Характеристика митохондриальной пирофосфатазы и ее мутантных вариантов, вызывающих митохондриальные патологии человекаНИР

Mitochondrial pyrophosphatase and its mutant variants responsible for mitochondrial pathology in human

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Характеристика митохондриальной пирофосфатазы и ее мутантных вариантов, вызывающих митохондриальные патологии человека
Результаты этапа: I. Проделанная работа. В отчетный период были проведены работы во всех трех запланированных направлениях: получение рекомбинантной РРА2 человека и ее мутантных вариантов; получение нативной РРА2 из митохондрий сердца быка; структурная характеристика РРА2 дрожжей O. parapolymorpha. Получение генетических конструкций для экспрессии рекомбинантной РРА2 и ее мутантов. В отчетный период была проведена работа по получению генетических конструкций для экспрессии белка дикого типа и мутантных вариантов hPPA2 в бактериальной системе. Была получена генетическая конструкция на основе плазмиды pET42a+ для экспрессии в клетках E. coli нетагированной формы РРА2 человека без N-концевого сигнального пептида 1-32, т.е. цепь содержит остатки 33-334 и соответствует активной форме РРА2 в митохондрии после отщепления сигнального пептида. Далее именно эта форма именуется hPPA2. В качестве источника кДНК человека использовали клеточную линию А549, любезно предоставленную Д. Скворцовым (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ). Фрагмент гена, соответствующий аминокислотной последовательности hPPA2, амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, синтезированных в Евроген (Москва) и лигировали в плазмиду pET42a+ по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Наличие вставки верифицировали с помощью рестрикционного анализа. Полученной плазмидой трансформировали компетентные клетки E.coli BL21 (DE3), клетки растирали на чашки с агаризованной средой LB и инкубировали 16 ч при 37°С, селекцию проводили по резистентности к канамицину. Полученные трансформанты использовали для тестовой экспрессии белка в различных условиях. При помощи сайт-направленного мутагенеза на основе клонированного в вектор гена hPPA2 были получены генетические конструкции для экспрессии в E. coli мутантных вариантов hPPA2 Ser61Phe, Met94Val, Met106Ile, Glu172Lys, Pro167Leu, Gln294Pro. Наличие мутации в плазмидах верифицировали секвенированием ДНК (Евроген, Москва). Согласно данным секвенирования, для варианта Arg127Leu введение мутации приводит к получению ошибочной последовательности вставки, ведется работа по введению этой мутации другими методами. Остальные плазмиды содержат необходимые вставки без дополнительных мутаций. Полученными плазмидами трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3), трансформанты использовали для тестовой экспрессии белков. Разработка протокола получения hPPA2 и ее мутантных вариантов. Тестовую экспрессию hPPA2 без замен проводили с использованием автоиндукционной среды, содержащей лактозу в качестве одновременно источника углерода и индуктора экспрессии. Белок экспрессировался в растворимой форме, что следует из преимущественного его нахождения в клеточном лизате. Также были тестированы другие условия экспрессии, но они существенно не изменяли картину. Таким образом, подобранные условия экспрессии были использованы для препаративного получения hPPA2. Для препаративного получения hPPA2 клетками-трансформантами были инокулированы 2,0 л жидкой среды LB, содержащей необходимые компоненты для автоиндукции. Клетки культивировали в течение 16 ч при 37°С, после чего осаждали центрифугированием в течение 25 мин при 1000 g. Осадок ресуспендировали в лизис-буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, содержащий 0,1 М NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF). Добавили лизоцим (10 мг/мл) и провели несколько циклов замораживания в жидком азоте -оттаивания во льду, добавляя PMSF на каждом цикле. Далее вскрытые клетки центрифугировали в течение 30 