Родственные связи внутри таксона Multicrustacea: Hexanauplia или Communostraca? Спросим у личинокНИР

Phylogenetic relationships within Multicrustacea: Hexanauplia vs Communostraca. What do their larvae say?

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Родственные связи внутри таксона Multicrustacea: Hexanauplia или Communostraca? Спросим у личинок
Результаты этапа: Нам впервые удалось изучить внутреннее строение циприсовидной личинки Facetotecta при помощи ТЭМ и серии полутонких срезов, а также конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). (Рис. 1, файл с дополнительным материалом) Тагмозис. Подготовленные нами продольные срезы у-циприса показывают наличие всего 5 свободных торакальных сегментов, что соответствует картине , когда первый грудной сегмент сливается с головными образованием цефалооракса. Однако дополнительные исследования с применением КЛСМ, показали, что к первому свободному тергиту крепятся пучки мускулатуры, идущие от первых и вторых конечностей. Таким образом, вопрос о тагмозисе циприсовидных личинок, остается до конца не разрешенным. С одной стороны, наличие у фасетотект 6 пар решетчатых органов вместо пяти говорит в пользу наличия реального цефалоторакса. С другой стороны, прикрепление мышц первого и второго торакоподов к первому тергиту говорит о возможном слиянии между собой именно двух первых сомитов торакса. Анатомическое строение. В передней части цефалоторакса располагается обширный головной мозг размерами 45мкм высотой и около 90 мкм шириной, с центральным объемным нейропилем. У-циприс обладает хорошо развитыми сложными, но не стебельчатыми глазами, состоящими из 9 омматидиев. На вентральной стороне головы имеются особые структуры – возможно, сенсорной природы, так называемые параокулярные выросты, связанные со сложными глазами. По обе стороны от лябрума имеются особые пучки филаментов (post-ocular filamentory tufts), для которых предполагается секреторная функция. На ТЭМ нами показано, что они представляют собой небольшие выпячивания, покрытые сильно складчатой тонкой кутикулой. Нами не были обнаружены очевидные нервные окончания или отростки, заходящие внутрь этих кутирулярных структур или подходящие к их основанию. Нами показано отсутствие мышечных волокон ассоциированных с пост-окулярным пучком филаментов. Хемо-сенсорные структуры y циприса представлены многочисленными порам, а также решетчатыми органами, располагающимися на карапаксе закономерным образом. При помощи СЭМ нами был проведен морфологический анализ карапкса циприсовидных личинок семи морфотипов (неописанных видов) фасетотект. Нам удалось выявить несколько структурных типов пор, очень подробно изучить характер их распределения, а также связь с решетчатыми органами (Kolbasov et al., 2022). Было показано, что внешняя морфология и ультрастуктура первой пары решетчатых органов (р.о.), которая ранее не была отмечена для фасетотект, не имеет принципиальных отличий от других р.о.. К чувствительные структурам также относятся щетинки и эстетаски на дистальном сегменте антеннул. На вентральной стороне у-циприса располагается лябрум, который несет крупные поры. Нами было показано, что это, выводные отверстия желез, которые располагаются непосредственно под порой. Y циприс является непитающейся стадией, даже у планктотрофных видов. Однако у наших особей мы обнаружили на вентральной стороне позади лябрума глубокое впячивание покровов, выстланное кутикулой. Предположительно, это может быть рудиментарный пищевод. Так же на поперечных срезах личинки в области середины головы нами была обнаружена группа клеток, окружающих небольшую кутикулярную полость. Предположительно, это может быть рудиментарной кишкой y-личинки. В центральной части цефалоторакса большой объем дорсально занимает запасающая ткань – с крупными вакуолями, заполненными гомогенным содержимым. 2. Исследование анатомии половой стадии (самца) Tantulocarida (Рис. 2, файл с дополнительным материалом) Анатомия самцов тантулокарид впервые исследована с применением трансмиссионной и конфокальной микроскопии. По данным электронной микроскопии описано строение следующих систем органов: кутикулярный покров и подстилающая его гиподерма, нервная система, сенсорный аппарат, состоящий из эстетасков и пор с сенсиллами, мышечная система. В передней части головы была выявлена необычная структура, ранее не описанная для других ракообразных, и назначение которой пока не ясно - так называемая сотовидная структура. Это агрегация очень плотно упакованных клеток, занимающих по объему около трети всего цефалоторакса. Клетки имеют одинаковое и очень своеобразное строение — в них отсутствуют типичные ядра и митохондрии, а основную часть занимает вакуоль диаметром около 1 мкм с гомогенным содержимым. Кроме того имеется электронноплотное утолщение, не ограниченное от цитоплазмы мембраной, идущее вдоль вакуоли и прикрывающее ее с одной стороны как будто колпачком. Сама цитоплазма занимает в клетке незначительный объем и имеет пристеночное расположение. Применение конфокальной микроскопии позволило доказать