ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Цель исследования – поиск генов, ассоциированных с адаптацией к экстремальным местообитаниям у представителей сем. Ephydridae, а также поиск ортологичных генов в геномах дрозофил и их сопоставление для выявления следов отбора, способствовавшего адаптации.
Diptera insects have a huge taxonomic diversity (more than 160 thousand species (Zhang, 2013)), the diversity of ecological niches, and adaptation to various extreme environmental conditions. At the same time, the mechanisms of these adaptations are poorly studied, especially at the molecular level. Now the GenBank NCBI database contains only 219 dipteran genomes (for comparison, for 40 thousand vertebrates we have 1715 sequenced genomes). Flies of the numerous Ephydridae family (about 2000 species (Zatwarnicki and Kahanpää, 2014)) are adapted to the most unfavourable environmental conditions, from salt and alkaline bodies of water and hot springs to oil puddles (Foote, 1995). The objects of this study are the genomes of flies of the genus Ephydra: E. gracilis (inhabits lakes with the high salinity in North America), E. hians (syn. Cirrula hians, also known as "alkaline fly", inhabits alkaline lakes in the USA, Mexico and Canada) and E. riparia (inhabits Eurasia, and in Russia, it occurs in the Crimea on the Koyashskoe and Tobechikskoe salt lakes (Przhiboro, Shadrin, 2012) and on the White Sea). The aim of the study is to search for genes associated with adaptation of Ephydra flies to extreme habitats, as well as the search for orthologous genes in the genomes of Drosophila and their comparison to reveal traces of selection that contribute to adaptation. Now the genomes of only two shore flies living in America have been sequenced: E. gracilis and E. hians (genomes are assembled into scaffolds). The key task of our project is de novo sequencing of the E. riparia genome and its assembly. In addition, the transcriptome of this species is sequenced and assembled. Using the transcriptome, we functionally annotate the genome and carry out a search for candidate genes encoding proteins that probably contribute to the adaptation of E. riparia to unfavourable conditions (we assume that these may be genes associated with the cuticle of shore fly larvae, genes encoding LEA-proteins, heat shock proteins, aquaporins, metal-transport proteins, proteins included in the p38 and JNK MAPK signalling cascades, etc.). The found genes contributing to adaptation to extreme habitats are compared with homologous genes of Drosophila melanogaster. Comparison of the found genes with genes of Drosophila can be interesting and useful for two reasons: first, in the studies of our department (Dmitrieva et al., 2016; Yakovleva et al., 2016; Panchenko et al., 2017; Dmitrieva et al., 2019) and studies of other laboratories (Rose, Charlesworth, 1981; Te Velde et al., 1988; Archer et al., 2003; Phelan et al., 2003; Burke, Rose, 2009; Condon et al., 2014) is found that Drosophila in laboratory conditions can easily adapt to adverse conditions, including the substrate with increased salinity; secondly, the families Epydridae and Drosophylidae are closely related (McAlpine, 1989; Grimald, 1990); therefore, the pathways of adaptation can be largely similar. At the final stage of the study, we compare the E. riparia genome with the genomes of the shore flies E. gracilis and E. hians: the search for conservative and highly different regions in the genomes of three related species, adapted to stressful conditions, shed light on the nature of evolutionary processes occurring within the genus. As a result it is possible to conclude whether adaptations to environments with high salinity were acquired independently or the common ancestor already had the necessary adaptations. Thus, the scientific novelty of the research consists in the search for ways and mechanisms of acquiring adaptations to extreme habitats in poorly studied Ephydra genus (family Ephydridae) by methods of molecular biology, bioinformatics, and comparative genomics. According to the results of the study, for the first time, we receive the sequenced and assembled genome and transcriptome of the E. riparia species, as well as its functional annotation, which has great value for the scientific community, since the databases currently contain very few annotated insect genomes (mainly only for well-studied model organisms). In addition, we collect a pool of genes that probably allowed shore flies to adapt to stressful conditions and compare them with those of genes identified in the model and well-studied organisms. The fundamental importance of the project is that the results of the study shed light on the poorly studied, especially at the molecular level, issue of evolutionary biology about the diversity of ways and mechanisms of acquiring adaptations to stressful environmental conditions. The practical significance of the project is no less significant: the escalation of climat changes, invasive processes and the increasing technogenic pollution of the environment lead to dramatic changes in the habitat of organisms in many regions of the world, which should contribute to the acceleration of evolution rearrangements. Using the example of related extremophile insects and comparing them with other organisms known for their ability to adapt to stressful environmental conditions, we can assess the possible ways and potential of acquiring adaptations to such conditions.
