| Результаты этапа: Проект посвящен изучению коэволюции многоклеточных организмов и ассоциированных с ними микробных сообществ методом экспериментальной эволюции. Мы провели исследование бактериального и дрожжевого компонентов микробиома в лабораторных линиях Drosophila melanogaster, адаптирующихся к кормовым субстратам с различным содержанием NaCl (0, 2, 4 и 7% NaCl, добавленного в стандартный корм), а также в освоенных мухами кормах. Общие закономерности одновременных изменений дрожжевого и бактериального компонентов микробиома дрозофил и их взаимное влияние столь подробно изучались впервые. Мы охарактеризовали бактериальный и дрожжевой микробиомы мух из 11 линий и 5 обжитых ими субстратов и сопоставили между линиями мух и между репликами структуру и состав данных компонент по обилию и разнообразию. Удалось выяснить, что с ростом концентрации NaCl быстро снижается доля потенциально полезных для дрозофил, но чувствительных к соли ацетобактерий (вплоть до полного исчезновения при 7% NaCl), а доля представителей рода Lactiplantibacillus, тоже потенциально полезных и более солеустойчивых, сначала растет, достигает максимума при 4% NaCl и резко снижается при 7% NaCl. При этой экстремальной солености в мухах резко возрастает доля менее типичных для дрозофил и потенциально патогенных бактерий Leuconostoc и Providencia. В целом увеличение концентрации соли в корме до 2% и далее до 4%, по-видимому, уменьшает разнообразие бактерий. При дальнейшем увеличении соли в корме до 7% структура и состав бактериальной микробиоты резко меняется, а ее разнообразие повышается.
Численность и разнообразие дрожжей в гомогентах мух минимальны при 0% NaCl и резко возрастают при 2–4%; доминирует вид Pichia occidentalis. При росте концентрации до 7% появляется новый доминант – Starmerella bacillaris, вид, помогающий дрозофилам выживать и размножаться на соленом корме. По-видимому, данный вид дрожжей маркирует начальный этап адаптации холобионта к повышенной солености.
Бактерии и дрожжи присутствуют не только в мухах, но и в освоенном ими корме. Между этими двумя резервуарами микроорганизмов существует постоянный обмен, опосредуемый жизнедеятельностью мух, а условия для жизни микробов в них, очевидно, различаются. Микробное население корма и живущих на нем мух существенно различается при минимальной (0%) и максимальной (7%) концентрациях соли, но сходно при промежуточных (2 и 4%).
Говоря о трансформации микробиома дрозофил в процессе их адаптации к разным концентрациям соли в субстрате, можно заметить, что при переходе к корму с 7% NaCl происходит резкое изменение доминантных и минорных компонентов как дрожжевого, так и бактериального микробиомов, возрастает их разнообразие, сообщество микроорганизмов в муха и на субстрате становится непохожим.
Кроме того, можно заключить, что между бактериальным и дрожжевым компонентами микобиома дрозофил существует некоторый антагонизм: в пробах с относительно высокой численностью и/или разнообразием дрожжей соответствующие показатели бактерий нередко понижены, и наоборот. Рост концентрации соли в корме способствует относительному благополучию дрожжевого компонента и отрицательно влияет на благополучие бактериального. В целом полученные результаты согласуются с гипотезой о том, что по мере роста солености корма положительное влияние бактериального компонента микробиома на адаптацию дрозофил снижается, а дрожжевого – растет.
Мы показали, что в ходе адаптации макроорганизма-хозяина к меняющимся условиям ассоциированная микробиота также подвергается отбору и может существенно влиять на фенотипические признаки хозяина. Микробиологические факторы могут играть очень важную роль в формировании различий по продолжительности жизни (ПЖ) между линиями. В пользу этого свидетельствуют результаты проведенных нами экспериментов.
Мы протестировали мух из разных лабораторных линий, в том числе мух с обедненным дрожжевым микробиомом и мух, подвергающихся искусственному отбору на позднее размножение, и показали, что эволюционные изменения ПЖ могут происходить не только и не столько за счет изменений в генофонде подопытной популяции макроорагнизмов (как предполагают классические эволюционные модели), сколько за счет изменений микробиоты, которая также подвергается отбору и может существенно влиять на ПЖ хозяина. Данный пример иллюстрирует «хологеномную» теорию эволюции, подтверждая, что единицей отбора в ряде случаев корректнее считать не индивидуальный организм, а холобионт, то есть комплекс, включающий макроорганизм и ассоциированную с ним микробиоту.