наличие очень мелких (ок. 1мкм) ядер в клетках сотовидной ткани, что было не очевидно даже на снимках ТЭМ. Так как подобная структура была обнаружена нами впервые, мы предполагаем несколько гипотез ее функционального назначения в теле самца. Позади сотовидной структуры, непосредственно прилегая к ней, располагается обширный головной мозг с объемным центральным нейропилем. От мозга, который не имеет выраженного разделения на прото- дейто- и тритоцеребрум, отходит брюшная нервная цепочка, занимающая вентральное положение в свободных сегментах тела самца. Применение КЛСМ позволило впервые визуализировать мышечную систему самцов тантулокарид (в дополнение к исследованию ТЭМ). В теле самца наблюдаются два продольных тяжа мускулатуры дорсальный (разгибатели) и вентральный (сгибатели). Дорсальный отходит от верхней стенки цефалоторакса в районе его середины. Место прикрепления (выхода) вентральной продольной мускулатуры чуть смещено назад. Нами впервые получены сведения о наличии во втором абдоминальном сегменте парных косых дорсовентральных мышц, отходящих от дорсальной стенки тела и крепящихся к вентральной стенке тела непосредственно за местом отхождения фуркальных ветвей, что подтверждается и на конфокальных снимках. Мускулатура пениса представлена парными тяжами (разгибателями), которые берут начало на дорсальной стенке первого абдоминального сегмента тела и проходя в дистальный сегмент пениса через сочленение крепятся к его вентральной стороне. Парные дорсо-вентральные пучки мускулатуры имеются в задней части цефалоторакса и в каждом торакальном сегменте — это протракторы и ретракторы торакоподов (наружная мускулатура конечностей). В самих торакоподах есть продольные пучки мышц, которые идут к экзоподиту и эндоподиту (внутренняя мускулатура конечностей). Важной для нас особенностью строения туловищной мускулатуры самцов является наличие двух дорсо-вентральных пучков, крепящихся в задней части цефалоторкса. Именно это подтверждает наличие у Tantulocarida типичного цефалоторкса, образованного слиянием двух первых грудных сегментов с сегментами головы. Нами было впервые исследовано тонкое строение сенсорных структур карапакса самцов тантулокарид, что является принципиальным для выполнения нашего проекта. Так на спинной стороне цефалоторакса располагаются 7 пар ямок с сенсиллами. Можно выделить два кластера этих пор (ямок) передний, состоящий из пяти пар А1-А5, и задний – из двух пар Р1-Р2. Нами было показано, что число чувствительных щетинок или сенсилл, выходящих из ямок, может варьировать от двух до семи. Нами было изучено ультратонкое строение этих чувствительных ямок при помощь ТЭМ. Так, было показано, что каждая ямка дает начало небольшому каналу, идущему параллельно поверхности. От верхней стенки этого канала отходит единый чувствительный элемент, несущий один дендритный отросток. Далее эта щетинка расщепляется на отдельные сенсиллы, в которых дендритные отростки отсутствуют. 3. Гомология сенсорных структур фасетотект и тантулокарид. Полученные нами ультраструктурные данные о строении сенсорных ямок с щетинками тантулокарид позволяют провести сравнение с решетчатыми органами фасетотект и других текострак. Важным признаком, говорящим в пользу гомологии решетчатых органов текострак и чувствительных пор (ямок) тантулокарид, является их число и постоянство этого числа. Так, для текострак характерно наличие 5-ти пар р.о. у Cirripedia и Ascothoracida (в состав головного отдела входит пять сементов и цефалоторакс отсуствует), и 6-ти пар – у Facetotecta (предположительно, первый сегмент груди сливается с головными с образованием цефалоторакса). У тантулокарид тоже постоянное число чувствительных ямок – 7, что соотвтетсвует числу сегментов входящих в состав цефалоторакса. В тоже время чувствительные структуры тантулокарид ультрастуктурно сильно отличаются от решетчатых органов. Таким образом сделать выводы о гомологии пор с сенсилами тантулокарид и решетчатых органов текострак пока сложно. Нам только предстоит выяснить особенности морфологии дорсальных чувствительных органов у Copepoda и Malacostraca, что является задачей на следующий год проекта. 4. Описание нового вида изопод и анализ сенсорных структур самца Holophryxus citriformis sp. nov (Isopoda:Dajidae) (Рис. 3, файл с дополнительным материалом) Нами подготовлено и опубликовано описание нового вида паразитических изопод семейства Dajidae – Holophryxus citriformis sp. nov. (Huys et al., in press) Впервые описание изоподы из данного семейства подготовлено на основании детального изучения морфологии самца и самки не только при помощи световой микроскопии, оснащенной оптикой Номарского, но и при помощи конфокальной микроскопии. Это позволило выявить новые детали внешнего строения, которые важны для таксономических исследований. Нами предложены новые стандарты описания паразитических изопод, которые учитывают тонкие детали морфологии взрослых особей обоих полов, включающие вооружение конечностей и сенсорные структуры. Таким образом в ходе подготовки данной публикации нами впервые получены