Наноалмазные покрытия для улучшения свойств материалов для изготовления протезов клапанов сердца: получение и анализНИР

Nanodiamond coatings for improving the properties of materials for the manufacture of prosthetic heart valves: preparation and analysis

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Наноалмазные покрытия для улучшения свойств материалов для изготовления протезов клапанов сердца: получение и анализ
Результаты этапа: Получены и количественно охарактеризованы наноалмазные покрытия ксеноткани бычьего перикарда. С помощью меченных тритием наноалмазов показано, что положительно заряженные наноалмазы на поверхности ксеноткани образуют слой, в котором количество наноалмазов составляет 4.0±1.2 мг/г, а наноалмазы, подвергнутые предварительному отжигу на воздухе (отрицательно заряженные) - 1.5±1.0 мг/г. В процессе эксплуатации биоткани (in vivo исследование на крысах) на поверхности остается около 35 % положительных и до 67 % отрицательных наноалмазов. Показано, что механико-прочностные свойства коллагеновых матриц существенно улучшаются при последовательном нанесении наноалмазного слоя и слоя хитозана в условиях сверхкритического диоксида углерода. Нанесение покрытий наноалмаз-хитозан приводит к увеличению максимального предела прочности, а также повышает прочность к разрывным деформациям как в осевом, так и в радиальном направлениях. Улучшение свойств наблюдается как для положительно, так и для отрицательно заряженного наноалмаза. Образцы с нанесенным покрытием из наноалмазов оказались на 30% более эластичными по сравнению с контрольным образцом. В случае отожженных на воздухе наноалмазов ксеноткать стала прочнее на 10% для образцов в осевом направлении и на 25% для образцов в радиальном направлении, и жестче - на 50% для осевого и на 25% для радиального направлении по сравнению с контролем. При этом окисленные наноалмазы в меньшем количестве сорбируются на поверхность ксеноткани и лучше удерживаются при эксплуатации. Поэтому для исследования связывания с антибиотиками на следующем этапе выбраны именно отрицательно заряженные наноалмазы. Таким образом, предложенные в работе подходы позволяют получить материал для изготовления протезов сердечного клапана с увеличенным сроком службы. Полученные результаты опубликованы в журнале Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. Статья прилагается к отчету. Серьезную опасность, особенно в первые дни после операции по пересадке сердечного клапана, представляет развитие бактериальных инфекций. Поэтому покрытие протеза сердечного клапана должно содержать антибактериальные препараты. Для этого на следующем этапе работы получены адсорбционные комплексы отрицательно заряженных наноалмазов (SDND) с анибиотиками широкого спектра действия: амикацином и левофлоксацином. Изотермы адсорбции амикацина и левофлоксацина на наноалмазах были получены с использованием меченных тритием лекарственных веществ. Показано, что связывание с поверхностью наноалмазов обоих препаратов достигает 100 мг/г. Полученные адсорбционные комплексы были охарактеризованы методом динамического рассеяния света и ИК-спектроскопии. Показано, что электрокинетический потенциал, который для исходного наноалмаза составляет -30 мВ, возрастает с увеличением поверхностной концентрации амикацина и становится близким к нулю при максимальной адсорбции (около 100 мг/г). В случае с левофлоксацином электрокинетический потенциал практически не изменяется. При исследовании антибактериального действия покрытий наноалмаз-антибиотик были выбраны клинические грамположительные штаммы бактерий Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), которые вызывают осложнения после проведения операции по замене клапана. Было показано, что сами отрицательно заряженные наноалмазы обладают высокой антимикробной активностью: адгезия была на два порядка ниже, чем в контрольном эксперименте. Для комплексов с амикацином и левофлоксацином эффект был схожим, что указывает на ключевую роль наноалмазов в качестве антиадгезионного покрытия. Длительное воздействие приводило к резкому снижению выживаемости бактерий в присутствии наноалмазов и особенно их адсорбционных комплексов с антибиотиками. Заметим, что антимикробная активность наблюдалась для обоих антибиотиков, в то время как, например, для мирамистина – антибиотика с широким спектром противомикробной активности в отношении бактерий, грибков и вирусов, адсорбция на наноалмазах приводила к подавлению антимикробных свойств. При этом адсорбция мирамистина на наноалмазах стабилизирует его водные суспензии, и в ряде случаев способствует адсорбции инкапсулирующих биополимеров, таких как гиалуроновая кислота. (данные работы M.G. Chernysheva et al // Mendeleev Commun., 2022, 32, 501–503 статья прилагается к отчету) Принимая во внимание адсорбцию наноалмазов на коллагеновых матрицах и значения адсорбции лекарственных средств на поверхности наноалмазов, мы показали, что концентрация антибиотика на порядок ниже, чем обычно используется и приводит к аналогичному результату. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что адсорбция на наноалмазах снижает дозу антибиотиков, используемых в качестве противомикробного средства. Следовательно, использование покрытий на основе комплексов наноалмазов с антибиотиками позволит либо избежать, либо значительно сократить продолжительность и интенсивность применения антибиотиков в послеоперационном периоде, что критически важно с точки зрения развития антибиотикорезистентности у патогенов. Полученные результаты опубликованы в журнале Colloids and Interfaces. Статья прилагается к отчету.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Наноалмазные покрытия для улучшения свойств материалов для изготовления протезов клапанов сердца: получение и анализ
Результаты этапа: Адсорбционные комплексы наноалмазов с амикацином и левофлоксацином были получены в условиях максимального насыщения лекарственным средством: 1 мг наноалмазов смешивали с 6 мг лекарственного средства (результаты 1 года выполнения проекта). Затем в суспензию композитов наноалмаз-лекарственное средство помещали коллагеновые матрицы бычьего перикарда, суспензию и перемешивали в течение 5-7 часов; после этого термостатировали при температуре 4°C в течение ночи. Матрицы извлекали из суспензии и помещали в 0,9 % раствор хлорида натрия и в таком виде образцы хранили при температуре 4°C. После этого на поверхность матриц наносили слой хитозана из раствора в сверхкритическом диоксиде углерода. Полученные материалы были охарактеризованы по количественному составу с помощью метода радиоактивных индикаторов; равномерность нанесения слоя описана с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); определены механико-прочностные характеристики материала; с помощью метода радиоактивных индикаторов определена устойчивость in vivo полученных покрытий по каждому из компонентов. С помощью сканирующей электронной микроскопии показано, что как исходные, так и модифицированные лекарственными средствами наноалмазы адсорбируются на коллагеновых матрицах с обеих сторон. В случае левофлоксацина мы наблюдали адгезию волокон, которая может уменьшить удельную площадь матриц, что объясняет меньшее количество наноалмазов в составе покрытия. С помощью меченных тритием наноалмазов было установлено, что содержание наноалмаза в составе покрытий с амикацином и левофлоксацином 3,3±0,6 и 1,8±0,4 мг на г матрицы соответственно. С помощью СЭМ и меченных тритием наноалмазов также показано, что адсорбция хитозана не влияла на распределение и количество наноалмазов на поверхности: слой наноалмазов остается стабильным в условиях нанесения слоя хитозана. С помощью меченного тритием хитозана найдено, что присутствие и количество наноалмазов на поверхности коллагеновых матриц не влияют на адсорбцию хитозана в условиях сверхкритического диоксида углерода, которая составляла около 20 мг/г, в то время как для матриц без наноалмазов адсорбция хитозана в тех же условиях составляет 12±2 мг/г. Механические характеристики коллагеновых матриц измеряли на образцах, которые были вырезаны в двух ортогональных направлениях, поскольку бычий перикард проявляет различные механические характеристики в двух основных ортогональных направлениях, которые определяются ориентацией роста фибрилл. Были проанализированы коллагеновые матрицы, покрытые слоем наноалмаз-антибиотик-хитозан, наноалмаз-хитозан и слоем хитозана. В качестве контроля использовали коллагеновые матрицы без какого-либо покрытия. Оказалось, что наноалмазы SDND не оказывают такого сильного влияния на механические прочностные характеристики коллагеновых матриц, как это наблюдалось ранее для наноалмазов, поставляемых продавцами в виде порошков (было определено в первый год выполнения проекта). Показано, что материал с покрытием, содержащим наноалмазы, не только сохраняет механические и прочностные характеристики, но на его поверхности удерживается антибиотик, который сохраняет антимикробные свойства при адсорбции (показано для амикацина и левофлоксацина). Стабильность покрытий из наноалмаза, лекарственного средства и хитозана in vivo определяли с помощью меченных тритием соединений (наноалмазов, амикацина, левофлоксацина и хитозана), полученных методом термической активации трития. Отметим, что при получении меченных тритием наноалмазов методом термической активации, функциональный состав поверхности наноалмазов практически не меняется. Для доказательства этого предположения в рамках настоящего проекта был проведен эксперимент с обработкой наноалмазов атомарным водородом в гораздо более жестких условиях, чем используются при введении метки, и проведен анализ функционального состава поверхности с помощью ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье. Показано, что кислородсодержащие группы, такие как ОН- и СООН остаются на поверхности