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий целевой белок в составе клеточного лизата, отделяли и добавляли к нему 5% стрептомицин сульфат (1/3 от объема лизата) для осаждения нуклеиновых кислот. После осаждения осадка центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g собирали супернатант, содержащий суммарную белковую фракцию, и добавляли к нему сульфат аммония до 90% от насыщения. Сульфатную суспензию использовали для хроматографической очистки целевого белка. Ранее в нашей лаборатории был отработан протокол выделения и очистки рекомбинантной РРА2 из дрожжей Ogataea parapolymorpha (другое название - Hansenula polymorpha), который в настоящей работе был опробован на белке человека. На 1 стадии очистки проводилили гидрофобную хроматографию на колонке с Monomix MC60-HIC Phenyl (Sepax-tech, КНР), элюцию проводили буфером А (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF) со ступенчатым снижением концентрации сульфата аммония от 1.4 М до 0. Во всех фракциях определяли общую концентрацию белка (по оптической плотности при 280 нм) и выход целевого белка (по измерению РРазной активности экспресс-методом). Как и ранее ОрРРА2, целевой белок человека hPPA2 элюировался на 0,7 М соли. Фракции, содержащие РРазную активность, объединяли и обессоливали на Sephadex G-50 fine, проводя элюцию буфером А. Белковые фракции объединяли и далее проводили фракционирование методом ионообменной хроматографии на DEAE Toyopearl с элюцией буфером А. Здесь проявляется необычное свойство эукариотических пирофосфатаз, которое мы в нашей лаборатории успешно использовали для очистки митохондриальных РРаз из дрожжей S. cerevisiae и O. parapolymorpha. Эти белки, согласно расчетам по их аминокислотной последовательности, имеют значения pI порядка 5,6-5,9, то есть при рН 7,5 они несут отрицательный заряд, однако в отсутствие ионов магния не задерживаются на анионообменной смоле DEAE Toyopearl. Эту особенность, связанную с неравномерным распределением заряженных групп по молекуле белка, удается использовать для успешной очистки РРаз от большинства клеточных белков с похожими значениями pI. Подобный подход был тестирован и для рекомбинантной hPPA2. В тестовом опыте после нанесения на DEAE Toyopearl проводили элюцию буфером А без соли и затем со ступенчатым увеличением концентрации сульфата аммония; действительно, РРазная активность обнаруживалась только во фракциях, где элюцию вели буфером без соли. Согласно расчету по аминокислотной последовательности, белок имеет pI 5,97, однако и эта РРаза не задерживается на DEAE Toyopearl, как ее дрожжевые ортологи. Таким образом, препаративную наработку hPPA2 проводили по этому же протоколу с элюцией буфером А без соли. На последней стадии белок дочищали гель-фильтрацией на Superdex 200 с использованием системы AKTA Purifier (GE Healthcare, США), которая имеется в распоряжении кафедры благодаря Программе развития МГУ, проводя элюцию буфером А. Полученный препарат целевого белка электрофоретически гомогенен. Таким образом, этот протокол предполагается и в дальнейшем использовать для выделения hPPA2. Для мутантных вариантов тестовую экспрессию, как и для белка дикого типа, проводили в автоиндукционной среде при 37°С. Результаты тестовой экспрессии показали, что полученные мутантные варианты hPPA2 экспрессируются, при этом практически все мутантные белки удовлетворительно переходят в растворимую фракцию после лизиса клеток. Из мутантных вариантов РРА2 человека лишь один мутантный вариант hPPA2, с заменой Glu172Lys, присутствовал только в нерастворимой фракции. Для него были проведены дополнительные эксперименты с подбором условий экспрессии - пробовали использовать не автоиндукционную среду, а среду для отдельного роста клеток с последующей индукцией IPTG; варьировали концентрацию индуктора, температуру и время экспрессии, пробовали различные штаммы E. coli. Пока что удовлетворительного перехода этого варианта в растворимую фракцию добиться не удалось. Тот факт, что Glu172Lys вариант экспрессируется в