достоверные данные о сенсорных структурах самки и самца дайид на примере Holophryxus citriformis. Сенсорные структуры были обнаружены нами на дорсальной и латеральных поверхностях головного щита и тергитов самца. Они представлены симметрично расположенными парами пор с чувствительными щетинками или без. Всего на головном щите самца имеется две медиальные пары и одна латеральная пара таких пор. Тергитах 1-5 имеется по одной паре медиальных и по одной паре латеральных пор. На тергитах 6-7 сохраняются только латеральные поры. У самки подобные сенсорные элементы на дорсальной поверхности тела обнаружены не были, что может быть связано с высокой степень трансформации тела из-за паразитического образа жизни. Однако сложные сенсорные структуры были описаны нами на переоподах как самки, так и самца. Они представлены конусообразными, цилиндрическими возвышениями, несущими сенсиллы и с центральной порой, а также простыми порами на поверхности проподуса и карпуса всех семи пар переоподов. По-видимому, именно торакоподы играют ключевую роль в осязании, так как участвуют в контакте с хозяином, который как правило видоспецифичен для дайид. 5. Исследования Copepoda Для двух видов планктонных каляноид Calanus glacialis и Metridia longa из Белого моря были осуществлены исследования половой системы. Подготовленная публикация (Yurikova et al., in press) раскрывает особенности строения половой системы самок этих двух видов, которые отличаются разными репродуктивными стратегиями. Впервые для копепод был использован метод 3D реконструкции по серии полутонких срезов, который вместе с ТЭМ позволил детально описать строение половой системы и различных генитальных структур, а также впервые описать оогенез (для M. longa).
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Родственные связи внутри таксона Multicrustacea: Hexanauplia или Communostraca? Спросим у личинок
Результаты этапа: 1. Внутреннее строение циприсовидной стадии Facetotecta (на примере беломорского вида Hansenocaris itoi ) исследовано с применением всего комплекса современных морфологических методов (3D реконструкция по серии полутонких срезов, конфокальная лазерная микроскопия (КЛСМ), трансмиссионная (ТЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Y- циприсы Hansenocaris itoi были собраны в окрестностях ББС МГУ при помощи планктонного лова с глубины 20 м. в течение летних сезонов 2020- 2023 гг. Стоит отметить, что циприсовидные стадии попадаются в планктоне в конце июня- начале июля, и их встречаемость очень низкая. Так, за весь период исследований нами было получено всего 7 особей. Две особи были получены нами в ходе непродолжительного культивирования последних науплиальных стадий, которые благополучно перелиняли в Y циприсов. Тот факт, что H. itoi имеет планктотрофных личинок, а также крайне растянутый период развития (около четырех месяцев) дополнительно осложняет работу, так как продолжительное содержание личинок в лаборатории невозможно. Для двух особей Y- циприсов был проведен эксперимент по индуцированному метаморфозу с применением гормона линьки 20-гидроксиэкдизона. Особи были зафиксированы для морфологических исследований разных этапов анатомической трансформации в ходе метаморфоза циприсовидной личинки в червеобразную стадию ипсигон. Для трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии (ТЭМ, СЭМ) и изготовления 3D реконструкции личинки были зафиксированы 2,5% глютаровым альдегидом на PBS, постфиксированы раствором ОsO4, дегидратированы и заключены в смолу. Образцы исследовались на трансмиссионных электронных микроскопах JEOL 1011 и JEOL FLASH 1400 в МЛЭМ МГУ. Для сканирующей электронной микроскопии дегидратированный материал высушивался в критической точке, и напылялся смесью платины и палладия. Образцы исследовали на JEOL JSM-6380 в МЛЭМ МГУ. Для 3D реконструкции была получена серия полутонких (2 мкм) поперечных срезов одного Y-циприса. Срезы были окрашены метиленовым синим и сфотографированы при помощи микроскопа Leica на ББС МГУ. Для изготовления 3D реконструкции было использовано программное обеспечение Amira 5.2.2. Одна особь, ранее зафиксированная глютаровым альдегидом была отмыта PBS и окрашена Coomassi blue в течение 3 часов. Далее нами был изготовлен тотальный препарат, который был сфотографирован при помощи светового микроскопа Leica. Для конфокальной микроскопии были использованы особи, зафиксированные 4% параформальдегидом на PBS. Один образец был окрашен раствором фаллоидина и DAPI в течение 12 часов. Тотальный препарат личинки, заключенной в глицерин, был исследован при помощи конфокального микроскопа Nikon A1 на ББС МГУ. Для получения изображений внешнего строения циприса H. itoi одна из особей была окрашена смесью Конго красного и Кислого фуксина. Фотографии также были получены при помощи микроскопа Nikon A1. Нами впервые были подготовлены 3D реконструкции внутреннего строения циприсовидной стадии Facetotecta. Этот метод позволяет визуализировать взаимное расположение систем органов, локализацию отдельных структур и их объем в теле объекта. Общее