Регуляторная роль нейротоксичной небелковой аминокислоты бета-N-метиламин-L-аланина (БМАА) в метаболизме цианобактерий и растений.НИР

Regulatory role of neurotoxic non-proteinogenic amino acid betta-N-methylamino-L-alanine in metabolism of cyanobacteria and plants.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Регуляторная роль нейротоксичной небелковой аминокислоты бета-N-метиламин-L-аланина (БМАА) в метаболизме цианобактерий и растений.
Результаты этапа: Растения и микроорганизмы синтезируют большое количество различных вторичных метаболитов. Среди них идентифицированы несколько сотен небелковых аминокислот. Функции многих из них в метаболизме продуцентов пока мало изучены. Большой интерес, особенно с точки зрения экотоксикологии, представляет небелковая аминокислота бета-N-метиламин-L-аланин (БМАА), синтезируемая цианобактериями и диатомовыми водорослями. Полагают, что ее накопление в организме способствует развитию серьезных нейродегенеративных заболеваний у животных и человека. Проект направлен на изучение регуляторных функций БМАА в ключевых процессах, протекающих в клетках цианобактерий и высших растений. На первом этапе выполнения проекта проведено изучение особенностей экспрессии генов, контролирующих процессы дифференцировки гетероцист и синтеза нитрогеназы цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120 под действием БМАА. Впервые экспериментально показано, что добавление микромолярных количеств БМАА к голодающим по азоту клеткам цианобактерии приводит к подавлению развития специализированных клеток – гетероцист, необходимых для фиксации атмосферного азота. Обнаружено, что в присутствии БМАА значительно снижается уровень экспрессии ключевых генов (hetR и hepA), продукты которых участвуют в регуляции процесса формирования гетероцист. Выяснилось, что при действии БМАА на культуру цианобактерий с уже сформированными гетероцистами, прекращается экспрессия гена nifH, кодирующего субъединицу нитрогеназы – ключевого фермента, осуществляющего азотфиксацию. Предложена схема регуляции процесса формирования гетероцист и активности нитрогеназы небелковой аминокислотой БМАА. Подготовлена публикация, представляющая полученные результаты. Защищена кандидатская диссертация на тему «Биологическая активность вторичных метаболитов бактерий - летучих органических соединений и небелковой аминокислоты бета-N-метиламин-L-аланина» (автор Попова А.А., руководитель Кокшарова О.А.). Получены первые результаты электронной микроскопии (ТЕМ) клеток цианобактерий после воздействия БМАА. Детальный анализ ультраструктурных изменений будет продолжен на втором этапе. Для изучения роли БМАА в регуляции изменений количества внутриклеточного кальция закуплены необходимые реактивы, изучена литература и начата отработка методики измерений внутриклеточных концентраций кальция в цианобактерии Anabaena (Nostoc) sp. PCC7120 с применением кальций-связывающего белка экворина. Начаты исследования воздействия БМАА на деление клеток растений с использованием Allium test. Обнаружено, что в микромолярных концентрациях БМАА способен подавлять деление клеток лука. В отчетный период изучалась возможность сорбции БМАА из водной среды с помощью современных углеродных наноматериалов. На первом этапе выполнения проекта проведено тестирование нескольких наносрбентов по их способности удалять БМАА из водных растворов. Выявлен наиболее перспективный сорбент. Кроме того, получены и протестированы в модельных системах комплексы углеродного наноматериала "Таунит" с бактерицидными агентами (антибиотиком левомицитином и гербицидом диуроном) для борьбы с цианобактериальными обрастаниями, являющимися потенциальными источниками цианотоксинов, и приводящими к биодеградации поверхностей. Результаты опубликованы в англоязычной версии журнала "Физиология растений".
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Регуляторная роль нейротоксичной небелковой аминокислоты бета-N-метиламин-L-аланина (БМАА) в метаболизме цианобактерий и растений.