нерастворимой фракции, косвенно показывает, что молекулы белка получаются либо структурно дефектными, либо их поверхность имеет повышенную гидрофобность, что и приводит к агрегации белка. Следует отметить, что и для митохондриального белка ОрРРА2 из дрожжей O. parapolymorpha замена аналогичного остатка, Аsp132Lys, приводила к похожему результату - белок в условиях тестовой экспрессии не переходил в растворимую фракцию. Это говорит о том, что структурные последствия замены остатка в данной позиции сходны в обоих белках. Один из мутантных вариантов hPPA2, Met94Val, был получен в препаративных количествах по протоколу, отработанному для белка дикого типа, начата его характеристика. Для остальных мутантных вариантов, которые в тестовых условиях экспрессируются в растворимой форме (Ser61Phe, Met94Val, Met106Ile, Pro167Leu, Gln294Pro), получение и очистка белков в дальнейшем также будет проводиться по протоколу, разработанному для белка дикого типа, если не понадобятся какие-либо изменения. Функциональная характеристика hPPA2. Была проведена предварительная функциональная характеристика полученного препарата рекомбинантного hPPA2. Для этого были определены параметры стационарной кинетики гидролиза пирофосфата магния. Была исследована зависимость начальной скорости катализируемой реакции от концентрации субстрата MgPPi при двух концентрациях кофактора (0.5 и 2 мМ MgCl2); от концентрации кофактора MgCl2 при фиксированной концентрации субстрата MgPPi (50 мкМ); от рН реакционной среды в диапазоне 3.0 - 10.0. Начат поиск возможных эффекторов hPPA2 среди клеточных метаболитов и известных эффекторов других РРаз. С помощью метода термофлюориметрии была также исследована термостабильность hPPA2. Согласно данным термофлюориметрии, температура плавления Tm для hPPA2 составляет 56 ± 1С, что несколько выше, чем для РРазы дрожжей O. parapolymorpha. Отличительной особенностью hPPA2 по сравнению с дрожжевой РРА2, а также по сравнению с данными литературы по гомологичным цитоплазматическим и бактериальным РРазам, является значительно более высокие значения константы Михаэлиса и константы диссоциации комплекса с активаторными ионами магния. Структурная основа такого различия пока непонятна, в дальнейшем анализе мы попытаемся выяснить молекулярные механизмы, лежащие в его основе. Разработка методики выделения нативной митохондриальной РРазы. Нативную митохондриальную РРазу животных выделяли из митохондрий сердца быка Bos taurus (BtPPA2). Для выделения митохондрий применяли протокол дифференциального центрифугирования, описанный в [1]. Вкратце, биологический материал отмывали от крови, удаляли сосуды и жир, еще раз тщательно отмывали, измельчали в блендере, добавляли (10 мл на каждые 1 г материала) среду для выделения митохондрий (50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,25 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 0,5% БСА) и гомогенизировали при охлаждении в течение 1-2 мин с помощью автоматического диспергатора (Вилитек, Россия). Гомогенат дважды центрифугировали (10 мин, 600 g), отбирали супернатант и еще раз центрифугировали 10 мин при 11000 g. Полученный плотный осадок митохондрий ресуспендировали в среде для выделения до суммарной концентрации белка порядка 50 мг/мл и в случае немедленного использования хранили при 0-4 ºС. При необходимости суспензию митохондрий замораживали жидким азотом и хранили при -20 ºС. Для выделения целевого белка BtPPA2 митохондрии ресуспендировали в буфере для выделения (с добавлением 1 мМ PMSF) из расчета 10 мл буфера на 1 г митохондрий и добавляли 20% Тритон-Х100 до конечной концентрации 0,3%. Инкубировали 30 мин на льду, затем центрифугировали 10 мин при 11000 g, супернатант отбирали и добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1,4 М. Для выделения целевого белка, BtPPA2, из митохондриального лизата тестировали протокол, разработанный для рекомбинантной РРА2 человека. Полученный митохондриальный лизат в высокосолевом буфере фракционировали гидрофобной хроматографией