описание анатомии циприса H. itoi приводится нами по данным, полученным по совокупности всех примененных методов. Покровы личинки представлены неравномерно утолщенной кутикулой: дорсальная сторона карапакса имеет толстую многослойную кутикулу, несущую многочисленные гребни, а вентральная часть наоборот - очень тонкую. Гиподерма личинки представлена одним слоем эпидермальных клеток с крупными активными ядрами. Основной объем головного отдела Y циприса занимает обширный головной мозг. Нами не были обнаружены явные разделения на прото-, дейто- и тритоцеребрум. Обширный нейропиль окружен многослойным корковым слоем, представленным типичными телами нейронов. В центральной части головы через мозг проходит слепо замкнутая рудиментарная кишка. Далее центральная нервная система представлена уже вентральным нервным стволом, который имеет продолжение и в грудных сегментах. Пищеварительная система личинки рудиментарна и не функционирует. На вентральной стороне под лябрумом имеется рот, окруженный складчатой кутикулой. Ото рта в глубь головного отдела отходит выстланный тонкой кутикулой слепо-замкнутый пищевод. Интересно, что мы обнаружили многочисленные пучки мускулатуры, включая кольцевые мышцы, которые, по-видимому связаны с рудиментарной кишкой (См. Файл с доп информацией). Циприс имеет сложные глаза, которые состоят из 9 омматидиев и располагаются кпереди от лябрума на уровне антеннул. С глазами связаны парные структуры неясной природы и функции, так называемые параокулярные выросты и постокулярные пучки филаментов, которые располагаются в непосредственной близости от сложных глаз. Существенный объем тела личинки занимает хранилище запасающих веществ, представленное скоплением жировых капель, расположенным непосредственно за головным мозгом и распространяющимся вплоть до третьего сегмента абдомена. Мускулатура личинки исследована нами при помощи конфокальной микроскопии с применением красителя Phalloidin. В теле циприса визуализируются парные продольные тяжи мускулатуры, идущие вентрально и дорсально от заднего края карапакса до третьего сегмента абдомена. Дорсовентральные пучки располагаются в каждом грудном сегменте и обеспечивают работу плавательных конечностей. Нами впервые достоверно показано, что мускулатура первой и второй пары конечностей крепится к одному тергиту, который является результатом слияния двух первых грудных сегментов. В головном отделе присутствует сложно устроенная мускулатура, обеспечивающая подвижность сложных глаз, антеннул и лябрума. В области рудиментарного пищевода личинки обнаружено мощное скопление мышечных пучков, включая кольцевую мускулатуру, обрамляющую переднюю кишку. В ходе выполнения исследования анатомии Y циприса, нами были обнаружены многочисленные интегументные железы, расположенные в карапаксе личинки (по периметру), на спинной стороне головного щита, в лябруме, а также в тельсоне. Нами показано число и расположение интегументных желез на 3D реконструкции, а также проведено ультрастуктурное исследование при помощи ТЭМ. По результатам опубликована статья в журнале Invertebrate Zoology (Savchenko et al., 2024). По локализации в теле личинки и на основании парного/ непарного характера были выделены четыре группы интегументных желез. Первый тип - непарные дорзальные железы (DCG) - представлен двумя железами, расположенными на переднем и заднем краях головного щита вдоль медианной линии. Эти железы входят в состав комплекса решетчатых органов, которые также представлены двумя кластерами - передним и задним. Передняя и задняя дорзальные железы открывается наружу простой, но крупной порой, расположенной на гладкой приподнятой площадке. Парные сенсорные решетчатые органы располагаются вокруг выводного отверстия железы по три на переднем и заднем концах карапакса. Одна крупная непарная железа также была обнаружена внутри лабрума (LG). Эта железа открывается наружу непарной порой, которая располагается на вентральной поверхности верхней губы. На лябруме также имеется еще две боковые поры, которые соответствуют дополнительным парным железам. 14 пар боковых желез карапакса (LCG) расположены вдоль боков головного щита и имеют протоки с отверстиями на его внешней поверхности. Наконец, четвертая группа из трех парных желез находится в дистальной части тельсона с порами, открывающимися на боковой и задней дорзальной поверхностях. Ультраструктура интегументных желез была изучена с помощью ТЭМ. Каждая железа состоит из нескольких клеток с периферическими активными ядрами и большим запасом секрета, содержащегося в объемных везикулах. Короткий проток железы имеет тонкую кутикулярную выстику (эпикутикула) и открываются наружу порой, которая располагается на небольшом возвышении. Вещество, производимое железами, вероятно, имеет гликопротеиновую природу. Мы провели окрашивание Кумасси (используется для выявления белков), который дал положительную реакцию. На ТЭМ содержимое везикул имеет однородную гомогенную структуру с умеренной электронной плотностью. Функциональную нагрузку многочисленных интегментных желез циприсовидной