Результаты этапа: Задача 1. Исследовать биологические эффекты действия БМАА на клетки Anabaena sp. PCC 7120 в среде роста, содержащей связанный азот. Обработка и анализ результатов ПЦР в реальном времени. Подготовить и опубликовать статью. Цианобактерии синтезируют нейротоксичную аминокислоту β-N-метиламино-L-аланин (BMAA), накопление которой в организме связывают с развитием нейродегенеративных заболеваний человека. Роль этой небелковой аминокислоты в клетках цианобактерий изучена недостаточно. На первом этапе выполнения проекта мы впервые показали, что BMAA в микромолярных количествах ингибирует образование гетероцист (специализированных азотфиксирующих клеток) в условиях азотного голодания в диазотрофных цианобактериях [Anabaena sp. PCC 7120, Nostoc punctiforme PCC 73102 (ATCC 29133), Nostoc sp. strain 8963)]. Кроме того, мы обнаружили, что в присутствии BMAA, Anabaena sp. PCC 7120 не экспрессирует два существенных гена (hetR и hepA), связанных с дифференцировкой гетероцист и активностью нитрогеназы (nifH). Ингибирующее действие BMAA устранялось добавлением глутамата. Полученные результаты были опубликованы в отчетный период в виде статьи в журнале «Environmental microbiology reports». Popova A., Rasmussen U., Semashko T., Govorun V., Koksharova O. Stress effects of cyanotoxin β-methylamino-L-alanine (BMAA) on cyanobacterial heterocyst formation and functionality. Environmental microbiology reports, 2018, v.10, № 3,369-377, DOI: 10.1111/1758-2229.12647 Однако, влияние BMAA на диазотрофные цианобактерии в условиях избытка азота оставалось неизвестным. На втором этапе выполнения нашего проекта мы исследовали экзогенное влияние BMAA на Anabaena sp. PCC 7120 в присутствии азота (нитрата натрия или хлорида аммония). Поскольку образование гетероцист является сложным и энергозатратным процессом, при наличии комбинированного азота в среде роста образование гетероцист блокируется и нити цианобактерий содержат только вегетативные клетки. Мы обнаружили новый неожиданный регуляторный эффект BMAA на цианобактерию Anabaena sp.PCC 7120. Добавление BMAA к цианобактериям, растущим на среде с нитратом или аммонием, приводит к формированию гетероцисто-подобных клеток, которые выглядят как темные нефлуоресцирующие клетки (Рис.1, 2). С помощью газовой хроматографии и ацетиленового теста мы установили, что эти клетки нефункциональны (Таблица 1). В этих клетках отсутствует нитрогеназная активность. Нами было обнаружено, что глутамат устраняет опосредованнуое BMAA формирование гетероцисто-подобных клеток. При одновременном добавлении глутамата и ВМАА гетероцисто-подобные клетки не обнаруживались. Для того, чтобы понять генетическую составляющую этого явления, мы использовали количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR). Использование qPCR позволило нам выявить влияние BMAA на транскрипционную активность нескольких важных генов (hetR, hepA. ntcA, nifH, glnA, gltS, nirA), которые вовлечены в формирование гетероцист и в процессы усвоения азота в Anabaena sp. PCC 7120. Оказалось, что BMAA индуцирует экспрессию генов, необходимых для формирования гетероцист в условиях, когда эти гены должны «молчать» (в репрессивных условиях). Мы показали, что экспрессия нескольких существенных генов (hetR, hepA. nifH, glnA, gltS) увеличивается в присутствии BMAA в репрессивных условиях (Таблица 2). Результаты исследования опубликованы в отчетный период в виде статьи в журнале «Toxins». Popova A., Semashko T., Kostina N., Rasmussen U., Govorun V., Koksharova O. The cyanotoxin BMAA induces heterocyst specific gene expression in Anabaena sp. PCC 7120 under repressive conditions. Toxins, 2018, v.10, № 11, DOI: 10.3390/toxins10110478 Таким образом, нам удалось обнаружить необычный регуляторный эффект небелковой аминокислоты БМАА на экспрессию генов цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 и морфогенез ее клеток. БМАА изменяет регуляцию азотного метаболизма и клеточной дифференцировки Anabaena sp. PCC 7120. На генетическом уровне это влияние БМАА обусловлено изменением экспрессии генов hetR, hepA, nifH и других. В условиях азотного