на колонке с Monomix MC60-HIC Phenyl (Sepax-tech, КНР), ступенчато снижая концентрацию соли в элюенте. В собранных фракциях определяли суммарную концентрацию белка (по оптической плотности при 280 нм) и РРазную активность экспресс-методом. Целевой белок, BtPPA2, элюировался на 0,7 М соли. Фракции, содержащие РРазную активность, объединяли, обессоливали в 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, и далее фракционировали ионообменной хроматографией на колонке с DEAE Toyopearl. Как описано выше для рекомбинантных митохондриальных РРаз, BtPPA2 не сорбируется на анионообменнике, а элюируется при промывке смолы бессолевым буфером. Данный протокол был масштабирован и применен для выделения BtPPA2 с целью масс-спектрометрической характеристики. В отличие от суперпродуцирующихся рекомбинантных белков, которые на данной стадии очистки практически отделяются от примесных белков, образец нативного BtPPA2 после данной стадии фракционирования содержит значительное количество примесных белков. После проведения SDS-гель-электрофореза полоса, соответствующая ожидаемой молекулярной массе целевого белка, а также близлежащие полосы были вырезаны и подготовлены для масс-спектрометрической идентификации и анализа. Ожидается, что такой анализ, помимо прочего, даст информацию о возможных пост-трансляционных модификациях BtPPA2. Следующим шагом планируется, во-первых, провести дальнейшее масштабирование протокола и дополнительную очистку BtPPA2 методом гель-фильтрации с целью получить достаточное количество белка для функциональной характеристики. Во-вторых, планируется провести ультрацентрифугирование митохондриального лизата с целью осаждения мембранносвязанной фракции и прояснения вопроса о локализации BtPPA2. Структурная характеристика РРА2. Работа по структурной характеристике РРА2 в отчетный период велась в трех направлениях. Во-первых, был проведен скрининг условий с целью получения изотопно меченных препаратов белка РРА2 из O. parapolymorpha (ОрРРА2) для последующего анализа методом ЯМР-спектроскопии. Во-вторых, велась работа по кристаллизации этого белка, которая успешно завершилась решением кристаллической структуры белка в холоформе. В-третьих, были получены и подготовлены исходные модели структур ОрРРА2 и hPPA2, а также их мутантных вариантов, для симуляции молекулярной динамики, и начата симуляция. Разработка клеточных культур для экспрессии 15N-OpPPA2 и 15N,2H-OpPPA2. Были проведены работы по поиску и оптимизации условий получения клеточных культур, способных экспрессировать изотопно меченные препараты целевого белка ОрРРА2. В качестве исходного брали штамм клеток E. сoli BL21(DE3). Для получения двумерных спектров ЯМР белковой молекулы необходимо высокое содержание вещества в растворе – от 0,5 мМ и выше. Однако наработка белкового продукта в клетках E. сoli путем их культивации и индукции в условиях практически полной замены изотопа 1H на 2D затруднена. Обязательным этапом является оптимизация состава среды и внешних условий для постепенной адаптации культуры клеток к росту и экспрессии генов в жестких условиях. Для постепенного обогащения клеточной культуры, экспрессирующей ОрРРА2, ядрами 15N и 2D была выбрана стратегия, состоящая из следующих этапов культивации: (1) в среде LB; (2) в минимальной среде М9 с добавками; (3) в минимальной среде М9 с добавками и заменой изотопа 14N на 15N; (4) в М9 с добавками и заменой изотопа 14N на 15N, а также частичной заменой 1H на 2D; (5) в М9 с добавками и заменой 14N на 15N, 1H на 2D. На первом этапе клетки E. coli штамма BL21 (DE3) трансформировали плазмидой, содержащей ген ОрРРА2, и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина, в течение 12-15 ч при 37°C и 200 rpm до значения оптической плотности при 600 нм около 0,6. В результате было подтверждено устойчивое воспроизводство минимум трех трансформированных клонов. На втором этапе для обогащения культуры ядрами 15N подбирали состав минимальной среды М9, в которой в качестве источника азота использовали 15N хлорид аммония. Для увеличения выхода клеточной массы тестировали несколько вариантов модификации среды добавками - ионами металлов (магний, кальций, железо, марганец), а также витаминами (биотин, рибофлавин, пиридоксальфосфат, тиамин). Была проведена тестовая экспрессия целевого белка, 15N-ОрРРА2, в этой клеточной культуре при росте в подобранных условиях и индукции лактозой. SDS-PAGE показал стабильную высокую экспрессию целевого белка. Полученная клеточная культура №1 была наработана в препаративных количествах, заморожена в жидком азоте и хранится при -80 град.