По результатам исследования мы впервые получим отсеквенированные и собранные геном и транскриптом вида E. riparia, а также его функциональную аннотацию, что представляет большую ценность для научного сообщества, так как в базах данных в настоящее время содержится очень мало проаннотированных геномов насекомых (в основном только для хорошо изученных модельных организмов). Кроме того, мы сформируем пул генов-кандидатов, позволивших эфидридам приспособиться к стрессовым условиям и сравним с таковыми генами, выявленными у модельных и хорошо изученных организмов.
У коллектива имеется уже немалый задел по изучению генома E. riparia. В нашем распоряжении уже есть образцы полевого материала, необходимые для секвенирования транскриптома E. riparia. Геном нами отсеквенирован на платформе Illumina. Из парных коротких прочтений длиной 150 нуклеотидов произведена черновая сборка генома мухи (более подробная информация о них содержится в GitHub репозитории руководителя коллектива по адресу: https://github.com/Terraslavonica/E_riparia). Предварительные результаты сборки были представлены на конференции Bioinformatics: From Algorithms to Applications (BIATA'20) 27 июля 2020 г. в стендовом докладе Genome assembly and search for genetic markers of adaptation of shore flies (Diptera , Ephydridae) to extreme habitats. Однако качества и покрытия сборки не достаточно для ответа на поставленные в проекте эволюционные вопросы. Для этого необходимо отсеквенировать геном E. riparia длинными прочтениями и собрать ее транскриптом, что и запланировано в настоящем исследовании.
По результатам исследования нами впервые получены отсеквенированные и собранные de novo геном и транскриптом вида E. riparia. Транскриптом личинки, живущей в соленой воде, имеет высокое качество и полноту по BUSCO 98,3%, референсный транскриптом (на основе всех стадий развития мухи) имеет полноту по BUSCO 92,6%. Сборка генома содержит менее 40 тыс. контигов, её полнота по BUSCO более 98%, оцененный размер генома около 1Гб, такой геном для двукрылых считается большим. Собранные геном и транскриптом представляют ценность для научного сообщества, так как в базах данных в настоящее время содержится мало последовательностей, принадлежащих двукрылым (в основном для модельных организмов). Проаннотировав транскриптом, мы сформировали пул генов-кандидатов, позволивших эфидридам приспособиться к стрессовым условиям, и сравнили с таковыми генами, выявленными у модельных и хорошо изученных организмов. Для некоторых аквапоринов (из числа Entomoglyceroporins) свойственны линиеспецифические дупликации. Аналогичная эволюционная картина наблюдается для двух групп белков SLC транспортеров, у искомых белков дрозофилы есть паралоги, а наиболее близкие гомологи “GH21490p” и “salty dog” у E. riparia также претерпели линиеспецифичные дупликации. Данные примеры свидетельствуют о том, что адаптация к жизни в соленой воде, по-видимому, идет путем дупликации белков, задействованных в осморегуляции и транспорте ионов. В рамках «хологеномной теории эволюции» (Margulis, Fester, 1991) базовой единицей отбора считается не отдельный макроорганизм, а холобионт - совокупность макроорганизма и ассоциированной с ним микробиоты. Литературные данные свидетельствуют в пользу того, что микробиота адаптируется к меняющимся условиям среды вместе с организмом-хозяином и может помогать макроорганизму выживать в стрессовых условиях. Мы, как методом посева, так и путем секвенирования последовательностей ITS региона рДНК, изучили разнообразие и структуру ассоциированного с эфидридами дрожжевого сообщества (для видов E. riparia и P. fumosa (все стадии развития); имаго Thinoscatella quadrisetosa, Scatella tenuicosta, Coenia vulgata, Philotelma nigripennis) и сопоставили ее с дрожжевой микробиотой двукрылых из семейств Anthomyiidae, Sepsidae, Tabanidae, Sphaeroceridae, Dolichopodidae, Syrphidae и Caliphoridae, которые обитают в сходных с эфидридами биотопах и адаптированы к тем же стрессовым условиям. Микробиота эфидрид, как и микробиота Drosophila melanogaster значительно варьирует в зависимости от внешних факторов, но есть и виды дрожжей, которые обнаруживаются регулярно, хотя объясняется