голодания БМАА репрессирует формирование гетероцист, а в условиях избытка азота индуцирует образование нефункциональных гетероцист. Мы предполагаем, что этот эффект может быть связан главным образом с воздействием БМАА на метаболизм глутамата и глутамина. Являясь аналогом глутамата, БМАА может приводить к нарушению нормального функционирования глутаминсинтетазы. В случае, когда БМАА добавляют к культуре цианобактерий, уже содержащей сформированные гетероцисты, это может приводить к нарушению работы глутаминсинтетазы и накоплению ионов аммония в гетероцистах, что ведет к ингибированию нитрогеназной активности (рисунок 3). Это мы наблюдаем в эксперименте. Любопытно, что в работе [Lage, S.; Ström, L.; Godhe, A.; Rydberg, S. The effect of exogenous β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) on the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira weissflogii. Harmful Algae 2016, 58, 85–92] было показано, что добавление этого цианотоксина к диатомовым водорослям приводит к выделению их клетками аммония в среду роста. То есть, и в диатомовых водорослях БМАА затрагивает метаболизм азота через путь синтеза глутамата и глутамина (GS/GOGAT pathway), ингибируя ассимиляцию аммония. Как объяснить действие БМАА на голодающие по азоту клетки? В условиях переноса цианобактериальной культуры с богатой азотом среды в безазотистую среду, цианобактерия испытывает нехватку этого важного элемента и должна формировать специализированные клетки – гетероцисты. Но при добавлении БМАА этот процесс блокируется. Мы не знаем точного механизма действия БМАА в этих условиях. Но мы предлагаем гипотезу, которая нуждается в экспериментальной проверке (рисунок 4). Известно, что БМАА может встраиваться в белки высших организмов вместо серина. Если такое же ошибочное встраивание происходит и в цианобактериальных клетках, то БМАА может инактивировать активность ключевого регуляторного белка HetR, управляющего начальными этапами дифференцировки гетероцист. Этот белок является сериновой протеазой и активируется, разрезая самого себя. Если вместо серина встроился БМАА, протеаза неактивна, дальнейшие этапы процесса морфогенеза гетероцист блокируются. И наконец, в условиях избытка азота БМАА может воздействовать на путь ассимиляции азота (GS/GOGAT pathway), что приводит к накоплению 2-оксиглутарата, являющегося сигнальной молекулой, свидетельствующей о дисбалансе между содержанием углерода и азота в клетке (рисунок 5). При накоплении этого метаболита поступает сигнал о голодании по азоту и запускается регуляторный каскад событий,приводящий к формированию гетероцист. В условиях избытка азота БМАА запускает этот каскад событий, но формируются не активные гетероцисты, а нефункциональные гетероцисто-подобные клетки. Мы перечислили некоторые из возможных гипотез. Дальнейшие эксперименты должны помочь понять эту непростую регуляторную ситуацию. Задача 2. Протеомный анализ действия БМАА на цианобактерии Этот этап работы посвящен анализу множественных изменений экспрессии белков при действии БМАА на клетки цианобактерий в различных условиях выращивания (на среде с азотом, при голодании по азоту, в условиях диазотрофного роста со зрелыми гетероцистами). Протеомный анализ дополняет и расширяет картину функциональных нарушений в клетках цианобактерий при действии БМАА, полученную нами ранее методом ПЦР в реальном времени. Экспериментальный этап работы был выполнен в сотрудничестве с лабораторией академика РАН, профессора Говоруна В.М. в ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА на базе имеющегося в этом центре протеомного оборудования. Нами проводится анализ полученных результатов. Обнаружено, что большое количество различных белков в разной степени изменяет свою экспрессию в присутствии ВМАА. Анализ происходящих изменений был начат на втором этапе выполнения проекта. Детальный анализ произошедших в присутствии ВМАА протеомных изменений в клетках Anabaena sp. PCC 7120 будет продолжен на третьем этапе выполнения проекта. Задача 3. Получение инсерционного мутанта цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, лишенного глутаматного