С. Далее были проведены тесты по обогащению полученной культуры №1 ядрами 2Н для экспрессии белка, меченного 15N и 2Н одновременно. Сначала в качестве источника дейтерия использовали D2O. Для этого готовили среду 15N,2Н-М9, как описано выше, но все используемые стоковые растворы веществ, указанных в табл. 3, за исключением ионов железа, марганца, ЭДТА и витаминов, были приготовлены на D2O. (Вышеупомянутые компоненты присутствуют в среде в микроколичествах, поэтому количество протонов, которые привносятся такими растворами, пренебрежительно мало). Культуру клеток №1 и полученную среду 15N,2Н-М9 смешивали в соотношении 1:1, клетки растили при 37°C и 200 rpm до OE около 0,6, после чего клетки опять переносили в среду 15N,2Н-М9, но в соотношении 1:1000, и растили до OE около 1. На следующей стадии для дальнейшего повышения содержания 2Н в смеси в качестве источника углерода вместо лактозы вводили дейтерированный глицерин. Была проведена тестовая наработка клеточной культуры в среде 15N,2Н-М9, результаты показали устойчивое воспроизводство минимум трех трансформированных клонов. Однако эти тесты пока не удалось масштабировать для наработки препаративного количества клеточной культуры, а клеточная масса, наработанная в тестовых условиях, получена в недостаточном количестве для выделения целевого белка. Необходима дальнейшая работа по оптимизации условий культивирования или же порционная наработка клеточной массы. Таким образом, на этом этапе работы получены два вида клеточных культур: для получения 15N-ОрРРА2 и для получения 15N,2Н-ОрРРА2. Первая из них из них наработана в препаративных количествах, вторая пока нет. Поскольку задача получения пространственной структуры ОрРРА2 была успешно решена другим способом, а именно, рентгеноструктурным анализом, то в принципе работа по этому направлению теряет свою актуальность. Однако мы предполагаем продолжить работу по масштабированию протокола в разумных пределах: если наработка необходимой клеточной культуры для экспрессии 15N,2Н-ОрРРА2 увенчается успехом, то структура белка, полученная ЯМР-спектроскопией, будет важна для верификации данных по динамике белка в растворе, полученных расчетными методами. Кроме того, в будущем это позволит выявлять белковые остатки, вовлеченные в связывание эффекторов. Получение и анализ кристаллической структуры ОрРРА2. За отчетный период была получена и проанализирована кристаллическая структура ОрРРА2. Это первая структура митохондриальной пирофосфатазы в базе данных rcsb. Фермент был закристаллизован в присутствии MgCl2, что позволило получить структуру холоформы - комплекса ОрРРА2 с активаторными ионами магния в центрах М1 и М2, который готов к связыванию и превращению субстрата. Начальный скрининг условий кристаллизации проводили в наборе JCSG+ suite (Molecular Dimensions, США) при 20С. Для оптимизации выбрали следующие условия: 10% ПЭГ 6000, 0.1 M Бицин, pH 9,0. При оптимизации варьировали концентрацию осадителя, рН, добавки. Кристаллы, отобранные для съемки дифракционных данных, были получены в следующих условиях: 9% ПЭГ 6000, 0,1 M Трис-HCl, pH 8,6, 0,1 M формиат натрия. Непосредственно перед съемкой кристаллы погружали в криораствор, содержащий материнскую жидкость и 20% глицерин, и замораживали в жидком азоте. Набор дифракционных данных был снят нашими коллегами из ФИЦ "Биотехнологии" на дифрактометре Rigaku OD XtaLAB Synergy-S (Rigaku, США, расположенном в ИОС