Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Na+ и Н+ в бактерияхНИР

Comparative study of proton and sodium generators of transmembrane difference of electrochemical potentials of Na+ and H+ ions in bacteria

Источник финансирования НИР

НТП: Научно-техническая программа, Государственная научно-техническая программа России "НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ БИОИНЖЕНЕРИИ"

Этапы НИР

# Сроки Название
1 10 сентября 1992 г.-31 августа 1993 г. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТОННЫХ И НАТРИЕВЫХ ГЕНЕРАТОРОВ ТРАНСМЕМБРАННОЙ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ ИОНОВ Na+ и Н+ В БАКТЕРИЯХ
Результаты этапа: Показано, что терминальный участок дыхательной цепи гало- и ал- калотолерантной бактерии Bacillus FTU способен к транспорту H+ и Na+ . Транспорт H+ подавлялся на порядок меньшими концентрациями KCN, чем транспорт Na+ . У E.coli транспорт Na+ на терминальном участке дыхательной цепи обнаружен на мутантных и диких штаммах, содержащих оксидазу d-типа. Показано, что у Bac.FTU функционируют по крайней мере две тер- минальные оксидазы саа3- и о-типа. Первой из них, на порядок более чувствительной к цианиду, по чувствительности к этому же ингибито- ру соответствовал транспорт Н+. По устойчивости к цианиду можно было сопоставить вторую оксидазу, о-типа, и наблюдаемый транспорт Na+ . Известно, что у E.coli имеются две оксидазы, о- и d-типа. Ок- сидаза о-типа ответственна за транспорт Н+, а для оксидазы d-типа установлено отсутствие этой функции. Физиологический подход выявил сходство между оксидазами сaа3-типа Bac.FTU и о-типа E . c o l i , инду- ровавшимися в начале логарифмической фазы роста, и между оксидаза- ми о-типа Bac.FTU и d-типа E. c o l i , индуцировавшимися в конце лога- рифма. Впервые показано, что характер рекомбинации с СО точно сов- падает для двух окдидаз: сaа3-типа из Bac.FTU (предположительно выполняющей роль Н+-помпы) и о-типа из E.coli (являющейся Н+-пом- пой). Кинетика процесса монофазна, и t составила 25-30 мс. Две другие оксидазы, о-типа из Bac.FTU И d-типа из E.coli, обнаружили еще более удивительное сходство: кинетика их реассоциации с СО была трехфазной с t, совпадающими для каждой фазы, - 35-70 мкс для первой, 250-500 мкс для второй и 2-5 мс для третьей. Разделение оксидазных комплексов в грубых мембранных экстрактах с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях с последующим окрашиванием белковых зон на оксидазную активность и на гем пока- зала, что по способности окислять ТМФД оксидазные комплексы изуча- емых бактерий делятся на те же две группы. Таким образом, показано наличие двух семейств оксидаз с разными механизмами преобразования энергии: одно переносит Н+ через мембрану, другое, по-видимому, Na+. Проведена очистка в препаративных количествах оксидазы о-типа Вас . FTU. При изучении аминокислотных последоватетельностей N-концевых участков субъединиц фермента обнаружено наличие защиты. Другая часть работы была связана с поиском АТФаз, способных участвовать в транспорте Na+ в мембранах морской бактерии Vibrio a l g i n o l y t i c u s . Обнаружен белок с молекулярной массой ~60 кДа, об- ладающий АТФазной активностью. Установлена его гомология с пред- ставителями белков теплового шока.
2 8 сентября 1993 г.-30 сентября 1994 г. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТОННЫХ И НАТРИЕВЫХ ГЕНЕРАТОРОВ ТРАНСМЕМБРАННОЙ РАЗНОСТИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ ИОНОВ Na+ и Н+ В БАКТЕРИЯХ
Результаты этапа: Ранее нами было показано, что в мембранах бактерии Bacillus sp.FTU содержится по крайней мере два типа оксидаз: сааЗ и bo. По- сле воздействия лазерной вспышки первая оксидаза медленно, а вто- рая быстро рекомбинируют с монооксидом углерода (СО), имея сход- ство соответственно с оксидазами E.coli bo- и bd-типа. Выделяемые нами по признаку сходства при рекомбинации с СО семейства оксидаз были проанализированы на содержащиеся в них гемы методом распреде- лительной хроматографии в обращенных фазах при высоком давлении. Результаты сравнительного анализа гемов из восьми различных гем- содержащих образцов показали, что оксидаза сааЗ-типа из Bacillus sp.FTU содержит гемы типа А и С, а оксидаза, ранее относимая к bо- типу, содержит гемы типа В и С. Проводили атомно-эмиссионный (с индуктивно связанной плазмой) анализ образцов терминальных оксидаз на разных этапах очистки на содержание в них ионов меди. Были использованы препараты оксидаз из митохондрий сердца быка, из мембран бактерий Escherichia coli и Bacillus sp.FTU. Показано, что оксидаза сааЗ-типа из Bacillus sp.FTU содержит три атома меди на молекулу фермента и имеет сход- ство с оксидазой из митохондрий, а другая оксидаза из Bacillus sp. FTU, о-типа, подобна оксидазе d-типа из E.coli и не содержит меди. Процесс очистки двух оксидаз из Bacillus sp.FTU был подвергнут тщательному количественному анализу. Обнаружено, что на определен- ных этапах очистки изучаемые ферменты теряют удельную активность. Сделано предположение, что именно на этих этапах о т д е л я ю т с я ком- поненты, образующие с ферментами физиологические комплексы в мем- бранах бактерии. Поиск таких компонентов показал, что для оксидазы сааЗ им является мембранный цитохром с 552,5. Обнаружено, что ци- тохром с 552,5 восстанавливает утраченную в процессе очистки акти- вность оксидазы сааЗ. Оксидаза сааЗ встроена в липосомы по модифи- цированному методу Рэкера. В полученных протеолипосомах зареги- стрировано выделение Н+ в процессе оксидазной реакции с искус- ственным донором е ТМФД. Сделан вывод, что Н+-переносящие оксидазы содержат медь и род- ственные высокоспиновые гемы А и О типов, а оксидазы, предположи- тельно переносящие Na+, имеют в своем составе родственные гемы B и D типов и не содержат меди. Оксидазы, имеющие в своем составе только гемы В, предложено относить к bb-типу.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".