стадии фасетотект определить очень сложно. Можно предположить, что железы входящие в состав лябрума участвуют в процессе инфицирования хозяина. Природа и функции парных желез, расположенных в карапаксе и в тельсоне личинки остаются загадкой. Особое значение для нашего проекта имеют железы первого типа, входящие в состав гландулярно-сенсорного органа, включающего решетчатые органы. Ранее было показано, что решетчатые органы всех текострак располагаются вокруг непарной поры, которая является выводным отверстием непарной железы, а вместе они представляют собой передний и задний комплексы решетчатых органов (Hoeg et al., 1998). У Facetotecta в состав переднего и заднего комплекса входит по три пары решетчатых органов и по одной железе. Одной из задач нашего проекта было выявление возможной гомологии между комплексами решетчатых органов текострак и подобными гландулярно-сенсорными структурами карапакса представителей Malacostraca, о чем пойдет речь в заключительной части отчета. Самой интригующей стадией жизненного цикла Facetotecta (из известных) является ипсигон - червеобразное существо, которое вылупляется из Y циприса. Предполагается, что испигон - это ювенильная стадия, которая ведет эндопаразитический образ жизни. Мы провели эксперимент по индуцированному метаморфозу с нашим беломорским видом, обработав живых циприсов гормоном линьки. К сожалению, нам не удалось получить живого ипсигона, так что эксперимент пришлось прервать, зафиксировав образцы для морфологического анализа. Нами были получены уникальные данные о процессе формирования ипсигона внутри циприса на раннем и более позднем этапах. Так, нами было показано, что практически все ткани и органы циприса наследуются ипсигоном, при этом теряя свою функциональную нагрузку (мышцы, сложные глаза, нервная система, жировые запасы). Поверхность испигона на данном этапе уже имеет тонкую кутикулярную выстилку, представленную эпикутикулой. Нами было также определено место, где будущий ипсигон выходит из экзувия циприсовидной стадии - это область с тонкой кутикулой, в передней вентральной части головного отдела. Нами показано, что по крайней мере на этапе метаморфоза, когда испигон еще находится внутри циприса, у него отсуствуют явные герминативыне структуры. Таким образом, нами показано, что ипсигон действительно является ювенилью, и а не взрослым организмом. Так что взрослая стадия может формироваться в результате линьки испигона, и ее морфология может существенно отличаться от червеобразной ювенили. Наши данные о внутреннем строении формирующегося ипсигона вошли в большую обзорную статью, написанную нашим коллегой Никласом Драйером с нашим соавторством и опубликованную в высокорейтиноговом журнале (Dreyer et al., 2023). 2. Изучение эволюции решётчатых органов и их изменение в процессе онтогенеза у ракообразных класса Thecostraca являлось одной из основных задач нашего проекта. Действительно, решётчатые органы, являющиеся дорсальными структурами карапакса, присутствуют у всех циприсовидных личинок текостак (Høeg, Kolbasov, 2002, Kolbasov et al., 2022). Взрослые стадии тексотрак (у Facetotecta неизвестны) сохраняют карапакс, причём, он может сильно модифицироваться у продвинутых форм: формировать известковый домик (Cirripedia Thoracica), сильно ветвящейся или спирально закрученный мантийный мешок у самок аскоторацид семейств Dendrogastridae и Lauridae соответственно. На карапаксе самок этих форм отсутствуют решётчатые органы, хотя у их циприсовидных личинок и карликовых самцов, сохраняющих типичный личиночный двустворчатый карапакс, они есть. В свою очередь наиболее примитивные (генерализованные) представители Ascothoracida (роды Sessilogoga, Synagoga, Waginella), характеризуются типичными двустворчатыми карапаксами у обоих полов, сходными по своей морфологии с карапаксами их циприсовидных (аскоторацидных) личинок, и имеют развитые решётчатые органы передних и задних пар, морфология которых лишь слегка отличается от личиночных (разное положение терминальных пор, см. Kolbasov, Newman, 2018, Kolbasov et al., 2020, Kolbasov et al., 2021). Взрослые стадии примитивных аскоторацид сохраняют подвижность и способны переплывать от одного хозяина к другому. Поэтому встаёт вопрос: являются ли решётчатые органы структурами, необходимыми в процессе движения текострак, например, при поиске хозяев, или же они присущи двустворчатому карапаксу даже у малоподвижных аскотрацид и отвечают за какие-то другие процессы, например одновременное созревание самок и самцов? В предшествующие годы нами была изучена ультраструктура карапакса семейства Ascothoracidae – аскоторацид, которые являются мезопаразитами офиур, но сохраняют у самок двустворчатый карапакс (см. Kolbasov, Petrunina, 2018). Было показано, что карапакс самок Ascothoracidae не обладает решётчатыми органами (есть у карликовых самцов). Более того для него не характерны такие структуры, как округлые и щелевидные поры и развитые щетинки, т.