных миниатюрных носимых электроанализаторов для задач персонализированной медицины. Вектор развития медицинских технологий сегодня задан, с одной стороны, стремлением к построению диагностического процесса с учетом объективных показателей состояния организма, с другой стороны, цифровизацией. При этом особый акцент делается на разработку и внедрение неинвазивных диагностических протоколов. Таким образом, электронные устройства непрерывного химического анализа экскреторных жидкостей человека (например, пота, конденсата выдыхаемого воздуха, слезы) сегодня особенно востребованы. Такие устройства могут применяться на всех этапах медицинской помощи – от выявления трендов изменения биохимических показателей до совершенствования диагностики, лечения и реабилитации пациента. В Проекте будет реализовано носимое устройство-анализатор пота, обеспечивающее непрерывную регистрацию уровня метаболитов. В качестве аналитов будут рассматриваться лактат (содержание в поте 5-80 ммоль/л) и глюкоза (содержания в поте 20-200 мкмоль/л). Сочетание высокой чувствительности с широким диапазоном определяемых концентраций, охватывающим физиологические содержания, и высокой операционной стабильностью будет обеспечено использованием сенсорных систем на основе биомиметиков и прогрессивных схем обработки сигнала, специально разрабатываемых для использования в биологических жидкостях. В рамках Проекта будут заложены научные основы применения миметиков пероксидазы на основе гексацианоферратов переходных металлов как более надежного и эффективного трансдьюсера в биосенсорах на основе оксидаз. Снижение диффузионных ограничений за счет использования наноструктурированного материала позволит увеличить чувствительность биосенсоров и расширить динамический диапазон определяемых концентраций. Помимо каталитических миметиков, в Проекте будут разработаны синтетические аналоги абзимов на основе самодопированного полианилина. Включение в проводящую цепь рецепторного остатка борной кислоты позволит пролонгировать диапазон рН-стабильности полимера в область нейтральных или слабощелочных сред. Для контроля зарядовых состояний и атомной координации поверхности биомиметиков наряду с электрохимическими методами в Проекте будут широко применяться физические методы исследования, такие как методы рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, ультрафиолетовой спектроскопии, ядерного магнитного резонанса, спектроскопии комбинационного рассеяния, подходов спектроэлектрохимии. Исследование поверхности биомиметиков в зависимости от потенциала, химического состава и рН среды позволит установить механизмы отклика биосенсорных покрытий на их основе. Рецепторные биомиметики будут использованы в качестве трансдьюсеров, сочетающих в себе селективность аффинных взаимодействий с операционной стабильностью. Кроме того, синтез материала путем электрополимеризации каталитически активных фенилборных кислот обеспечит принципиальную возможность катализа биохимических реакций на поверхности разработанных рецепторных миметиков. На основе каталитических и рецепторных миметиков будут реализованы ферментные и бесферментные биосенсоры, интегрируемые в электронные устройства непрерывного мониторинга метаболитов. Для реализации носимого устройства будет спроектирована микрокапиллярная система сбора и отвода пробы, обеспечивающая непрерывный анализ биологической жидкости и мгновенный (в момент экскреции) отклик системы на изменение концентрации метаболита. Детектирование электрохимического отклика биосенсоров будет осуществляться с точностью до 0.1 нА с использованием специально спроектированного контроллера, сочетающего применение многослойных схем, чип-компонентов минимального форм-фактора и существующей компонентной базы с возможностями программирования сигналов и процессорной предобработки данных. В результате будет создано миниатюрное носимое устройство (габариты до 50х25х15 мм), обеспечивающее функции потенциостата, сбор и передачу данных о содержании аналита на мобильные устройства с энергонезавизимостью до 24 ч. Для «настройки» рабочего диапазона биосенсоров под состав пота будут использованы подходы иммобилизации ферментов в полимерные матрицы различного состава, мембранной делиминации, инженерии ферментов, а также их совместной иммобилизации с разрабатываемыми биомиметиками. Управление рабочим диапазоном биосенсора и повышение точности определяемых концентраций будет также осуществляться с использованием прогрессивных схем подачи и считывания сигнала: использования режимов генерации мощности, импульсных и потенциостатических режимов, а также постобработки сигналов как непосредственно на микроконтроллере, так и на мобильном устройстве. Выполнение Проекта позволит не только реализовать принципиально новое устройство мониторинга уровня метаболитов в поте человека, оптимизировав соотношение сигнал/шум и динамический диапазон устройства для задач кратковременного и длительного мониторинга, но и получить новые фундаментальные знания для создания электроактивных биомиметиков, содавая предпосылки для формирования нового научного направления - создания электротализаторов биохимических реакций. Междисциплинарность предлагаемых в проекте подходов позволит сочетать передовые исследования в сферах материаловедения, химической энзимологии, полимерной химии и схемотехники для создания высокоэффективных (био)сенсоров и носимых устройств на их основе. Разработка неинвазивных биохимических мониторов нового поколения и расширение функционала существующих электроанализаторов станет серьезным шагом к внедрению высоких технологий в сфере здравоохранения и переходу к персонализированной медицине.