это скорее тем, что они обильно представлены на субстратах литорали Белого моря. Чтобы прояснить роль дрожжей, которые доминируют в посевах двукрылых, обитающих на литорали Белого моря, и протестировать гипотезу о том, что эти виды вносят вклад в адаптацию мух к стрессовым условиям среды, мы провели эксперимент на линиях D. melanogaster, содержащихся в нашей лаборатории. Ранее в нашей лаборатории было показано, что дрожжи, выделенные из мух, адаптированных к соленому корму, и засеянные на соленый корм повышают выживаемость личинок из неадаптированной линии на этом корме (Ivnitsky et al., 2019; Dmitrieva et al., 2019). Мы рассчитывали получить тот же эффект на дрожжах, выделенных из солоноводных биотопов и из мух, живущих в них. Эксперимент был проведен по уже отработанной в коллективе методике, описанной в статье Dmitrieva et al., 2019. На корм засевались дрожжи: Candida argentae (2 штамма) – вид частый и многочисленный на личинках E. riparia, Starmerella bombi – вид очень редкий, но относящийся к роду Starmerella, другой представитель которого оказывает заметное влияние на адаптацию наивных дрозофил к соленому корму и Saccharomyces cerevisiae - в качестве контроля. Ожидаемый эффект не воспроизвелся ни на одном из видов дрожжей. Давно известно, что личинки многих видов мух-береговушек адаптированы к жизни в воде с высокой соленостью, но о морфологических и физиологических основах такой адаптации известно немного. Чтобы прояснить этот аспект мы разработали протокол очистки личинок 3-го возраста мух E. riparia и P. fumosa (от глины, ила, слизи, бактериальных пленок и диатомовых водорослей), описали детали их морфологии и впервые получили их изображения с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). С помощью окрашивания нитратом серебра и СЭМ удалось впервые показать наличие у личинок обоих изучаемых видов функционирующих анальных органов (АО) – специализированных структур, выполняющих осморегуляторную функцию, а также изучить их строение. АО, по-видимому, вносят вклад в адаптацию личинок к повышенной солености. Проведено сравнение морфологии личинок изученных видов с другими изученными видами мух-береговушек, а также с личинками D. melanogaster, относящихся к сестринскому семейству Drosophilidae. Аналогичным образом проведено исследование личинок нефтяной мухи D. petrolei. На первом этапе разработана методика очистки личинок от нефти. На втором - внешняя морфология личинки изучена с помощью СЭМ. Впервые нами обнаружены у личинок этого вида анальные органы. Выявлено тонкое строение передних и задних дыхалец. Установлено, что дыхательная пластинка задних дыхалец устроена аналогично изученным ранее личинкам эфидрид E. riparia и P. fumosa, хотя сама дыхательная трубка более массивная и короткая. Тонкая структура передних дыхалец изучена впервые, изображения с СЭМ показывают, что они скорее напоминают передние дыхальца личинок P. fumosa, но окружены складкой, в которую дыхальца, по-видимому, могут вворачиваться, чтобы предотвратить попадание нефти. Личинка нефтяной мухи типична для эфидрид, но ее мускулатура развита гораздо сильнее, что позволяет ей передвигаться в плотной среде, при этом держаться на плаву в менее плотной среде (воде) личинка нефтяной мухи не может.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Поиск генетических маркеров адаптации мух-береговушек (Diptera, Ephydridae) к экстремальным местообитаниям |
Результаты этапа: Эфидриды, или мухи-береговушки, – семейство двукрылых, отличающееся высоким видовым разнообразием и насчитывающее около 2000 видов. Их разнообразие связано с чрезвычайно широким спектром адаптаций к самым различным средам, в том числе и экстремальным. Некоторые виды эфидрид являются, по-видимому, одними из самыми солелюбивых и солетолерантных среди насекомых, развивающихся в воде. Наша цель – выяснение путей и механизмов адаптации представителей сем. Ephydridae к местообитаниям в повышенной соленостью. На данном этапе мы уделили пристальное внимание изучению мух-береговушек Ephydra riparia и Paracoenia fumosa, являющихся типичными обитателями морских побережий. Они относятся к умеренно галофильным представителям эфидрид, и при этом они весьма галотолерантны, их личинки встречаются в прибрежных лагунах, мелких заливах и литоральных лужах. Материал для исследования собран на Белом море вблизи Беломорской биостанции МГУ имени Н.А. Перцова. Летом 2022 г. собраны личинки, куколки и имаго мух-береговушек E. riparia и P. fumosa, а также имаго других видов эфидрид: Thinoscatella quadrisetosa, Scatella tenuicosta, Coenia vulgata, Philotelma nigripennis и т.д. и мух семейств Anthomyiidae, Sepsidae, Tabanidae, Sphaeroceridae, Dolichopodidae, Syrphidae и Caliphoridae, которые обитают в сходных с мухами-береговушками биотопах и адаптированы к тем же стрессовым условиям с повышенной соленостью. Кроме того, были проведены поисковые исследования фауны мух-береговушек в окрестностях Звенигородской биологической станции МГУ им. С.