е. его поверхность практически гладкая. В процессе выполнения проекта нами был исследован материал по аскоторацидам рода Gorgonolaureus Utinomi, 1962. Представители этого рода, наряду с родами Isidascus Moyse, 1983, Cardomanica Lowry, 1985, Thalassomembracis Grygier, 1984 – мезопаразиты горгонарий (альционарий) и относятся к тому же семейству Synagogidae, что и примитивные Sessilogoga, Synagoga, Waginella, обладающие решётчатыми органами у самок. Представители Gorgonolaureus не способны переплывать от одного хозяина к другому и обитают в перманентных цистах – галлах, сформированным хозяином – кораллом. При этом самки сохраняют невздутый двустворчатый карапакс (хотя и увеличенный в размерах) и типичные плавательные торакоподы. Встаёт вопрос: какова наружная ультраструктура их карапакса и сохраняются ли решётчатые органы? Нами описан новый вид Gorgonolaureus imperator sp. nov., собранный на Императорском Подводном Хребте, с глубины 865-867 м. Это самый крупный представитель рода. С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) нами детально изучена морфология его карапакса (наружной и внутренней поверхностей) и самого тела (ротовых конечностей, антеннул, торакоподов, сегментов торакса и абдомена, фурки). В частности выявлен целый ряд новых диагностических признаков для рода и обсуждаются родственные связи с другими Synagogidae. Нами досконально изучена наружная ультраструктура карапакса и установлено, что у взрослых самок он полностью лишён решётчатых органов. Снаружи карапакс несёт лишь частые шиповидные выросты, у основания которых нередко располагаются небольшие округлые поры. На основании наших исследований можно сделать вывод, что такие дорсальные структуры карапакса, как решётчатые органы, необходимы для подвижных стадий Thecostraca (у большинства это циприсовидные личинки) и, вероятно, используются для поиска субстрата для оседания. У взрослых стадий Ascothoracida они сохраняются у подвижных форм, т.к. они способны переплывать от одного хозяина к другому и должны иметь возможность постоянно искать хозяев. По проведённым исследованиям нами подготовлена статья, которая принята к печати (Kolbasov G.A., Savchenko A.S. On the discovery of Gorgonolaureus imperator sp. nov. (Crustacea, Ascothoracida, Synagogidae) from the Emperor Seamount Chain, Pacific Ocean – the deepest and northernmost record of the genus. Deep-Sea Research Part II (accepted)). 3. Решетчатые органы являются морфологической аутапоморфией таксона Thecostraca, монофилия которого подтверждается также и по молекулярным данным. Однако нами было показано, что близкородственная группа ракообразных Tantulocarida, возможно также входит в состав Thecostraca, как сестринский таксон усоногим (Cirripedia) (Petrunina et al., 2014). Для поиска морфологических признаков, подтверждающих данную гипотезу мы обратились к строению сенсорных структур карапакса, которые есть у самцов тантулокарид. Судя по внешнему строению (имеются шесть пар плавательных торакоподов), именно самцы осуществляют активный поиск самки. Других задач у самцов тантулокарид нет, так как это свободно живущая не питающаяся стадия. В ходе исследования внутреннего строения самцов тантулокарид нами были детально исследован их сенсорный аппарат, который представлен парными пучками эстетасков, расположенными на переднем конце головы, а также парными ямками с щетинками. Сенсорный аппарат был исследован при помощи СЭМ и ТЭМ. Для всех описанных самцов характерно наличие семи пар таких сенсорных ямок, которые сгруппированы в два кластера – пять передних (А1-A5) и две задние пары (P1-P2) . Мы впервые провели ультрастурктурные исследования сенсорного аппарата тантулокарид на примере вида Arcticotantulus pertzovi. Нами показано, что чувствительные ямки имеют два типа строения. Первые (например, А5) представляют собой небольшое углубление в кутикуле с широким входом, ведущее в короткий круглый в сечении слепо замкнутый канал, залегающий параллельно поверхности кутикулы и имеющий толстые кутикулярные стенки. От верхней стенки канала, имеющей тонкую кутикулу, отходит одна щетинка диаметром около 1 мкм, которая почти сразу расщепляется на несколько (2-7) сенсилл. В основание щетинки заходит отросток дендрита. Сенсиллы 0,5 мкм в диаметре имеют полость, в которой также располагается тонкий нервный отросток. Другой тип пор (например, А4) характеризуется отсутствием описанного выше канала, такие поры представлены небольшим впячиванием покровов. От дна такой ямки, имеющего тонкую эпикутикулярную выстилку, отходит одна щетинка, имеющая расширенное основание и более тонкую ножку. Через ножку внутрь щетинки заходит нервный отросток Сенсорная природа ямок с сенсиллами впервые показана нами при помощи ТЭМ. Данные об ультратонком строении пор с сенсиллами опубликованы в статье «Сенсорные структуры карапакса самцов Tantulocarida не гомологичны решетчатым органам Thecostraca", которая принята в печать в журнал Доклады Академии наук, Науки о жизни. (Савченко, Колбасов, 2024). В данной публикации мы проводим сравнительно-морфологический анализ сенсорных структур карапакса самцов тантулокарид с решетчатыми органами Thecostraca, обсуждая их возможную гомологию. Мы