The Project is aimed at development of a miniature wearable analyzer for personalized medicine. Cutting edge medical technologies rely upon timed diagnostics with monitoring of clinically relevant indicators of health status and digitalization. A special emphasis is placed on the development and implementation of non-invasive protocols. Thus, the electronic devices for continuous monitoring of bodily fluids (sweat, exhaled breath condensate, tears) are particularly demanded. Such devices can be used at all stages of medical care - from ambulatory monitoring of biochemical parameters to clinical diagnostics, treatment and rehabilitation. Within the Project a wearable sweat analyzer, providing continuous registration of metabolite levels, will be implemented. Lactate (typical sweat levels of 5-80 mmol/l) and glucose (typical sweat levels of 20-200 micromol/l) will be considered as analytes. The combination of high sensitivity with a wide range of detected concentrations (comprising physiological levels) and high operational stability will be ensured by the use of biomimetics and advanced signal processing circuits, specially designed for bodily fluids analysis. The Project provides the scientific background for the use of peroxidase mimics based on transition metal hexacyanoferrates which is the most reliable and efficient transducer for oxidase-based biosensors. The use of nanostructured catalyst is expected to diminish diffusion constraints resulting in increased sensitivity and expanded dynamic range of the biosensors. In addition to catalytic mimetics, synthetic analogues of abzymes based on self-doped polyaniline will be elaborated. Incorporation of boronic acid receptor into the conductive chain would allow to extent the pH stability of the polymer to neutral or slightly basic pH. Along with electrochemical characterization, a comprehensive physico-chemical investigation using X-ray photoelectron spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, nuclear magnetic resonance, Raman spectroscopy, and spectroelectrochemistry will be carried out in order to control the charge states and atomic coordination at the biomimetics surface. Biomimetics surface investigation depending on potential, chemical composition and pH will make it possible to establish the mechanisms of sensory response. Obtained biomimetics will be used as transducers, combining the selectivity of affine interactions with operational stability. Besides, electropolymerization of catalytically active phenylboronic acids is supposed to provide a principal possibility for catalysis of biochemical reactions onto the mimetics binding sites. Enzymatic and non-enzymatic electrochemical (bio)sensors based on catalytic and receptor mimetics will be elaborated and integrated into electronic devices for continuous metabolites monitoring. The wearable device will be equipped with the microcapillary sweat collection/ejection system, enabling continuous sweat flow and flash-response (simultaneous with excretion) towards the metabolite. The electrochemical response will be registered with 0.1 nA accuracy controller based on multilayer circuits, high-end low-power microchips and capable of signal programming and data processing. As a result, a miniature wearable device (dimensions below 50x25x15 mm) will be realized, providing the functions of a potentiostat, ADC, signal processor and transmitting data to mobile devices through low-consuming BLE 5.2 protocol within 24 hours of energetically autonomous work. To "tune" the operating range of biosensors the approaches of enzyme immobilization into polymer matrices of various compositions, membrane delimination, enzyme engineering, as well as co- immobilization with the developed biomimetics will be applied. The control over the biosensor dynamic range and the detection accuracy will be also provided with progressive signal processing and readout schemes, including power generation mode, pulse and potentiostatic modes, as well as software post-processing of signals both on the microcontroller and on a mobile device. The implementation of the Project will allow the development of principally new device for monitoring of sweat metabolites with tunable signal-to-noise ratio and the dynamic range for short-term and long-term monitoring, as well as collecting a new fundamental knowledge in electroactive biomimetics. This creates the prerequisites for the formation of a new scientific area - biochemical electrocatalysi. The interdisciplinary approaches combine the advances in the fields of materials science, enzymology, polymer chemistry and electronics for elaboration of highly efficient (bio)sensors and wearable non-invasive biochemical monitors. Those, we believe, will encourage a serious step towards the implementation of cutting-edge technologies in the healthcare sector and further transition to personalized medicine.