наноалмазов за счет их образования при восстановлении сложноэфирных связей. Для насыщения матриц использовали меченные вещества со следующей удельной радиоактивностью: наноалмазы - 51 мкКи/мг, хитозан 1 мкКи/мг, амикацин – 5 мкКи/мг и левофлоксацин – 3 мкКи/мг. На поверхности коллагеновых матриц размером 1×1 см2 получали покрытия следующего состава: (1) [3H]наноалмаз-левофлоксацин-хитозан, наноалмаз-[3H]левофлоксацин-хитозан и наноалмаз-левофлоксацин-[3H]хитозан; (2) [3H]наноалмаз-амикацин-хитозан, наноалмаз-[3H]амикацин-хитозан и наноалмаз-амикацин-[3H]хитозан (по 6 образцов матриц для каждого типа комплекса). Матрицы с покрытьями подкожно имплантировали крысам линии Wistar. После имплантации животных содержали в обычных условиях вивария в течение четырех месяцев. Для определения протекания процесса кальцинирования матриц в рацион животных включали витамин Д3 для лучшего усвоения кальция. Через четыре месяца после имплантации матрицы изымали из тела крысы, высушивали до постоянной массы и разлагали кипячением в концентрированной азотной кислоте. Полученные суспензии разбавляли водой, центрифугировали для отделения осадка наноалмазов. После этого измеряли радиоактивность раствора и осадка наноалмазов с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра для определения количества меченого вещества, а также анализировали азотнокислый раствор с помощью метода атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES) на наличие металлов, в частности кальция. Для измерения радиоактивности использовали сцинтилляционную жидкость GoldStar, предназначенную для измерения растворов с низким значением pH. Необходимо отметить, что такой подход позволяет в два раза уменьшить количество животных, задействованных в эксперименте, поскольку стало возможно определились состав покрытия и его кальцинирование из одного и того же раствора. Показано, что покрытия, содержащие амикацин, лучше удерживаются на поверхности коллагеновых матриц при эксплуатации. Амикацин как лекарственное средство также показал хорошую стойкость на поверхности, при том, что его антимикробная активность сохраняется. Уменьшение слоя хитозана связано с удалением слоев, которые слабо связаны с поверхностью. Это предположение подтверждается результатами, полученными для серии левофлоксацина. В этом случае сохранилось около 70% хитозана, вероятно, из-за электростатических взаимодействий. Для матриц без наноалмазного покрытия содержание хитозана, осажденного из раствора в условиях сверхкритического диоксида углерода, составляет около 10 мг на г матриц. Слой наноалмазов с левофлоксацином оказался менее стабильным по сравнению с образцом с амикацином, в котором слой сохранился на 60%. Таким образом, наши результаты показали, что стабильность покрытия, содержащего наноалмазы, определяется функциональным составом поверхности наночастиц, который, в свою очередь, зависит от антибиотического модификатора наноалмазов. Анализ ICP-AES показал, что для обоих типов покрытий наноалмаз-амикацин-хитозан и наноалмаз-левофлоксацин-хитозан содержание кальция существенно не отличается и составлял 1,5±0,4 мг/г, в то время как в образце без покрытия содержание кальция почти на порядок выше (11,3±0,9 мг/г). Полученный результат подчеркивает роль хитозана в предотвращении кальциноза. Поскольку железо является основным металлом - примесью в составе наноалмазов, его концентрация в наноалмазосодержащем образце значительно выше (р < 0,05), чем в контрольном образце. Количество других металлов (цинка, натрия и калия) в образцах с покрытиями и без них было сопоставимым. Таким образом, при выполнении настоящего этапа проекта были впервые получены и проанализированы с разных точек зрения многокомпонентные покрытия коллагеновых матриц бычьего перикарда. Нанесение таких покрытий делает материал похожим по механическим характеристикам на человеческий. Исследования In vivo показали сохранение многослойных слоев, состоящих из наноалмазов, антимикробных агентов и хитозана, на поверхности материала и предотвращение кальцификации материала. Если амикацин и левофлоксацин не теряют антимикробные свойства, то другие антибиотики (например, Мирамистин и лизоцим) при адсорбции на поверхности наноалмазов становятся абсолютно не токсичными по отношению к микроорганизмам. В рамках настоящего проекта показано, что этой ситуации можно избежать с помощью модифицирования поверхности наноалмаза белком. Показано, что композит наноалмаз-лизоцим-мирамистин проявляет сильную антимикробную активность, в то время как комплекс наноалмаз-мирамистин не проявляет токсичности по отношению к золотистому стафилококку. Таким образом, был сделан вывод о том, что композит наноалмаз-лизоцим-мирамистин может быть использован для создания покрытий материала протеза сердечного клапана, однако в этом случае использование хитозанового покрытия не представляется возможным.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".