Н. Скадовского. Давно известно, что личинки многих видов мух-береговушек адаптированы к жизни в воде с высокой, а иногда экстремально высокой соленостью, но о морфологических и физиологических основах такой адаптации известно немного. Чтобы прояснить этот аспект мы описали детали морфологии личинок 3-го возраста двух видов мух-береговушек E. riparia и P. fumosa (сем. Ephydridae) и впервые привели их изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). С помощью окрашивания нитратом серебра и СЭМ удалось впервые показать наличие у личинок обоих изучаемых видов анальных органов (АО) – специализированных структур, выполняющих осморегуляторную функцию и отвечающих за транспорт ионов из окружающей среды в гемолимфу личинки (но не в обратном направлении). Проведено сравнение морфологии личинок изученных видов с другими видами мух-береговушек из родов Ephydra, Paracoenia, Hydrellia, Coenia, а также с личинками модельного вида Drosophila melanogaster (сем. Drosophilidae). Особое внимание уделено морфологии АО, которые, по-видимому, вносят вклад в адаптацию личинок к повышенной солености. Мы выяснили, что у экстремально галофильных эфидрид АО либо вовсе отсутствуют, либо развиты слабо, в то время как у умеренно галофильных эфидрид сильнее развиты признаки, связанные с проницаемостью кутикулы АО и активным транспортом ионов. У пресноводных эфидрид эти признаки получают наибольшее развитие. Активность АО может варьировать за счет формы и площади АО, гладкости или сморщенности кутикулы и наличия наноямок на ней. Обнаруженная изменчивость, вероятно, является адаптивной, поскольку при высокой окружающей солености как проницаемость кутикулы АО, так и активный транспорт ионов из окружающей среды становятся менее полезными или даже вредными. В связи с особенностями образа жизни личинок изучаемых видов поверхность их тела покрыта глиной и илом, слизью, бактериальными пленками и диатомовыми водорослями, поэтому в процессе работы для изучения тонких морфологических структур мы отработали протокол очистки личинок мух-береговушек Ephydra riparia и Paracoenia fumosa от органических и неорганических загрязнений. Метод отмывки основан на сочетании использования пирофосфата, ультразвука и низких концентраций КОН, так как существующие в литературы протоколы отмывки водных (в том числе морских) беспозвоночных не дали желаемого результата. В рамках набирающей популярность «хологеномной теории эволюции» (Margulis, Fester, 1991) базовой единицей отбора принято считать не отдельный макроорганизм, а холобионт - совокупность макроорганизма и ассоциированной с ним микробиоты. Литературные данные свидетельствуют в пользу того, что микробиом адаптируется к меняющимся условиям среды вместе с организмом-хозяином и может в свою очередь помогать макроорганизму выживать в стрессовых условиях. Чтобы протестировать гипотезу о вкладе дрожжевой микробиоты в адаптацию мух-береговушек к жизни в соленой воде мы как методом посева, так и путем секвенирования нуклеотидных последовательностей ITS региона рДНК изучили разнообразие и структуру ассоциированного с ними дрожжевого сообщества (на стадии личинки, куколки и имаго), сопоставили ее с микробиомами двукрылых из других семейств, собранных на Белом море (эти таксоны перечислены выше). Доминируют в пробах мух и субстратов на Беломорской биологической станции дрожжи вида Metschnikowia zobellii, который считается типичным морским видом дрожжей, Rhodotorula mucilaginosa, скорее, считающегося эпифитным, и Aureobasidium pullulans, который выделен со многих видов субстратов и классифицируется как эврибионтный вид. Наименьшая численность и видовое разнообразие дрожжей характерно для куколок двукрылых, что согласуется с данными по дрозофилам. По-видимому, двукрылым (как минимум изученных видов) не нужны микроорганизмы для метаморфоза. Максимальное видовое разнообразие дрожжевого микробиома характерно для имаго, что объясняется их образом жизни: способные к полету имаго контактируют со значительно большим количество и разнообразием субстратов, чем их личинки. Кроме того, микробиомы взрослых мух зависят от особенностей их поведения. Численность дрожжей, при несколько меньшем разнообразии, чем у имаго, максимальна у личинок. В кишечнике личинки численность дрожжей варьирует в широких пределах в зависимости от того, потребляла ли изученная личинка дрожжи перед поимкой. Личинки P. fumosa менее часто едят дрожжи, чем личинки E. riparia, при этом их кишечник содержит только дрожжи из субстрата. Личинки E. riparia, во-первых, гораздо охотнее едят дрожжи, во-вторых, их кишечник содержит дрожжи, не содержащиеся в субстрате. К ним относятся следующие виды: Rhodotorula diobovata, Cystobasidium ongulense, Filobasidium