Этап 1. Синтез и физико-химическое исследование биомиметиков на основе электроактивных полимеров. 1.1. Электрополимеризация и оптимизация условий синтеза рецепторных покрытий и наночастиц, распознающих сахара и гидроксикислоты, на основе самодопированного полианилина, функционализированного остатком борной кислоты. Исследование электроактивности и проводящих свойств синтезированного материала в широком диапазоне рН электрохимическими методами (в том числе спектроскопии электрохимического импеданса, циклической вольтамперометрии, потенциометрии). 1.2. Синтез и физико-химическое исследование миметиков пероксидазы на основе электроактивных координационных полимеров гексацианоферратов переходных металлов. Сопоставительное исследование каталитической активности фермента и его миметика в присутствии различных гидропероксидов и восстанавливающих субстратов. 1.3. Исследование зарядовых состояний и атомной координации на поверхности рецепторных и каталитических биомиметиков методами рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, ядерного магнитного резонанса, спектроскопии комбинационного рассеяния, спектроэлектрохимии. Установление химической структуры и зарядовых состояний поверхности иммобилизованных биомиметиков в зависимости от прикладываемого потенциала и рН среды. 1.4. Установление механизма самодопирования рецепторного материала боронат-замещенного полианилина и его дополнительного допирования в присутствии полиолов и гидроксикислот в зависимости от условий. Выявление закономерностей генерации импедансометрических, амперометрических и потенциометрических откликов биосенсоров на его основе. 1.5. Разработка рецепторных материалов с молекулярными отпечатками (покрытий и наночастиц) с управляемой селективностью к метаболитам углеводного обмена. Исследование селективности биосенсоров на их основе в различных электрохимических режимах (хроноамперометрия, потенциометрия, спектроскопия импеданса). 1.6. Разработка микрокапиллярной системы подачи, протока и вывода экскреторной жидкости для непрерывного in situ мониторинга метаболитов в поте человека. Оптимизация материала корпуса и геометрии капилляра с учетом возможностей УФ-3D-печати. Сборка и программирование контроллера метаболитов для целей проекта. Проведение тестовых измерений по мониторинге метаболитов в поте в режиме генерации мощности. 1.7. Проектирование контроллера метаболитов. Изготовление печатных плат и монтаж компонентов. Проведение тестовых измерений в режиме генерации мощности. Ожидаемые результаты. В результате выполнения первого этапа Проекта будут синтезированы и комплексно исследованы (состав, структура, свойства) каталитические и рецепторные биомиметики на основе полианилинов и гексацианоферратов переходных металлов. Будут получены ключевые данные о химическом состоянии активных центров миметиков (координация, зарядовое состояние) в различных внешних условиях (рН, химический состав среды, потенциал), в том числе в присутствии целевых метаболитов. Разработанные биомиметики будут использованы в качестве трансдьюсеров для электрохимических (био)сенсоров. Ожидается, что помимо улучшения аналитических характеристик (за счет использования электрокатализаторов с рекордной активностью и применения методов темплатного синтеза) и расширения функционала биосенсорных платформ (за счет универсальности решений и возможности работы в различных электрохимических режимах), применение «искусственных» ферментов и рецепторов позволит увеличить стабильность (био)сенсорных устройств на их основе. На первом этапе Проекта будут выполнены подготовительные эксперименты по прототипированию и тестированию носимого анализатора метаболитов пота для дальнейшего таргетирования требований протока, миниатюризации и биосовместимости.