РАН) при 100К. Структура была решена методом молекулярного замещения с использованием структуры цитоплазматической изоформы РРазы S. cerevisiae (PDB ID: 1HUK) в качестве шаблона. Разрешение составило 1,8 Å. Независимая часть элементарной ячейки содержит две субъединицы белка. В активном центре каждой субъединицы связаны два активаторных иона магния в традиционных для РРаз центрах связывания М1 и М2. Полученная структура была детально проанализирована с использованием ряда расчетных подходов с целью выяснения возможных причин влияния данных мутаций на свойства белка. В дальнейшем эти предположения будут проверены на результатах симуляции молекулярной динамики. Поскольку остатки, замена которых в РРА2 человека вызывает патологии, в большинстве своем консервативны и сохраняются в обоих ферментах, то такой анализ можно использовать для предсказания эффектов мутаций соответствующих остатков в hPPA2 и для объяснения молекулярных механизмов вызываемых ими митохондриальных патологий. По результатам получения и анализа кристаллической структуры ОрРРА2 была подготовлена и послана в печать статья в журнал Int. J. Mol. Sci.: Matyuta Ilya O., Bezpalaya Ekaterina Y., Vorobjeva Natalia N., Kurilova Svetlana A., Boyko Konstantin M., Rodina Elena V. The crystal structure of yeast mitochondrial pyrophosphatase provides a model to study pathological mutations in its human ortholog. Статья не успела выйти в 2023 г., как было запланировано. В связи с этим мы обязуемся в следующем году опубликовать эту и еще 2 статьи, согласно Соглашению. Работа по кристаллизации проводилась и для рекомбинантного белка человека hPPA2. Полученный нами белок дикого типа оказался не только термостабилен, но и показал хорошую стабильность по отношению к агрегации. Это позволило нам сконцентрировать его в достаточной степени (до 10 мг/мл) для проведения тестовой кристаллизации. Предварительные результаты показывают, что белок удовлетворительно кристаллизуется, кристаллы дифрагируют. Работу по кристаллизации hPPA2, а также комплексов ОрРРА2 с другими лигандами планируется продолжить и в следующем году. Моделирование структуры РРА2 человека и симуляция молекулярной динамики Для выявления возможных эффектов патогенных мутаций на функционирование hPPA2 была смоделирована пространственная структура этого белка. Было получено несколько вариантов моделей с использованием серверов ITasser, SwissModel, AlfaFold2. Все полученные модели накладываются друг на друга с rmsd порядка 0,5 Å и различаются только деталями в неструктурированных областях. Для дальнейшей работы была выбрана модель димера hPPA2, сгенерированная и минимизированная SwissModel. На основе этой структуры было смоделировано расположение ионов магния в активном центре каждой субъединицы в центрах М1 и М2 для получения холоформы. Белковые остатки были дополнены расчитанными позициями атомов водорода. С помощью программы Coot в модель hPPA2 вводили виртуальные замены для получения моделей патогенных мутантных вариантов, которые также были подготовлены к дальнейшей симуляции. Дальнейшая подготовка моделей к проведению симуляции молекулярной динамики (МД) включала дополнение модели молекулами растворителя (воды), а также ионами K+ и Cl-, и ручную коррекцию возможных клэшей. Аналогичным образом были подготовлены к симуляции МД полученная нами кристаллическая структура ОрРРА2 и ее мутантные варианты. Для модели холоформы hPPA2 в полноразмерной форме и в процессированной форме (остатки 33-334) и ряда ее мутантных вариантов (Ser61Phe, Met106Ile, Gln294Pro), а также для холоформы ОрРРА2 и ее мутантных вариантов (Ser34Phe, Met52Val, Pro188Leu) провели минимизацию с последующей симуляцией молекулярной динамики продолжительностью по 200 нс. Симуляцию молекулярной динамики проводили в программном пакете AMBER 14 с набором силовых полей ff14SB. Пока что для каждой модели было проведено по одному повтору МД. Начат анализ полученных данных с использованием программы CPPTRAJ пакета AMBER 14 и других структурных