Из полученных результатов следует важный методологический вывод. В большинстве исследований, связанных с экспериментами на дрозофилах, микробиота мух игнорируется (или, по крайней мере, никак не контролируется), что может приводить к ошибочным выводам. Влияние микробиоты может быть настолько значительным, что на его фоне становится трудно выделить эффекты других факторов. Так, если бы мы ограничились простым сравнением ПЖ у контрольной (предковой) лини и линии, отбираемые на позднее размножение, то пришли бы к ошибочному выводу об очень высоком вкладе генов в формирование признака «продолжительность жизни» в целом и в эффективность отбора на долголетие в частности, и не выявили бы влияние других факторов, главным образом, микробиотических. Следовательно, в экспериментах на макроорганизмах необходимо учитывать возможное влияние ассоциированной микробиоты на различные фенотипические признаки организма-хозяина.
В течение первого года работы над проектом мы опубликовали одну статью и подготовили рукопись второй статьи для подачи в журнал, апробировали результаты на трех научных конференциях и рассказали о них на научно-популярном портале «Элементы большой науки». |
| Результаты этапа: В продолжение начатого в первый год исследования бактериальной и дрожжевой микробиоты лабораторных линий Drosophila melanogaster, адаптирующихся к кормовым субстратам с различным содержанием NaCl (0, 2, 4 и 7%), мы протестировали доминирующие компоненты микробиоты на устойчивость к соли. Наиболее чувствительным к содержанию NaCl в среде оказался вид бактерий Acetobacter pasterianus (90% снижения прироста клеток при 2% NaCl). Lactiplantibacilus plantarum оказался более устойчивым к повышенной солености, так как при 2% NaCl прирост клеток снижался лишь на 40%. Наиболее устойчивым к солености среды был Leuconostoc pseudomesenterioides, при 2% соли снижающий прирост клеток лишь на 22%, однако и его рост существенно снижался с увеличением солености среды, на 92% при 7% NaCl. При этом все обнаруженные в мухах виды дрожжей оказались осмотолерантными.
Это объяснило наблюдаемую (по результатам прошлогодних исследований) трансформацию микробного сообщества дрозофил по мере роста концентрации соли в корме, когда с ростом концентрации NaCl снижается доля потенциально полезных для дрозофил, но чувствительных к соли ацетобактерий (при 7% NaCl исчезают), а доля бактерий Lactiplantibacillus, потенциально полезных и более солеустойчивых, сначала растет, достигает максимума при 4% NaCl и резко снижается при 7% NaCl. При этой экстремальной солености типичные и потенциально полезные бактериальные доминанты в мухах замещаются потенциально патогенными бактериями Leuconostoc и Providencia. В то же время численность и разнообразие дрожжей в мухах минимальны при 0% NaCl и резко возрастают при 2–4%.
Данные по солеустойчивости бактерий и дрожжей объяснили также следующий интересный полученный результат. Число бактерий в 1 мухе по отношению к числу бактерий в 1 мг корма растет с увеличением концентрации соли. В варианте с 7% соли количество бактерий на 1 мг корма на три порядка меньше, чем количество бактерий на целую муху, общий вес которой как раз около 1 мг, а вес содержимого кишечника, соответственно, гораздо меньше. Мухи, живущие на соленом корме, дополнительно потребляют воду, поэтому соленость содержимого их кишечника ниже, чем соленость корма, это позволяет менее солеустойчивым бактериям развиваться в кишечнике. Аналогичное соотношение для дрожжей не растет с увеличением концентрации соли в корме: и при концентрациях соли от 2 до 7% в одной мухе содержится примерно столько же дрожжей, что и в 1 мг корма. Это согласуется с избирательным питанием мух дрожжевой биомассой, а также с более высокой толерантность дрожжей к содержанию соли в субстрате по сравнению с бактериями.