Настоящий проект является продолжением фундаментальных и прикладных исследований по созданию (био)сенсорных систем на основе координационных и проводящих полимеров, проводимых в лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУ. Заявитель принимает участие в этих исследованиях более 12 лет. Исследования относятся к приоритетным направлениям развития сенсорики и освещают принципиально новые подходы к разработке электроаналитических систем, в том числе для «умных» носимых устройств и задач медицинской диагностики. У научного коллектива имеется большой опыт работы в области синтеза функциональных материалов и создания на их основе биосенсорных диагностических устройств. Ранее заявителем синтезированы нанозимы «искусственная пероксидаза» с рекордными каталитической активностью и стабильностью. Разработаны методы электросинтеза проводящих полимеров и повышения их селективности путем создания покрытий с молекулярными отпечатками. Разработаны безреагентные системы электроанализа на основе «синтетических рецепторов». Для увеличения соотношения сигнал/шум и упрощения устройства регистрации сигнала предложен режим генерации мощности. С целью создания инструментов неинвазивной диагностики пульмонологических заболеваний, а также мониторинга состояний гипоксии разработаны системы для электроанализа выдыхаемого человеком аэрозоля и пота. Разработаны подходы к созданию мембранных материалов для контролируемого массопереноса и разделения.

В рамках Проекта заложены научные основы применения рецепторных и каталитических миметиков как более надежных и эффективных трансдьюсеров в биосенсорных устройствах. Для создания электрохимических (био)сенсоров нового поколения в Проекте предложено использовать «синтетические рецепторы» на основе проводящих полимеров, сочетающих в себе селективность аффинных взаимодействий с возможность прямого переноса электрона. В качестве таких рецепторных материалов рассмотрены боронат-замещенные самодопированные полианилины и полимеры азиновых красителей. С целью упрощения производства миметиков и дальнейшей модификации ими электродов предложены подходы электросинтеза коллоидных полимерных наночастиц (включая электрополимеризацию наноструктур полианилина с молекулярными отпечатками лактата). Для создания бесферментных сенсоров использованы рецепторные миметики на основе боронат-замещенного полианилина. С одной стороны, остаток борной кислоты способен обратимо и селективно связываться с сахарами и гидроксикислотами, выступая в качестве «синтетического рецептора». С другой стороны, проводящие свойства полимера обеспечивают преобразование химического сигнала в электрохимический. В соответствии с данными спектроскопии ЯМР, РФЭС, вольтамперометрии и спектроскопии импеданса, предложена универсальная схема допирования рецепторного материала, в рамках которой остаток борной кислоты выступает в качестве центра диссоциации воды, обеспечивая постоянное протонирование иминных/аминных мостиков полианилина, тем самым расширяя область рН-стабильности рецепторного материала до рН 11 и, в противовес незамещенному аналогу, обеспечивая его применимость для анализа в физиологических средах. Показано, что диссоциация полиолов, включая глюкозу и лактат, на остатке борной кислоты сопровождается дополнительным протонированием цепи и обратимым редокс-превращением полимера. Продемонстрирована возможность протекания (электро)каталитических реакций с участием метаболитов на поверхности рецепторных миметиков. С использованием рецепторных наночастиц поли(метиленового зеленого) разработаны глюкозные биосенсоры нового поколения на основе пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы с рекордной для этого фермента эффективностью прямого биоэлектрокатализа. Помимо высокой площади поверхности для эффективного транспорта электронов между кофактором адсорбированного фермента и электродом, такие наночастицы несут фрагменты наиболее эффективного ко-субстрата фермента и имеют высокое сродство к его активному центру. Для разработанных биосенсоров соотношение предельных электрокаталитических токов прямого переноса электрона и электрокатализа в присутствии диффузионно-подвижного медиатора достигает рекордно высоких значений до 50%, что в 10 раз превосходит эффективность прямого биоэлектрокатализа для известных биосенсоров на основе проводящих наноструктур. Включение фермента в прямой биоэлектрокатализ обеспечивает высокую эффективность биосенсора при низких потенциалах и позволяет использовать его в режиме гальванической ячейки. Биосенсоры на основе прямого биоэлектрокатализа глюкозодегидрогеназами впервые использованы для прямого анализа неразбавленного пота. Установлено, что относительное изменение концентрации глюкозы в поте добровольцев, включая больных сахарным диабетом, коррелирует с данными референсных измерений, а разработанные биосенсоры могут выступать в качестве нового инструмента неинвазивной диагностики состояний гипо/гипергликемии. С целью замены ферментов и