можем отметить следующие схожие черты сенсорных структур тантулокарид и текострак: парный характер, постоянное число, локализация на дорсальной поверхности карапакса, а также некоторые ультраструктурные особенности - наличие в основе одной щетинки, которая выходит из углубления в покровах. Однако, общий план строения решетчатых органов сильно отличается от такового у сенсорных ямок самцов тантулокарид. У последних отсутствуют типичные структуры - терминальная пора и поровое поле. Важно отметить , что решетчатые органы передней и задней части карапакса представляют собой чувствительный компонент сложных гландулярно-сенсорных органов, в состав которых входят также непарные железы. Для самцов тантулокарид нами достоверно показано, что чувствительные ямки не ассоциированы ни с какими железистыми образованиями. Таким образом, наши данные скорее не подтверждают гомологию между сенсорными ямками карапакса самцов Tantulocarida и решетчатыми органами Thecostraca. Соответственно, результаты филогенетического молекулярного анализа, указывающие на сестринское положение Cirripedia и Tantulocarida (Petrunina et al., 2014) должны быть пересмотрены. 4. В ходе выполнения данного проекта мы работали также в веслоногими ракообразными (Copepoda) на примере представителей двух отрядов Calanoida и Monstrilloida. Каляноидные копеподы типичные обитатели пелагиали. Для многих видов из разных семейств описано наличие на дорзальной поверхности цефалоторакса специализированного гландулярно-сенсорного органа. Интересной особенностью является то, что такие структуры обнаружены только у взрослых самцов. Так называемый “головной бугорок” (CDH - cephalic dorsal hump) состоит из двух одноклеточных желез, открывающихся наружу отдельными порами и специализированного сенсора, представляющего собой область с утонченной кутикулой, к которой подходят отростки нейронов (Nishida, 1989). Автор затрудняется дать однозначный ответ о функции данной структуры, а также о наличии функциональной взаимосвязи между гландулярным и сенсорным компонентами. Для сенсорных образований, входящих в состав “головного бугорка” предполагается химическая рецепция. Важно отметить, что сенсорные компоненты имеют зачастую непарный характер и ассиметричное расположение, а их число может сильно варьировать даже среди особей одного вида. В этом году нами опубликована статья (Yurikova et al., 2023) в журнале из Q1 Arthropod Structure and Development, в которой мы исследуем внутреннее строение самок двух видов каляноид Calanus glacialis и Metridia longa, а именно устройство их половой системы. Для исследования строения впервые для копепод был применен метод 3 реконструкции по серии полутонких срезов. Для детального изучения особенностей устройства репродуктивной системы были также применены КЛСМ, ТЭМ, СЭМ. В ходе детального обследования самок каляноидных копепод из двух семейств мы пытались обнаружить какие-либо признаки присутствия структур аналогичных “головному бугорку” самцов. Однако наши данные подтверждают гипотезу, что эти гландулярно-сенсорные образования специфичны для самцов и отсутствуют у самок даже одноименных видов. Монстриллоидные копеподы обладают уникальным среди ракообразных жизненным циклом с ларвальным паразитизмом. Уже первая науплиальная стадия сразу после вылупления из яйца является инвазионной и обладает приспособлениями для проникновения в хозяина. Последующие науплиальные и копеподитные стадии явлюятся эндопаразитическими. В качестве хозяев монстриллоиды используют различных моллюсков (Gastropoda, Bivalvia), а также многощетинковых червей. Последняя копеподитная стадия выходит из хозяина через разрыв стенки тела и линяет во взрослую особь. Самцы и самки монстриллоид являются свободноживущими не питающимися планктонными организмами. Полученный в 2022 году материал по Monstrilloida из Северного моря, а также материал, собранный нами в ходе экспедиции на Тайвань и в Малайзию был исследован при помощи КЛСМ и СЭМ. Мы также провели исследование внутреннего строения самки Monstrilla sp. из Бергена при помощи микрокомпьютерной томографии. Наша задача была найти дорзальные сенсорные органы, описанные для других планктонных копепод (Nishida, 1989). Однако при детальном обследовании дорзальной поверхности цефалоторакса подобные структуры обнаружены не были. Планктонный подвижный образ жизни характерен для монстриллодиных копепод только на взрослых стадиях. Монстриллоид традиционно роднят с другим полностью паразитическим таксоном Siphonostomatoida. Поэтому отсутствие у них дорсальных органов не стало для нас сюрпризом. Скорее всего, дорсальные органы описанные для копепод отряда Calanoida, являются специализированными адаптивными образованиями именно этого таксона, а их наличие не связано с планктонным образом жизни. 