magnum, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces fabryi, Candida aff. blancii. Основываясь на результатах исследований роли микробиома в жизни дрозофил, мы предполагаем, что дрожжи, в том числе некоторые из обнаруженных нами, могут вносить вклад в освоение столь необычного для большинства двукрылых местообитания, как солоноводные водоемы. Дальнейшее исследование, на наш взгляд, поможет понять роль этих микроорганизмов в жизни мух E. riparia, а также их адаптации к жизни в соленой воде. В настоящее время идет активная работа с прочтениями последовательностей нуклеиновых кислот мухи E. riparia. В распоряжении коллектива есть библиотека из 94 млн коротких парных прочтений генома мухи E. riparia и собранный из них черновик генома с покрытием около 11х. Кроме того, мы осуществили полиА транскриптомное профилирование 4-х образцов РНК с использованием технологии MGISEQ, MGI Tech., Китай. Были отсеквенированы транскриптомы личинки, куколки и имаго (в двух повторностях) мухи E. riparia в отдельности, в настоящее время идет сборка тарнскриптомов. По результатам первого года работы над проектом была написана статья «Морфология личинок мух-береговушек Ephydra riparia и Paracoenia fumosa (Diptera: Ephydridae) и адаптация двукрылых к повышенной солености», которая принята к печати в Журнал общей биологии (индексируется в WoS Core Collection и Scopus, РИНЦ, входит в перечень ВАК, также индексируется в других научных базах, журнал имеет переводную версию). Начата подготовка второй статьи, посвященной изучению микробиомов мух-береговушек и двукрылых из других семейств, обитающих в условиях повышенной солености, и выяснению вклада микробиоты в адаптацию к стрессовым и экстремальным местообитаниям. Результаты работы апробированы на научной конференции. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Поиск генетических маркеров адаптации мух-береговушек (Diptera, Ephydridae) к экстремальным местообитаниям |
Результаты этапа: В 2023 г. достигнуты следующие научные результаты: 1.1. На Беломорской биостанции МГУ имени Н.А.Перцова собран необходимый материал по мухам-береговушкам Ephydra riparia и Paracoenia fumosa (имаго, личинки и куколок) предназначенный для микробиологического посева и молекулярных исследований. 1.2. Проведено исследование внешней морфологии личинки нефтяной мухи Diasemocera petrolei (Diptera, Ephydridae). На первом этапе разработана методика очистки личинок нефтяной мухи от нефти. На втором этапе проведено исследование внешней морфологии с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Нефть, которой покрыта личинка, смывается хлороформом в течение 3–5 секунд, далее личинки помещаются в 15% раствор KOH в зависимости от сохранности материала (от 5 минут до 3 часов). Установлено, что если поменять эти стадии местами, то личинка становится непригодной для дальнейшего исследования. Более щадящий режим - ультразвуковая мойка с твином - оказался неэффективным для полной очистки личинки от нефтяных загрязнений. Выявлено тонкое строение передних и задних дыхалец личинки мухи Diasemocera petrolei. Установлено, что дыхательная пластинка задних дыхалец по строению аналогична изученным в прошлом году личинкам эфидрид E. riparia и P. fumosa с Белого моря, хотя сама дыхательная трубка более массивная и короткая. Это является адаптацией к более плотной среде обитания, нефти, по сравнению с водой, в которой развиваются многие личинки береговушек. Известно, что мускулатура личинки хорошо развита, чтобы позволить передвигаться в плотной среде, но при этом держаться на плаву в менее плотной среде (воде) личинка нефтяной мухи не может (Thorp, 1930). Тонкая структура передних дыхалец изучена впервые, изображения с СЭМ показывают, что они скорее напоминают передние дыхальца личинок P. fumosa (в виде двух бугорков), но окружены складкой, в которую дыхальца, по-видимому, могут вворачиваться, чтобы предотвратить попадание нефти – данное предположение было высказано еще в рамках первых морфологических исследованиях нефтяных мух (Crawford, 1912). Впервые нами обнаружены анальные папиллы, окружающие анальное отверстие. Они характерные для многих личинок двукрылых и, в частности, изученных в прошлом году личинок эфидрид E. riparia и P. fumosa с Белого моря, но установить, выполняют ли они осморегляторную функцию на спиртовом материале пока не удалось. С помощью СЭМ удалось подробно проследить расположение и форму различных сенсилл на поверхности тела личинки, а также установить тонкую структуру максиллярного, антеннального и вентрального органов на протоцефалоне. Максиллярный орган выглядит типичным для эфидрид, а антеннальный орган более приземистый и скорее похож на аналогичный орган личинок Drosophila melanogaster. Описание тонкой структуры вентрального органа личинок мух-береговушек нами в литературе не было найдено, также нам не удалось обнаружить