ИСТИНА

глубокое функциональное профилирование бактериальных сообществ с целью идентификации штаммов бактерий, проявляющих бактериолитические свойства.

During the implementation of the 2019-2021 project, we showed that the microbiome of wild animals is an extremely promising reservoir for the search for new strains that exhibit anatagonistic activity against a variety of pathogens. In the course of further implementation of this project, deep functional profiling of bacterial communities will be carried out in order to identify bacterial strains exhibiting bacteriolytic properties. As a source of microorganisms "effectors" it is supposed to use natural sources of microbiota. As part of the implementation of the tasks of this project, we plan to continue using the oral microbiota of wild animals, soil microbiota and bacteria from the collections of microorganisms in collaboration with the laboratory of prof. K.V. Severinova (Skolkovo Institute of Science and Technology, hydrobionts of the Northern Sea Route), Federal Research Center of Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences (microbiota of the oral cavity of animals, which are characterized by hibernation (bear, badger)), the White Sea Biological Station (microbiota of beluga whales) and ICBFM SB RAS (samples soils). Killer bacteria, selected using an ultra-high-throughput microfluidic platform, will undergo large-scale sequencing, culture metabolomic and proteomic analyzes to identify effector molecules. Potential lytic enzymes will be identified on the basis of homology with known enzymes, the presence of their peptide fragments in the secretion of selected killer bacteria, as well as the inhibitory properties of the high-molecular fraction of the conditioned killer bacteria environment. The resulting candidates will be validated as a result of heterologous production in Pichia pastoris yeast cells. For representatives of the most diverse classes of proteins, the optimization of gene sequences for heterologous production in P. pastoris yeast cells will be performed, the genes will be synthesized and cloned into expression cassettes. Recombinant proteins obtained in the yeast system will be analyzed for the presence of antimicrobial properties on a panel of pathogenic bacteria strains in order to identify their spectrum of activity. The resulting recombinant lytic agents will be characterized in detail in terms of the effectiveness of the bactericidal action, as well as the rate of emergence of antibiotic resistance to them. For the most promising agents, a study of the mechanism of action will be carried out, including sequencing of bacterial strains with emerging resistance. In the case of identification of previously undescribed mechanisms, a biochemical study of the substrate specificity will be performed, as well as the determination of the spatial structure using the methods of X-ray structural analysis. The results obtained will be published in high-rated journals, according to the results of the work, it is planned to publish 9 articles, as well as participation in domestic and international conferences. If a new class of highly effective antimicrobial agents is discovered, it is planned to obtain patents for their method of obtaining and using. The relevance of research in the field of antibiotic resistance can hardly be overestimated. Under the auspices of the Interdepartmental Council under the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, a comprehensive plan of scientific research to reduce antimicrobial resistance is being developed, including the study of the mechanisms of the emergence of antimicrobial resistance, the development of antimicrobial drugs and alternative methods, technologies and means for the prevention, diagnosis and treatment of infectious diseases. One of the common consequences of COVID-19 is a significant increase in the risk of contracting bacterial infections, which in turn increases the number of antibacterial drugs used and accelerates the formation of antibiotic resistance to them. Thus, the implementation of this project will make it possible to come very close to the creation of new antibiotic drugs for the treatment of infectious diseases.

В ходе реализации проекта 2022-2023 будут изучена микробиота образцов гидробионтов Северного морского пути, диких животных Дальнего востока и образцы почв Центральной России и Сибирского федерального округа. Будет проведено их глубокое функциональное профилирование бактериальных сообществ с целью идентификации штаммов бактерий, проявляющих бактериолитические свойства. Будут получены штаммы-продуценты антимикробных соединений, проведена идентификация и оценка их антимикробных свойств на панели штаммов патогенных бактерий с целью идентификации их спектра активности. Полученные соединения будут детально охарактеризованы с точки зрения эффективности бактерицидного действия, а также скорости возникновения антибиотикорезистентности к ним. Для наиболее перспективных агентов будет проведено исследование механизма действия включающее секвенирование штаммов бактерий с возникшей резистентностью. Особое внимание будет уделено бактериолитическим ферментам. Являясь высокоэффективными природными токсинами бактерий, бактериолитические ферменты представляют особенно высокий интерес, так как обладают уникальными параметрами эффективности, селективности и, в отличие от большинства антибиотиков, приводят к непосредственному разрушению клеток бактерий, что особенно актуально для решения проблем, связанных с антибиотикорезистентностью. В целом проект направлен на решение задач Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г (распоряжение Правительства РФ от 25 сентября 2017 г. № 2045-р), а также может рассматриваться как одним из показателей достижения целей разрабатываемого под эгидой Межведомственного совета при Минобрнауки России комплексного плана научных исследований по снижению антимикробной резистентности.

При реализации проекта 2019-2021 мы показали, что микробиом диких животных является чрезвычайно перспективным резервуаром для поиска новых штаммов, проявляющих анатагонистическую активность в отношении разнообразных патогенов.

Идентифицированы перспективные образцы микробиоты с высоким разнообразием бактерий, а также наличием бактерий-антагонистов. Также проведен анализ образцов, включавших почвы как различных регионов РФ, так и зарубежных стран. С помощью высокопроизводительного микрофлюидного отбора из данных образцов был проведен отбор штаммов-продуцентов веществ, проявляющих антибиотическую или антифунгальную активность. Проведена культивация отобранных штаммов-продуцентов, проведен подбор оптимальных условий культивации. Исследована новая форма культивации - 3D культивация в объеме эмульсионной культуры. Проведены исследования по кокультивации пяти отобранных штаммов с бактериями-мишенями и показано, что эмульсионная 3D культивация в присутствии бактерий S. aureus приводит к индукции биосинтеза антимикробных агентов. Проведен протеомный анализ штаммов, наиболее ярко продемонстрировавших свои ингибирующие свойства. Детальный метаболомный и протеомный анализ позволил идентифицировать известные антибиотики, а также их метаболиты. С помощью геномного анализа установлена принадлежность штамма ВА8-5, отобранного ранее в результате ультравысокопроизводительного скрининга, к Bacillus simplex. Обнаружено, что штамм ВА8-5 продуцирует группу липопептидов семейства фенгицинов. Исследованы антимикробные свойства четырех бактериолитических ферментов-гомологов белка открытого нами ранее ритафина и показана высокая активность новых бактериолитических ферментов, а также высокий потенциал расширения их спектра активности. Проведено сравнение двух литических ферментов, ритафина и лизостафина, полученных в гетерологической системе, по нескольким параметрам. Обнаружено, что несмотря на идентичность субстратной специфичности и сходство кинетических характеристик при гидролизе модельного субстрата, ритафин имеет отличный от лизостафина спектр активности и может подавлять рост некоторых штаммов S. xylosus с очень низким значением МИК. Различие в спектре активности объясняется более эффективным связыванием с клеточной стенкой S. xylosus или большей доступностью мостика в пептидогликане этой бактерии для ритафина, чем для лизостафина. Проведена идентификация генов кластера биосинтеза лантипептида, продуцируемого штаммом S39-13. Удалось осуществить перенос биосинтетического кластера в гетерологический продуцент, выполнен подбор условий культивации рекомбинантного штамма-продуцента лантипептида, и исследуемое вещество наработано в количествах, достаточных для проведения предварительных структурно-функциональных исследований. Было показано, что полученная гетерологическая система позволяет получать полностью модифицированный лантипептид, схожий с природным.