рецептора. Глутаматные рецепторы (GluRs) представляют собой контролируемые глутаматом кальциевые каналы, участвующие в сигнальных процессах в эукариотических клетках. В цианобактериях сигналы кальция участвуют в регуляции образования специализированных клеток - гетероцист. Информация о GluRs цианобактерий очень ограничена. Мы осуществили филогенетический анализ GluR белков для17 видов цианобактерий на основе аминокислотных последовательностей, выбранных в соответствии с последовательностями гомологичных белков Synechocystis sp. PCC 6803 и Nostoc sp. PCC 7120. В качестве контрольной группы были использованы гамма-протеобактерии Pseudoalteromonas haloplanktis и Pseudomonas oleovorans, а также альфа-протеобактерия Silicibacter sp. Самым значительным результатом является кластеризация Silicibacter и P. haloplanktis вместе с цианобактериями: в одном кластере с Silicibacter имеются преимущественно ничатые, образующие гетероцисты цианобактерии, что указывает на общее происхождение GluR у представителей родов Nostoc, Anabaena, Calothrix. Бактерия P. haloplanktis сгруппирована вместе с группой одноклеточных диазотрофных и недиазотрофных морских и пресноводных цианобактерий (Рис. 6). Наличие в корне дерева GluR одного эталонного вида - P. oleovorans предполагает наличие во время эволюции двух горизонтальных переносов генов, кодирующих GluR. Тот факт, что GluRs образующих гетероцисты цианобактерий образуют один кластер, позволяет предположить, что этот рецептор может участвовать в регуляции дифференцировки гетероцист. Lazebny O., Lazebnaya I., Koksharova O. Phylogenetic Analysis of Cyanobacterial Glutamate-like Receptors: the First Overlook. Molecular Phylogenetics: Contributions to the 5th Moscow International Conference «Molecular phylogenetics and biodiversity biobanking», 2018, p.85, DOI: 10.30826/MolPhy2018-53 Мы начали начать изучение возможного действия БМАА на глутаматный рецептор этих цианобактерий. Для нами была поставлена задача: получить мутанта цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, лишенного глутаматного рецептора. На втором этапе выполнения проекта была сконструирована рекомбинантная плазмида на основе вектора pRL 498, несущая делетированную копию гена all2911 (ABC transporter glutamine-binding protein, all2911, GeneID:1106509, Locus NP_486951). На третьем этапе выполнения проекта полученная конструкция будет перенесена с помощью конъюгации в клетки штамма дикого типа цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120. Мы рассчитываем получить устойчивые к канамицину конъюганты, несущие инсерцию плазмиды в геноме. Задача 4. Отработка метода определения внутриклеточного кальция в цианобактериях Эта задача имеет самостоятельное значение, а также связана со третьей задачей, изложенной выше. Известно, что изменения концентрации кальция в клетке могут регулировать различные процессы, в том числе и дифференцировку гетероцист. Отработав методику измерения внутриклеточных концентраций кальция, мы, вероятно, будем способны ответить на вопрос, оказывает ли БМАА регуляторное действие на изменения внутриклеточных концентраций кальция. На втором этапе выполнения проекта мы занимались откладкой методики измерения концентраций кальция in vitro с использованием рекомбинантного белка экворина (aequorin) из медузы эквореи [Torrecilla et al., 2000]. Белок люминесцирует в присутствии ионов кальция. При связывании ионов кальция белком простетическая группа этого белка (целентеразин) окисляется до целентерамида и СО2 и переходит в возбужденное состояние. При возвращении в релаксированное состояние испускается свет в синем диапазоне (при длине волны 460-469 нм) (рисунок 7). В ходе отработки методики мы обнаружили, что сигнал можно наблюдать в течение очень короткого времени. Так, наблюдается стремительное (1-2 сек) угасание сигнала флуоресценции, испускаемой белком при связывании с кальцием. Мы продолжаем осваивать методику определения активности экворина, построение калибровочных кривых, стандартизацию измерений. Методика оказалась непростая. Работа будет продолжена. Задача 5. Изучение транспозонных