и описать его в прошлом году у E. riparia и P. fumosa (хотя это не означает, что его нет). Вентральный орган личинки нефтяной мухи, напоминающий бугорок с ямкой между циррами, не похож на аналогичный орган D. melanogaster. У последней он снабжен нависающей структурой над бугорком. Также мы уточнили строение цирр, которые гораздо более развиты у личинок нефтяной мухи, чем у ранее изученных видов мух береговушек (для которых сделаны изображения с помощью СЭМ). См. дополнительные материалы к отчету, рис. 1–6. По результатам настоящего исследования готовится рукопись статьи с подробным описанием внешней морфологии личинок нефтяной мухи, которая ранее не исследовалась в таких подробностях, которые позволяет установить применение сканирующей электронной микроскопии. 2.1. В ходе начатого исследования дрожжевого микробиома двукрылых литорали Белого моря, живущих в соленой воде, мы выяснили, что в кишечнике личинки E. riparia обнаруживаются виды дрожжей, которые не содержатся в окружающем субстрате (воде, грунте и водорослях). В текущем году мы продолжили проводить микробиологические посевы имаго, личинок и куколок E. riparia и P. fumosa, а также (воды, грунта и водорослей), в котором развиваются личинки, чтобы выяснить, насколько дрожжевая микробиота, высеваемая с мух-береговушек на разных стадиях развития стабильно воспроизводится от года к году, или она не ассоциирована с мухами, а состав ее случаен и зависит от микробиоты окружающих субстратов, на и в которых мухи обитают. Результаты, полученные после обработки посевов, показывают, что микробиота эфидрид, как и микробиота D. melanogaster (являющихся модельным объектом для изучения ассоциированной микробиоты), значительно варьирует в зависимости от внешних факторов, сезона, но есть и виды дрожжей, которые обнаруживаются регулярно, хотя объясняется это скорее тем, что они обильно представлены на субстратах литорали Белого моря (табл. 3-6 из дополнительных материалов). 2.2. Чтобы прояснить роль дрожжей, которые доминируют в посевах двукрылых, обитающих на литорали Белого моря, и протестировать гипотезу о том, что эти виды вносят вклад в адаптацию мух к стрессовым условиям среды, мы провели эксперимент на линиях D. melanogaster, содержащихся в нашей лаборатории, кафедры биологической эволюции биологического факультета МГУ. Основываясь на методике из статьи Dmitrieva et al., 2019 мы проверили, повысится ли выживаемость личинок неадаптированных мух, развивающихся на соленом корме, если предварительно засеять корм исследуемыми видами дрожжей. На корм засевались следующие дрожжи: Candida argentae (2 штамма) – один из наиболее частых и массовых видов дрожжей, обнаруженных на личинках E. riparia, Starmerella bombi – вид редкий и немногочисленный, но относящийся к роду Starmerella, другой представитель которого St. bacillaris, значительно помогает дрозофилам приспособиться к неблагоприятному соленому корму и Saccharomyces cerevisiae (в качестве контроля). Мухи во многих вариантах теста не просто не показали повышенную выживаемость по сравнению с вариантом мухи на соленом корме без посева, но и не смогли выжить и развиться на корме, засеянном этими дрожжами. При засеве штаммами дрожжей C. argentae в 20-40% пробирок мухи погибли (потомство от двух пар родителей не развилось), при засеве St. bombi – мухи из 40% пробирок погибли, при засеве S. cerevisiae – погибло 20% мушек, а в 40% пробирок вывелись единичные особи, тогда как на чистом соленом корме только 10% пробирок дали потомства меньше 4 особей и еще 40% - меньше 10, но при этом ни в одной из пробирок не погибли все мушки. На стандартном корме две пары тестируемых наивных мух дают в среднем 147 потомков на стандартную лабораторную стеклянную пробирку. Хотя это не исчерпывающий перечень видов дрожжей, которые обильно представлены в мухах и солоноводных субстратах, но данные результаты свидетельствуют о том, что их роль в адаптации двукрылых к жизни в соленой воде, скорее не подтверждается. 3.1. Из транскриптомных библиотек личинки, куколки и имаго мухи E riparia, полученных на платформе MGISEQ, нами собран de novo референсный транскриптом мухи E. riparia. Однако полученный результат оказался по качеству несколько ниже ожиданий. Несмотря на то, что выполнялось полиА транскриптомное профилирование 4-х образцов РНК с использованием технологии MGISEQ (модель секвенатора: MGISEQ-2000), оказалось, что библиотеки на 93-95% состоят из рРНК-овых прочтений (рис. 8 в файле с дополнительными материалами), они оказались сильно контаминированными материалом из позвоночных (предположительно, человеческим; см. рис. 9) и сильно вырожденными, в связи с чем пригодными для сборке осталось всего 2,68% процентов от исходного числа прочтений (рис. 10). Сборка была осуществлена с помощью программы Trinity и дала около 27 тыс. предсказанных пептидов, но полнота сборки по BUSCO составила только 92,6% (рис. 11–12). Однако, удалось получить транскриптом высокого качества при использовании библиотек, полученных на платформе Illumina. 