создания более стабильных/функциональных (био)сенсорных систем осуществлен химический синтез каталитических миметиков пероксидазы на основе гексацианоферрата железа. Изменения структуры миметика в ходе редокс-превращения исследованы in situ с использованием дифракции синхротронного излучения. С использованием подходов стационарной кинетики установлено, что миметики не только активнее пероксидазы хрена, но и более селективны по Н2О2. Высокая (электро)каталитическая активность синтезированных структур позволила использовать их в качестве трансдьюсеров Н2О2 в биосенсорах для детекции метаболитов углеводного обмена. С целью нательного мониторинга метаболитов биосенсоры интегрированы в компактные микроэлектронные устройства, сочетающие функции сбора и доставки пота человека к поверхности электрода, электроанализа в режиме гальванической ячейки и беспроводной передачи сигнала на мобильное устройство. Осуществлено прототипирование носимого электроанализатора метаболитов с учетом эргономичности, форм-фактора и необходимости непрерывного обновления анализируемого раствора на поверхности (био)сенсора. В Проекте впервые уделено внимание соотношению вкладов конвекции, диффузии и электродной кинетики в токовый отклик нательных (био)сенсоров. Исследованы их чувствительность и точность в зависимости от гидродинамических условий. Установлено, что при низких скоростях потока отклик может быть ограничен как по аналиту (за счет снижения концентрации вещества в диффузионном слое), так и по продукту (за счет неэффективного отвода продукта/его адсорбции на поверхности миметика). Для описания сигнала сенсора в зависимости от скорости потока раствора с учетом конкурентного взаимодействия аналита и продукта с активными центрами электрокатализатора предложена модель, в которой соотношение диффузионной и конвективной компоненты учитываются введением числа Пекле. Показано, что наиболее выраженная зависимость отклика (био)сенсоров от скорости потока наблюдается в области смены диффузионного и кинетического режимов. Исследованы закономерности скорости локального потоотделения человеком в зависимости от условий (нагрузка/покой, до/после стимуляции потовых желез). Показано, что для корректной интерпретации сигналов проточных (био)сенсоров необходимо учитывать эффекты, ассоциированные с низкой/переменной скоростью экскреции пота. Для снижения колебаний отклика в условиях переменного потока разработан лактатный биосенсор на основе миметика пероксидазы с диффузионной мембраной. С целью минимизации эффектов, вызванных ограничениями по продукту и аналиту, и увеличения точности детекции метаболитов в условиях ограниченного массопереноса для (био)сенсоров реализован импульсный режим регистрации сигнала. Импульсная генерация тока осуществлена путем попеременного короткого замыкания и размыкания цепи рабочего электрода, модифицированного берлинской лазурью, и хлоридсеребряного электрода сравнения с помощью программируемого контроллера метаболитов. Установлено, что даже для биосенсоров на основе редокс-катализатора использование импульсного режима позволяет до 90 раз увеличить чувствительность к лактату/глюкозе и в 15 раз – соотношение сигнал/фон. Наряду с увеличением чувствительности, показана возможность увеличения операционной стабильности биосенсоров в ходе прямого мониторинга метаболитов в биологических жидкостях исключительно за счет использования импульсного режима. Импульсная регистрация также позволяет минимизировать влияние массопереноса на диффузионно-контролируемые реакции, что снижает зависимость сигнала от скорости потока. Устройства, сочетающие в себе предложенные технические и сенсорные решения, протестированы на добровольцах. Проведена апробация носимого электроанализатора для непрерывного мониторинга лактата в поте в ходе нагрузочных тестов. С помощью двух независимых носимых устройств на основе лактат-чувствительного сенсора с диффузионной мембраной и потокозависимого биосенсора осуществлен одновременный контроль уровня лактата и скорости выделения пота. Установлено, что показания устройств не зависят друг от друга, а концентрация лактата в поте не определяется интенсивностью потоотделения. Это подтверждает диагностическую ценность лактата в поте человека для контроля состояний гипоксии в ходе физических нагрузок. Осуществлен одновременный in situ мониторинг глюкозы в поте с помощью носимого электроанализатора пота с импульсной регистрацией сигнала, а также глюкозы в капиллярной крови и межклеточной жидкости больного сахарным диабетом. Динамика концентрации глюкозы в поте находится в хорошем соответствии с ее динамикой в капиллярной крови без временных задержек. Более того, показатели пота являются более быстрым индикатором изменения концентрации глюкозы в крови по сравнению с межклеточной жидкостью. Такие преимущества непрерывного анализа пота указывают на перспективность продолжения работ по созданию полностью неинвазивных мониторов-анализаторов пота для их дальнейшего внедрения.