мутантов, устойчивых и чувствительных к действию БМАА. Изучались физиологические характеристики нескольких мутантов, обладающих различной устойчивостью к действию БМАА (рисунок 8). Работа будет продолжена. Задача 6. Выявление особенностей адсорбции БМАА из водных растворов при использовании новых углеродных наноматериалов. На втором этапе была продолжена работа по изучению сорбции ВМАА на различные углеродные наноматериалы из водных растворов. Кроме того, поскольку ВМАА может также включаться в состав пептидов, в нашей группе была проведена работа по изучению сорбции пептидов на функционализированные и нефункционализированные нанотрубки «Таунит». Этот экспериментальный материал был опубликован в виде статьи на русском и английском языках. 2018 Удаление антимикробных пептидов из водных растворов с помощью углеродных нанотрубок Тимофеева А.В., Ксенофонтов А.Л., Кокшарова О.А. Российские нанотехнологии, том 13, № 7-8, с. 92-96 2018 Removal of Antimicrobial Peptides from Aqueous Solutions Using Carbon Nanotubes Timofeeva A.V., Ksenofontov A.L., Koksharova O.A. Nanotechnologies in Russia v.13, #7-8, 443-447 DOI 10.1134/S1995078018040158 Задача 7. Тестирование действия БМАА на деление клеток растений на примере Allium cepa До сих пор опубликовано лишь одно исследование, демонстрирующее действие на свету микромолярных количеств (20–50 мкМ) экзогенно добавленного БМАА на растения Arabidopsis (Brenner et al., 2000, Plant Physiol., 124, 1615–1624). БМАА вызывает нарушения морфогенеза: двух-трехкратное увеличение длины гипокотиля и ингибирование открытия семядолей в ходе раннего развития всходов. В нашем исследовании впервые для решения поставленной задачи был использован Allium test, в ходе которого начато исследование образцов растений лука Allium cepa, обработанных БМАА. Allium test рекомендован экспертами Всемирной организации здравоохранения как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды [Fiskesjo G. The as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. – 1985. – Vol. 102. – P. 99–112]. Это очень удобная и широко используемая растительная тест-система для оценки токсических эффектов различных физических и химических факторов на основе растения Allium cepa (лук репчатый). Мы обнаружили, что микромолярных количествах(50, 100, 200 мкМ) БМАА подавляет рост корней лука в концентрационной зависимости (рис 9). Мы предполагаем, что нарушения роста корешков может быть связано с нарушением митоточиского деления клеток. Приготовлены препараты корешков для анализа аберраций в ходе митоза с помощью метода световой микроскопии. Исследование будет продолжено на третьем этапе выполнения проекта.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Регуляторная роль нейротоксичной небелковой аминокислоты бета-N-метиламин-L-аланина (БМАА) в метаболизме цианобактерий и растений.
Результаты этапа: Цианобактерии синтезируют нейротоксичную аминокислоту β-N-метиламино-L-аланин (BMAA), накопление которой в организме связывают с развитием нейродегенеративных заболеваний человека. Роль этой небелковой аминокислоты в клетках цианобактерий изучена недостаточно. В ходе выполнения проекта проведены исследования действия ВМАА на клетки цианобактерий и растений и получены важные научные результаты. 1) Впервые показано, что BMAA в микромолярных количествах ингибирует образование гетероцист (специализированных азотфиксирующих клеток) в условиях азотного голодания в диазотрофных цианобактериях [Anabaena sp. PCC 7120, Nostoc punctiforme PCC 73102 (ATCC 29133), Nostoc sp. strain 8963)]. 