Для полноты картины логичным продолжением исследования, посвященного микробиоте, стало прояснение иных механизмов адаптации мух к соленой среде (среде с повышенной осмолярностью). Мы показали, что в ходе адаптации дрозофил к средам с различной соленостью происходит не только трансформация ассоциированного микробного сообщества, но также адаптируется и сам макроорганизм. Особое внимание мы уделили личиночной стадии мух, так как личинка развивается полностью погруженной в неблагоприятный субстрат.
Известно, что анальные органы (АО), расположенные на заднем конце тела личинки могут выполнять у двукрылых осморегуляторную функцию, регулируя поступление ионов из окружающей среды в гемолимфу, но не в обратном направлении. Мы исследовали морфологию (и особенно АО) личинок дрозофил, адаптированных и выращенных на корме с различным осмотическим потенциалом, а также заодно углублялись в понимание одного важного теоретического эволюционного вопроса – генетической ассимиляции приобретенного признака.
Анальные органы (AO) личинок дрозофилы используются в качестве классического примера для демонстрации фенотипической пластичности, поскольку они расширяются в условиях низкой осмолярности и сжимаются, когда личинки содержатся на корме с высоким содержанием соли. Конрад Уоддингтон (1953) экспериментально показал, что эти пластические изменения могут подвергаться генетической ассимиляции. Точнее, он утверждал, что адаптивное пластическое изменение размеров АО в условиях высокой солености стало наследственным после нескольких поколений содержания на корме с высоким содержанием солей. Более поздние попытки воспроизвести это дали неоднозначные результаты. Для прояснения этого вопроса мы изучили связанные с осмолярностью пластические изменения размеров АО у трех линий мух D. melanogaster, адаптированных к низкой, средней и высокой осмолярности в ходе длительного эволюционного эксперимента. Нам не удалось воспроизвести генетическую ассимиляцию пластических изменений размеров АО. При этом мы обнаружили, что норма реакции стала шире у линии мух, адаптированной к корму с низкой осмолярностью. У личинок данной линии АО имеют большую площадь в условиях низкой осмолярности и меньшую в условиях высокой осмолярности по сравнению с двумя другими экспериментальными линиями. Кроме того, мы сравнили тонкую структуру АО у трех линий мух с помощью окрашивания, сканирующей электронной микроскопии и микротомографии и выявили фенотипическую пластичность наноямок на поверхности АО, а также подтвердили редукцию слоя хлоридных клеток, подстилающих кутикулу АО у мух, адаптированных к более высокой осмолярности. Таким образом, адаптация к неблагоприятным условиям (корму с низкой осмолярностью) привела к эволюционным изменениям фенотипической пластичности, но направление этого изменения не укладывается в определение генетической ассимиляции Уоддингтона.
Чтобы разобраться, как микробиота может влиять на продолжительность жизни (ПЖ) дрозофил, мы оценили влияние дрожжевого симбиотического сообщества и отдельных его компонентов на параметры жизненного цикла мух из контрольной линии дрозофил и выведенной от нее линии с обедненной дрожжевой микробиотой. Когорты мух из этих линий тестировались либо на корме без живых дрожжей, либо на корме, засеянном одним из следующий видов дрожжей: Starmerella bacillaris, Zygosaccharomyces bailii и Saccharomyces cerevisiae. В эксперименте учитывалась возрастная динамика плодовитости и смертности мух в восьми вариантах теста. Влияние симбиотических дрожжей, ключевого источника пищи дрозофил, на параметры жизненного цикла незаслуженно обойдено вниманием исследователей и изучено хуже, чем влияние бактерий. Наш эксперимент позволил установить, что при культивировании мух на стандартном богатом корме снижение количества симбиотических дрожжей, как на субстрате, так на поверхности тела и в кишечнике мухи, ведет к росту средней продолжительности жизни и снижению плодовитости. Наблюдаемое согласуется с гипотезой «одноразовой сомы». При этом рост продолжительности жизни не компенсирует снижение плодовитости, поэтому снижение численности дрожжей ведет к снижению итоговой приспособленности мух. Подсев на корм дрожжей S. cerevisiae, редко встречающегося в естественной микробиоте дрозофил, смещает репродукцию контрольной линии на более ранний возраст, тогда как два других вида дрожжей, типичных для микробиоты мух, существенно повышают плодовитость. Подсев на корм дрожжей S. bacillaris и S. cerevisiae, не характерных для микробиоты тестируемых линий мух, снижает продолжительность жизни сильнее, чем дрожжи Z. bailii, типичные для микробиоты контрольной линии. Дрожжевая микробиота сокращает продолжительность жизни самцов примерно на треть, а самок лишь на 20%.
Анализ влияния дрожжей на параметры жизненного цикла дрозофил сопровождался изучением развивающейся микробиоты во всех вариантах эксперимента, что позволило прояснить вопрос о характере взаимодействия макроорганизма-хозяина с его дрожжевым сообществом, естественным и подсеянным. Перед началом эксперимента мы установили, что у контрольной линии дрожжевая микробиота присутствует и полностью состоит из типичного для дрозофил вида дрожжей Pichia occidentalis, а с «бездрожжевых» мух, содержащихся продолжительное время на корме с антимикотическим препаратом, дрожжевая микробиота не высевается. Через 7 недель после начала тестирования из всех вариантов эксперимента, описанного выше, были взяты образцы освоенного мухами корма. Один из основных и наиболее интересных результатов состоит в том, что в вариантах теста, где «бездрожжевые» мухи жили на корме с подсевом живых дрожжей, обнаружен не только вид дрожжей, внесенный на корм, но и дрожжи P. occidentalis, типичные для предковой линии Мн. Однако они не высеваются из бокса, где мухи данной линии тестируются на корме Н без подсева. Это позволяет с большой вероятностью утверждать, что на поверхности тела и/или в кишечнике «бездрожжевых» мух (полученных от контрольной линии путем содержания на корме с антимикотическим препаратом) могут сохраняться клетки дрожжей P. occidentalis в малоактивном состоянии. Жизнь на корме без подсева жизнеспособных дрожжей не приводит к активации их роста. Тогда как жизнь на корме с подсевом какого-либо вида живых дрожжей приводит к их активации. Нистатин является препаратом актиномицетного происхождения и подавляет рост грибов, в том числе дрожжевых. Механизм действия данного препарата основан на разрушении клеточных мембран, тогда как P. occidentalis является аскоспоровым видом дрожжей, и, вероятно, его аскоспоры в меньшей степени подвержены воздействию данного антибиотика, чем вегетативные клетки, и в его отсутствии способны дать начало размножению дрожжей, сохранившихся в виде спор.
Изучение подобных взаимосвязей организма-хозяина и микробиоты вносит важный вклад в развитие молодой, но набирающей обороты хологеномной эволюционной теории, согласно которой единицей отбора следует считать не отдельный макроорганизм, а холобионт - совокупность макроорганизма и ассоциированной с ним микробиоты.
В дополнение к запланированным результатам, благодаря коллаборации с коллегами из ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск), удалось протестировать наши уникальные линии дрозофил на двигательную активность и продолжительность сна с использованием установки DAMS (Drosophila Activity Monitoring System; «Trikinetics», Уолтем, Массачусетс, США) (TriKinetics: www.trikinetics.com). В тестировании участвовала контрольная линия, содержащаяся на стандартном корме, линия мух, отбираемых на позднее размножение, и мухи из линий, адаптированных к корму с солью (4% NaCl) и корму на основе крахмала.
Было обнаружено, что у мух, адаптированных к более продолжительной жизни и к жизни на неблагоприятных субстратах, двигательная активность реагировала на различное давление отбора сходным образом. Мухи выбранных линий стали более активными и менее сонными, чем контрольные мухи. Наиболее значительное повышение двигательной активности наблюдалось у мух крахмальной (короткоживущей) линии. Более того, было выяснено, что они могут изменить свой 24-часовой характер двигательной активности и сна, расширив интервал повышенной двигательной активности как на более раннее, так и на более позднее время суток. Повышенная локомоторная активность и сокращение сна могут быть связаны с компромиссом между параметрами приспособленности, частично компенсируя те из них, что находятся под давлением отбора. Данное исследование позволило показать, что мухи D. melanogaster могут быть удачной моделью для изучения потенциально благотворного воздействия характеристик 24-часового режима активности и сна на продление здоровой продолжительности жизни и успешную адаптацию к жизни в суровых условиях. |