методов. В дальнейшем планируется, во-первых, выполнить симуляцию МД для всех патогенных вариантов минимум в двух повторах; во-вторых, проанализировать полученные данные на предмет возможного структурного объяснения патогенных эффектов; и, в-третьих, подготовить модели других комплексов РРА2, в частности, с субстратом, для оценки воздействия мутаций на фермент-субстратный комплекс. II. Достигнутые результаты. Получены запланированные генетические конструкции для экспрессии рекомбинантной митРРазы человека (hPPA2) и ее мутантных вариантов. Для белка дикого типа разработана и отработана методика его экспрессии в клетках E.coli BL21 (DE3), выделения и очистки белка. Наработано препаративное количество белка, начата его функциональная и структурная характеристика. Для мутантных вариантов Ser61Phe, Met94Val, Met106Ile, Pro167Leu, Gln294Pro получены генетические конструкции и тестирована экспрессия в бактериальной системе. Все эти белки удовлетворительно экспрессируются в растворимой форме и могут быть наработаны и выделены. Для варианта Met94Val тестирована методика выделения и очистки, разработанная для белка дикого типа, она работает, белок был наработан в препаративном количестве и начата его характеристика. Мутантный вариант Glu172Lys в условиях тестовой экспрессии показал неудовлетворительный результат - он не переходит в растворимую фракцию, а остается в дебрисе. Это пример мутации, приводящей к получению некорректно свернутых или структурно дефектных молекул белка, поверхность которых отличается от поверхности белка дикого типа, что приводит к деградации или агрегации белков в процессе выделения. Был получен митохондриальный лизат сердца быка и из него выделен и частично очищен препарат растворимой формы нативной митРРазы BtPPA2. Препарат отправлен на масс-спектрометрический анализ. Отработанная методика выделения и очистки требует масштабирования для получения препаративных количеств белка, а также для дальнейшего анализа на возможное присутствие мембранносвязанной формы РРА2. Разработаны протоколы получения клеточных культур для экспрессии меченых вариантов митРРазы H. рolymorpha 15N-OpPPA2 и 15N,2H-ОрРРА2, необходимых для дальнейшего снятия спектров ЯМР. Клеточная культура для экспрессии 15N-OpPPA2 наработана в достаточном количестве для получения меченого белка и экспрессия целевого белка в ней подтверждена; клеточная культура для экспрессии 15N,2H-ОрРРА2 получена в недостаточном для выделения белка количестве и протокол требует дальнейшей оптимизации. Пространственная структура митРРазы H. рolymorpha (ОрРРА2) в холоформе решена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,8 Å. Все данные депонированы в банк данных белковых структур c ID 8QPT. Полученная структура детально проанализирована, выявлены возможные причины патогенных эффектов мутаций в РРА2 человека. Получены и подготовлены для анализа in silico модель пространственной структуры митРРазы человека в холоформе и некоторых ее мутантных вариантов с патогенными заменами, а также модель холоформы цитоплазматической РРазы человека (hPPA1) на основе имеющейся кристаллической структуры (PDB ID:6C45). Также на основе решенной нами кристаллической структуры ОрРРА2 подготовлены модели мутантных вариантов ОрРРА2 с аналогичными заменами. Проведена симуляция молекулярной динамики для холоформ hPPA2 (в полноразмерном варианте и в процессированном варианте 33-334) и ее мутантов Ser61Phe, Met94Val, Gln294Pro; для hPPA1; для ОрРРА2 в мономерной и димерной форме, а также ее мутантов Ser34Phe, Met52Val, Pro188Leu. Начат анализ полученных данных. Использованная литература: 1. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: современные методические приемы. Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины (2011) 26, 22-28.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Характеристика митохондриальной пирофосфатазы и ее мутантных вариантов, вызывающих митохондриальные патологии человека
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".