2) Обнаружено, что в присутствии BMAA, Anabaena sp. PCC 7120 не экспрессирует два ключевых гена (hetR и hepA), необходимых для процесса дифференцировки гетероцист, а также гена nifH, необходимого для синтеза фермента нитрогеназы. Полученные результаты были опубликованы: Popova A., Rasmussen U., Semashko T., Govorun V., Koksharova O. Stress effects of cyanotoxin β-methylamino-L-alanine (BMAA) on cyanobacterial heterocyst formation and functionality. Environmental microbiology reports, 2018, v.10, № 3,369-377, DOI: 10.1111/1758-2229.12647 3) Поскольку образование гетероцист является сложным и энергозатратным процессом, при наличии комбинированного азота в среде роста образование гетероцист обычно блокируется и нити цианобактерий содержат только вегетативные клетки. При исследовании влияния BMAA на Anabaena sp. PCC 7120 в присутствии азота (нитрата натрия или хлорида аммония) нами был обнаружен обнаружили новый неожиданный регуляторный эффект BMAA на цианобактерию Anabaena sp.PCC 7120. Добавление BMAA к цианобактериям, растущим на среде с источником азота (нитратом или аммонием), приводит к формированию гетероцисто-подобных клеток, которые выглядят как темные нефлуоресцирующие клетки. С помощью газовой хроматографии и ацетиленового теста мы установили, что эти клетки нефункциональны. В этих клетках отсутствует нитрогеназная активность. Нами было обнаружено, что глутамат устраняет опосредованное BMAA формирование гетероцисто-подобных клеток. 4) Использование qPCR позволило нам выявить в условиях избытка азота в среде роста влияние BMAA на транскрипционную активность нескольких важных генов (hetR, hepA. ntcA, nifH, glnA, gltS, nirA), вовлеченыных в формирование гетероцист и в процессы усвоения азота в Anabaena sp. PCC 7120. Оказалось, что BMAA индуцирует экспрессию генов, необходимых для формирования гетероцист в условиях, когда эти гены должны «молчать» (в репрессивных условиях). Мы показали, что экспрессия нескольких существенных генов (hetR, hepA. nifH, glnA, gltS) увеличивается в присутствии BMAA в репрессивных условиях. Результаты исследования опубликованы в отчетный период в журнале «Toxins». Popova A., Semashko T., Kostina N., Rasmussen U., Govorun V., Koksharova O. The cyanotoxin BMAA induces heterocyst specific gene expression in Anabaena sp. PCC 7120 under repressive conditions. Toxins, 2018, v.10, № 11, DOI: 10.3390/toxins10110478 5) Проведено исследование действия ВМАА на протеом цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120. Показано изменение регуляции ключевых белков, ответственных за азотный метаболизм, ферментов синтеза и метаболизма аминокислот, белков, вовлеченных в формирование фотосистем, регуляторных и транспортных белков, белков-шаперонов. Подготовлена рукопись для публикации в журнале Toxins : Koksharova Olga A., Butenko I.O., Pobeguts O.V., Safronova N.A., Govorun V.M. Cyanotoxin BMAA induces drastic changes in the Anabaena PCC 7120 proteome under nitrogen starvation (отправлено в печать). 6) Небелковая аминокислота BMAA рассматривается в научной литературе как агонист глутаматных рецепторов (Rodgers, K. J. (2014) Non protein amino acids and neurodegeneration: the enemy within, Exp. Neurol., 253, 192-196.). Глутаматные рецепторы (GluRs) представляют собой контролируемые глутаматом кальциевые каналы, участвующие в сигнальных процессах в эукариотических клетках. В цианобактериях сигналы кальция участвуют в регуляции образования специализированных клеток - гетероцист. Информация о GluRs цианобактерий очень ограничена. Мы осуществили филогенетический анализ GluR белков для17 видов цианобактерий на основе аминокислотных последовательностей, выбранных в соответствии с последовательностями гомологичных белков Synechocystis sp. PCC 6803 и Nostoc sp. PCC 7120. Было обнаружено, что GluRs образующих гетероцисты цианобактерий образуют один кластер, четко отграниченный от кластера,сформированного негетороцистными цианобактериями. Это позволяет предположить, что этот рецептор может участвовать в регуляции дифференцировки гетероцист. Результаты филогенетического анализа доложены на международной научной конференции и опубликованы Lazebny O., Lazebnaya I., Koksharova O. Phylogenetic Analysis of Cyanobacterial Glutamate-like Receptors: the First Overlook. Molecular Phylogenetics: Contributions to the 5th Moscow International Conference «Molecular phylogenetics and biodiversity biobanking», 2018, p.85, DOI: 10.30826/MolPhy2018-53 7) В ходе выполнения проекта мы начали изучать возможное действие БМАА на глутаматный рецептор этих цианобактерий. Был получен инсерционный мутант цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, лишенный глутаматного рецептора. Для этого была сконструирована рекомбинантная плазмида на основе вектора pRL 498, несущая делетированную копию гена all2911 (ABC transporter glutamine-binding protein, all2911, GeneID:1106509, Locus NP_486951). Полученная конструкция была перенесена с помощью конъюгации в клетки штамма дикого типа цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120. Получены устойчивые к неомицину конъюганты, несущие инсерцию плазмиды в геноме. Ведется сегрегация этих мутантов. 