5. Одной из основных задач нашего проекта было исследование и сравнение дорзальных сенсорных структур, которые были ранее выявлены у всех трех таксонов Multicrustacea. Для представителей Thecostraca (на примере циприсовидной стадии Facetotecta) нами получены собственные данные о строении и ультраструктуре переднего и заднего комплексов решетчатых органов. Для Malacostraca в литературе имеются обширные данные о внутреннем строении, включая ультраструктуру так называемых дорзальных сенсорных органов (Sensory Dorsal Organs - SDO). Такие органы были обнаружены у различных групп малакострак как на личиночных стадиях, так и у взрослых особей (Lerosey-Aubril, Meyer, 2012). Дорсальные органы малакострак имеют очень характерное строение, и у разных таксонов отличия проявляются лишь в деталях. Фактически, дорзальный орган представляется собой гландулярно-сенсорную структуру. В состав каждого органа входит непарная одноклеточная железа, которая открывается наружу единой порой. Вокруг поры симметрично располагаются парные сенсорные структуры, представляющие собой области с сильно утонченной кутикулой, на которых может присутствовать одно или несколько отверстий - пор. Дорзальные органы располагаются вдоль медианной линии на карапаксе. Таких органов обычно два - передний и задний. Число сенсорных элементов, входящих в состав дорзального органа постоянно и варьирует от четырех до десяти. Показано, что иннервация переднего дорзального органа осуществляется от тритоцеребрума. К каждому сенсору подходят четыре дендритных отростка. Функции как всего дорзального органа, так и отдельных его компонентов (чувствительного и гландулярного) до сих не определены (Lerosey-Aubril, Meyer, 2012), как не определена и непосредственная связь между данными двумя компонентами. Предполагается, что сенсорные структуры являются органами химического чувства. При помощи сканирующей микроскопии мы провели исследование дорзальной поверхности карапакса личинки Decapoda на стадии зоэа. Личинки декапод были получены нами в ходе экспедиции на станцию Эспегренд (г. Берген) при помощи планктонной световой ловушки. Особи были зафиксированы 2,5 % глютаровым альдегидом и подготовлены для сканирующей электронной микроскопии. На нашем экземпляре показано наличие обоих переднего и заднего дорзальных органов. Передний дорзальный орган представляет собой небольшое возвышение с гладкой кутикулой. В центре возвышения располагается непарное отверстие железы. Сенсорные структуры представлены двумя парами областей овальной формы, каждая из которых несет одну пору. В состав заднего дорзального органа входит непарная железа и 3 пары схожих по строению сенсоров. Сравнение морфологических особенностей дорсальных структур карапакса Malacostraca, Copepoda и Thecostraca является важным инструментом филогенетического анализа. Очевидно, что молекулярные подходы не всегда позволяют получить достоверный результат. Так, очередная попытка реконструировать древо ракообразных привела к еще более противоречивым результатам (Bernot et al., 2023) - монофилия таксона Multicrustacea не подтвердилась, а входящие в него группы разнесены по разным частям древа. На данном молекулярном древе только Thecostraca и Malacostraca сохраняют сестринское положение, а веслоногие ракообразные сближаются с Branchiopoda. Можем ли мы теперь подтвердить или опровергнуть эту гипотезу, используя данные о строении дорзальных органов? Наши данные о строении комплекса решетчатых органов Thecostraca подтверждают уже высказанную ранее гипотезу о гомологии этой структуры с дозальным сенсорным органом Malacostraca. Действительно, несмотря на некоторые различия, принципиальное устройство этих двух гландулярно-сенсорных органов очень схоже. В основе органа - непарная железа, вокруг которой симметрично располагаются парные сенсорные структуры (хеморецепторы), представляющие собой область с тонкой кутикулой, к которой подходят дендритные отростки. У всех Thecostraca, а также у большинства исследованных малакострак имеется два подобных органа - передний и задний, а число сенсорных элементов, входящих в их состав, постоянно для каждого вида. “Дорзальный бугорок” самцов каляноидных копепод также является гландулярно-сенсорным органом. Однако, по основным критериям, гомология его с дорзальными структурами Thecostraca и Malacostraca не подтверждается. Это касается как внешней морфологии, так и ультраструктуры: вариабельное число сенсорных элементов, наличие двух отдельных желез, присуствтвие только одного такого органа на поверхности цефалоторакса и только у одного из полов - все это не позволяет сделать вывод о гомологии. Скорее всего у самцов каляноидных копепод этот орган возник независимо. Подводя итоги, результаты нашего сравнительно-морфологического анализа дорзальных гландулярно-сенсорных органов подтверждают концепцию таксона Communostraca, включающего Thecostraca+Malacostracа и отвергают родство Thecostraca + Copepoda, в рамках таксона Hexanauplia. В ходе выполнения нашего проекта, мы достоверно показали отсутствие типичных дорзальных органов гландулярно-сенсорной природы как у самцов, так и у личинок Tantulocarida. Это позволяет нам опровергнуть собственные данные о вхождении Tantulocarida в состав Thecostraca, которые были получены молекулярными методами.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".