3.2. Из трех библиотеки транскриптомных прочтений личинки E. riparia, полученных на платформе Illumina Hiseq2500, собран de novo транскриптом, содержащий 254 тыс. транскриптов (этот результат удалось получить только на материале личинки, против 211 тыс. транскриптов, полученных на основе транскриптома всех стадий развития при использовании библиотек MGI). В сборке содержится около 25 тыс. предсказанных пептидов, при этом полнота сборки по BUSCO составила 98,3% (рис. 13–14), т.е. более 98% белков, которые характерны для двукрылых найдены в сборке, даже несмотря на то, что сборка проводилась только по одной из стадий развития (рис. 18). При этом личинка наиболее приспособлена к жизни в соленой воде и представляет интерес в нашем исследовании. 3.3. В собранном траскриптоме личинки E. riparia произведен поиск пептидов, проанализированы последовательности ряда найденных белков. С помощью программы OrthoFinder осуществлен поиск ортогрупп на наборе референсных протеомов и в новом протеоме личинки E. riparia. Удалось найти около 15 тыс. нетривиальных (>1 представителя) ортогрупп. Интересующие нас белки, которые могу с большой вероятностью быть ассоциированы с успешной жизнью личинки мухи E. riparia в соленой воде, это белки, придающие прочность кутикуле личинок, LEA-белки, белки теплового шока, аквапорины, белки-транспортеры металлов (metal-transport proteins), белки, входящие в сигнальные каскады p38 и JNK MAPK и т. д. По белку дрозофилы были найдены нужные ортогруппы (см. табл. 1 в файле с дополнительными материалами) и проверено отношение гомологов из E. riparia при помощи выравнивания и филогенетического дерева. Для большинства белков сопоставление между E. riparia и D. melanogaster получилось 1 к 1, т. е. у E. riparia присутствует один ортолог (полный или частичный) для данного гена дрозофилы. Для некоторых же белков картина несколько сложнее, например для некоторых аквапоринов (из числа Entomoglyceroporins) свойственны линиеспецифические дупликации, которые нарушают простое соответствие (см. дерево на рис. 19). Помимо аквапоринов, аналогичная эволюционная картина получается для двух групп белков SLC транспортеров, на рис. 20–21 видно, что у искомых белков дрозофилы есть паралоги, а наиболее близкие гомологи “GH21490p” и “salty dog” у E. riparia также претерпели линиеспецифичные дупликации, что делает их «ко-ортологами». Данные примеры свидетельствуют о том, что адаптация к стрессовым условиям, жизни в соленой воде, не свойственной для большинства насекомых (Cheng, Mishra, 2022), шла по пути дупликации белков, задействованных в осморегуляции и транспорте ионов. Сопоставление белков E. riparia с белками D. melanogaster допустимо, так с такой тщательностью не изучены транскриптомы и геномы больше ни у одного вида, более родственного изучаемой эфидре. Семейства Epydridae и Drosophylidae состоят в близком родстве, поэтому механизмы адаптации могут быть в большой степени сходными. Кроме того, в исследованиях нашей кафедры (Дмитриева и др., 2016; Яковлева и др., 2016; Панченко и др., 2017; Dmitrieva et al., 2019) и других лабораторий (Rose, Charlesworth, 1981; Te Velde et al., 1988; Archer et al., 2003; Phelan et al., 2003; Burke, Rose, 2009; Condon et at., 2014) показано, что дрозофилы в лабораторных условиях могут легко адаптироваться к неблагоприятным условиям, в т.ч. к средам с повышенной соленостью, однако механизмы этой адаптации, особенно на молекулярном уровне, до конца не изучены. В связи с этим сопоставление найденных генов приближает нас к важной эволюционной задаче поиска механизмов приобретения адаптаций. 3.4. Получены транскриптомные библиотеки для куколок, личинок и имаго мухи E. riparia (по три повторности на стадию, т. е. всего 9 библиотек), секвенирование выполнено длинными прочтениями на платформе Oxford Nanopore Technologies, секвенатора PromethION. Преимущество таких библиотек по сравнению с библиотеками из коротких чтений нам представляется том, что в пробоподготовке нет стадии ПЦР, поэтому библиотеки получаются менее вырожденными. Подобран пайплайн для гибридной сборки транскриптома программой rnaSPAdes с использованием имеющихся библиотек коротких и длинных прочтений, рис. 23. В связи с отъездом администратора кластера, на котором проводились основные расчеты по проекту, коллектив столкнулся с техническими трудностями и не все возможные обсчеты удалось завершить. 4.1. Собран de novo и отполирован референсный геном мухи E. riparia на основе библиотеки с длинными прочтениями, полученной на платформе Oxford Nanopore Technologies. Сборка содержит около 40 тыс. контигов, оцененный размер генома около 1Гб. Это примерно на 60% больше, чем оценивалось ранее с помощью имеющейся библиотеки коротких прочтений Illumina генома E. riparia (94 млн парных прочтений), и чернового собранного генома довольно низкого качества (покрытие примерно 11х, подробнее на GitHub руководителя проекта: https://github.com/Terraslavonica/E_riparia), а также результатов, полученных на основе программы jellyfish. Таким образом удалось существенно улучшить сборку генома и уточнить его размер. 4.2. Полученные длинные прочтения транскриптома были откартированы на сборку генома E. riparia. Было проверено, что подавляющее большинство транскриптов, картируемых на геном, приходится на куколочную стадию развития мухи E. riparia. Кроме того, было установлено, что значительное количество контигов собранного генома определяется как последовательности генома внутриклеточного симбионта (или паразита) бактерии Wolbachia. Это наблюдение позволяет выдвинуть гипотезу о том, что часть генов вольбахии могла быть перенесена в геном хозяина, что может быть связано с перестройкой и усложнением генома хозяина и в последствии способствовать адаптации мух в семействе Ephydridae к различным экстремальным местообитаниям. Не только к жизни при высокой для насекомых солености, но и жизни в нефти (изучаемая нами Diasemocera petrolei), в щелочных озерах (эфидрида Ephydra hians, Ephydra cinerea), в теплых источниках (43–45 ⁰C) в Йеллоустоунском парке (Ephydra bruesi) и в кислой среде (pH 3, Ephydra thermophila). Этот вопрос выходит за рамками настоящего проекта, но очень интересен членом коллектива и будет изучен более подробно в последствии. 5. В продолжение изучения механизмов адаптации двукрылых к экстремальным местообитаниям проведен обзор молекулярных механизмов реакции на температурные стрессы на примере модельного организма D. melanogaster, у которого данные механизмы изучены довольно подробно. Ключевыми процессами, общими для ответов на тепловой и холодовой стрессы, являются повышение экспрессии генов белков теплового шока (heat shock proteins, HSP) и генов семейства Turandot, а также активация серин-треониновой протеинкиназы p38 MAPK. При тепловом стрессе также наблюдается TORC2-опосредованное образование стрессовых гранул, а при холодовом – повышение синтеза кальций-связывающего белка DCA и криопротекторного белка FROST. Некоторое сходство реакций на тепловой и холодовой стрессы может быть объяснено сходным характером наблюдающихся повреждений и многофункциональностью белков, обеспечивающих стрессовые ответы. Вероятно, между толерантностью к тепловому и холодовому стрессам у D. melanogaster существует эволюционный компромисс: повышение устойчивости к одному стрессу приводит к снижению устойчивости к другому. Дрозофилы на разных стадиях жизненного цикла демонстрируют различную чувствительность к температурным воздействиям, и механизмы ответа на них также частично различаются. При помощи базы данных FlyBase была установлена локализация генов, продукты которых участвуют в ответе на температурные стрессы, в геноме дрозофилы. 15 из 21 обсуждаемых в работе генов расположены на третьей хромосоме, из них 10 – на ее правом плече, что позволяет выдвинуть гипотезу об адаптивном сближении генов, белки которых принимают участие в стрессовом ответе в геноме D. melanogaster. Возможно, это позволяет точнее синхронизовать регуляцию их экспрессии. Понимание молекулярных механизмов ответа насекомых на температурные стрессы может иметь практическое значение: помочь в предсказании изменений ареалов отдельных видов и их адаптации к быстро изменяющимся климатическим условиям, а также поспособствовать разработке инсектицидов, позволяющих противостоять насекомым-вредителям сельскохозяйственных культур и инвазивным видам. Молекулярные механизмы ответа на стресс интересны с эволюционной точки зрения, так как часто оказываются под действием естественного отбора. По результатам проделанной работы в Журнал общей биологии принята к печати статья «Сравнение молекулярно-генетических механизмов ответа на тепловой и холодовой стрессы у Drosophila melanogaster». 6. В 2023 г. по результатам исследования принята к печати одна статья в журнале, индексируемом в РИНЦ, Scopus и Russian Science Citation Index (RSCI). Результаты исследования апробированы двух научных конференциях, а также освещены в научно-популярных СМИ: в статье на портале Элементы и в лекции, прочитанной руководителем проекта в культурно-просветительском центре «АРХЭ». Таким образом, некоторые возникшие трудности при реализации проекта послужили стимулом для расширения и углубления тематики проекта и исследования не только молекулярных, но также морфологических и микробиотических механизмов адаптации мух-береговушек к экстремальным местообитаниям. За этот год, несмотря на препятствия, нам удалось получить основные научные результаты, которые были запланированы в проекте. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".