8) Принимая во внимание тот факт, что изменения концентрации кальция в клетке могут регулировать различные процессы, в том числе и дифференцировку гетероцист, в клетках цианобактерий, в ходе выполнения проекта мы отработали методику измерения внутриклеточных концентраций кальция в клетках цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 с использованием рекомбинантного белка экворина (aequorin) [Torrecilla et al., 2000]. Эта методика позволяет определить эффект БМАА на изменения внутриклеточных концентраций кальция. Получены первые экспериментальные результаты, свидетельствующие о регуляторном действии ВМАА на внутриклеточную концентрацию кальция в Anabaena sp. PCC 7120. Они доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Микробиология: вопросы экологии, физиологии, биотехнологии» (23-24 декабря 2019 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет). Кокшарова О.А., Панин Н.В., Тимофеева А.В., Бутенко И.О., Побегуц О.В., Говорун В.М. Экологические функции метаболитов цианобактерий. 9) В ходе выполнения проекта впервые проведено исследование действия ВМАА на клеточное деление растений. Для этого использован Allium test, в ходе которого исследовались образцы растений лука Allium cepa, обработанные БМАА. Allium test рекомендован экспертами Всемирной организации здравоохранения как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды [Fiskesjo G. The as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. – 1985. – Vol. 102. – P. 99–112]. Обнаружено, что в микромолярных количествах(50, 100, 200 мкМ) БМАА подавляет рост корней лука в концентрационной зависимости. Были выявлены различные цитологические нарушения, частота встречаемости которых увеличивались в концентрационной зависимости от содержания ВМАА. Полученный экспериментальный материал находится на стадии обработки и подготовки к опубликованию. 10) С целью отработки возможных подходов к очистке воды от нежелательных аминокислот и пептидов и к использованию углеродных нанокомплексов для борьбы с цианобактериями в ходе выполнения проекта проведена работа по изучению сорбции ВМАА на различные углеродные наноматериалы из водных растворов. Кроме того, поскольку ВМАА может также включаться в состав пептидов, была проведена работа по изучению сорбции пептидов на функционализированные и нефункционализированные нанотрубки «Таунит». Этот экспериментальный материал был опубликован в виде статьи на русском и английском языках. 2018 Удаление антимикробных пептидов из водных растворов с помощью углеродных нанотрубок Тимофеева А.В., Ксенофонтов А.Л., Кокшарова О.А. Российские нанотехнологии, том 13, № 7-8, с. 92-96 2018 Removal of Antimicrobial Peptides from Aqueous Solutions Using Carbon Nanotubes Timofeeva A.V., Ksenofontov A.L., Koksharova O.A. Nanotechnologies in Russia v.13, #7-8, 443-447 DOI 10.1134/S1995078018040158 Кроме того, в ходе выполнения проекта были созданы и протестированы в модельных системах комплексы углеродного наноматериала "Таунит" с бактерицидными агентами (антибиотиком левомицитином (хлорамфениколом) и гербицидом диуроном) для борьбы с цианобактериальными обрастаниями, являющимися потенциальными источниками цианотоксинов, и приводящими к биодеградации поверхностей. Результаты опубликованы в англоязычной версии журнала "Физиология растений". Timofeeva A.V., Tashlitsky V.N., Tkachev A.G., Baratova L.A., Koksharova O.ANanocomplexes on the Basis of Taunit Associated with Biocides as Effective Anti-Cyanobacterial AgentsRussian Journal of Plant Фисиологий, v 64, # 6, 833-839, 2017. DOI: 10.1134/S1021443717060115

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен