![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Проект направлен на исследование принципов формирования, строения и свойств самоорганизующихся наноструктурированных фермент-полимерных пленок и создание на их основе улучшенных биосенсорных покрытий. Конкретными фундаментальными задачами предлагаемого проекта являются изучение особенностей взаимодействия биомолекул (белков, ферментов) со стимулчувствительными полимерными объектами различной архитектуры (линейными, звездообразными или сетчатыми), формирование на основе таких комплексов наноструктурированных фермент-полимерных покрытий, а также систематическое исследование их строения, свойств и устойчивости в зависимости от структуры выбранного полимерного объекта, его стимулчувствительных свойств (термочувствительности и/или рН -чувствительности), типа фермента, а также условий, при которых происходит взаимодействие и/или адсорбция отдельных компонентов и/или осуществляется последующее функционирование покрытия в целом в качестве поверхностей биосенсоров. Систематическое исследование свойств наноструктурированных фермент-полимерных покрытий и условий включения в них целевых биомолекул и сделанные на его основе выводы и рекомендации позволят эффективно модифицировать различные поверхности разнообразными биообъектами, что представляет собой центральную проблему многих областей современной биотехнологии и науки о современных биоматериалах.
The project aims at revealing basic principles, which govern the formation of nanostructured polymer-enzyme films, at studying of structure and properties of the films, and at constructing improved biosensor coatings on their basis. The specific fundamental tasks of the proposed project are to study features of the interaction of biomolecules (proteins, enzymes) with stimuli-sensitive polymeric objects of various architecture (linear, star-shaped polymers, or microgels), to build up nanostructured polymer-enzyme coatings based on such co-assemblies, and to thoroughly investigate structure, properties, and stability of the films with respect to architecture of the used polymeric object, its stimuli-sensitivity (thermoresponsive or/and pH-responsive properties), the enzyme type, and conditions at which the interaction and/or adsorption of the individual components takes place and/or further functioning of the whole coating as a biosensor surface is performed. Systematic studies on properties of the nanostructured polymer-enzyme films and conditions under which target biomolecules are incorporated into polymeric films, followed by conclusions and recommendations coming out from the obtained results, will enable efficient modification of various surfaces by different bioobjects to be realized, which is nowadays a main challenge in many fields of the modern biotechnology and contemporary biomaterials science.
В результате выполнения проекта будут полностью охарактеризованы свойства вышеупомянутых стимулчувствительных полимерных объектов различной архитектуры (линейных, звездообразных или сетчатых) в водных растворах, в частности, будут определены интервалы рН, в которых происходит изменения степени заряженности, и значения рКа для каждого полимерного объекта. Будут определены температурные интервалы, в которых наблюдаются фазовые переходы, для каждого из полимеров в зависимости от степени заряженности. На основе полученных данных можно будет заранее предсказать, в каких условиях следует проводить адсорбцию, чтобы получить максимально равномерное плотное покрытие исходной поверхности графитовых электродов или других модельных поверхностей и условия последующего комплексообразования с ферментами. Будет выявлена роль пространственной архитектуры и характеристик (степени полимеризации линейного полиэлектролита, степени полимеризации и количества лучей для звездообразного полиэлектролита, а также типа и строения микрогелей) на структуру и свойства пленочных покрытий (топография поверхности наноструктурированных пленок, степень заполнения, шероховатость, смачиваемость и проч.). Будет исследовано взаимодействие ферментов с оптимизированными полимерными пленками с учетом роли пространственной архитектуры полимерного компонента и в зависимости от условий среды, при которых проводится адсорбция (концентрация, рН, солевой состав и др.); будет получена информация о толщине, массе и биоактивности формируемого слоя биомолекул. Будет проведен электрохимический электроанализ активностей иммобилизованных ферментов, исследованы аналитические характеристики и устойчивость получаемых полимер-ферментных сенсорных покрытий, реализованы различные варианты практического применения наиболее удачных сенсорных покрытий. Комплексная характеристика условий получения и свойств формируемых наноструктурированных фермент-полимерных покрытий позволит выработать рекомендации к направленному получению биосенсорных покрытий с заданными свойствами (гидрофобно-гидрофильным балансом, толщиной, шероховатостью, плотностью посадки биоактивного компонента и др.), провести оптимизацию биосенсорного анализа с использованием инструментов и методов электрохимии и создать в результате биоаналитические системы со значительно улучшенными аналитическими характеристиками.
Коллектив авторов имеет значительный опыт работы по физико-химической характеристике поверхностей. В частности, методами зондовой микроскопии исследованы структурно-функциональные особенности поведения полиэлектролитов и белок-полиэлектролитных комплексов на поверхности твердого тела (высокоориентированого пиролитического графита). Опыт авторов проекта по изучению адсорбции веществ методом пъезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации в сочетании с электрохимическими методами определения ферментативной активности позволил исследовать закономерности взаимодействия ферментов с пленками полиэлектролитов и определить условия проявления максимальной ферментативной активности полимер-ферментных слоев. Коллективом авторов методом последовательной адсорбции были впервые получены высокоактивные тонкие (наноразмерные) фермент-полиэлектролитные пленки с участием диблок-сополимеров и звездообразных полимеров различного строения и исследованы их условия формирования, активность и стабильность. Показана возможность включения в состав пленок ряда ферментов (тирозиназы, глюкозоксидазы, холиноксидазы, пероксидазы, бутирилхолинэстеразы) и антител. На основе наноструктурированных пленок линейных полиэлектролитов и белков созданы биосенсорные системы определения пероксида водорода, холина, фенола, этанола, глюкозы, ингибиторов холинэстераз. Проведенные фундаментальные исследования позволили решить проблему воспроизводимого получения сплошных наноструктурированных полимер-ферментных покрытий на проводящих поверхностях различного типа.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Стимулчувствительные полимерные объекты различной архитектуры для модификации поверхностей и создания биосенсорных систем |
Результаты этапа: В ходе первого этапа выполнения проекта (этап 2017 года) исследованы особенности (1) взаимодействия линейных стимулчувствительных поли-N,N-диметиламиноэтилметакрилатов (ПДМАЭМА) с различными степенями полимеризации и особенности (2) последующей адсорбции ферментов (холиноксидазы) на поверхности графита, предварительно модифицированной полимерами. Показана возможность формирования на поверхности графита наноразмерных структурированных полимер-ферментных пленок, систематически исследованы их строение и свойства (в том числе, и устойчивость) в зависимости от длины цепи ПДМАЭМА, а также условий, при которых происходит взаимодействие и/или адсорбция. Методом потенциометрического титрования было изучено влияние рН на степень заряженности ПДМАЭМА в растворе. Определены соответствующие значения рКа. На основании полученных данных о рН-чувствительности ПДМАЭМА оптимизированы рН-условия адсорбции ПДМАЭМА на проводящие поверхности на основе графита (рН 9), а также рН условия последующей электростатической адсорбции холиноксидазы (рН 7). Методом турбидиметрии установлены значения температур (> 40C), при которых наблюдается помутнение растворов линейных ПДМАЭМА вследствие наличия у ПДМАЭМА нижней критической температуры растворения (НКТР). Данное свойство (термочувствительность) свидетельствует об обратимой гидрофобизации ПДМАЭМА при повышении температуры выше НКТР. С учетом этого было исследовано влияние температуры на адсорбцию линейных ПДМАЭМА на проводящие поверхности на основе графита и на последующую электростатическую адсорбцию холиноксидазы. Проанализирована специфическая ферментативная активность полимер-ферментных пленок, нанесенных на планарные графитовые сенсорные поверхности при различных рН и температурах адсорбции линейных ПДМАЭМА. Исследованы аналитические и функциональные характеристики биосенсоров на холин, сформированных при наилучших условиях адсорбции. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) начаты сравнительные исследования свойства пленок, образующихся при адсорбции линейных ПДМАЭМА на поверхности высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ). Показано, что адсорбция и степень заполнения поверхности пленкой полимера увеличиваются при переходе ПДМАЭМА от заряженного состояния (рН < 5,5) в незаряженное состояние (рН > 9), а также при проведении адсорбции ПДМАЭМА при температуре выше НКТР. Последующая адсорбция фермента происходит только в местах локализации макромолекул ПЭМАЭМА, подтверждая тем самым существование взаимодействия между ним и ферментом, которое реализуется при нанесении компонентов методом послойной адсорбции. Кроме того совместно с сотрудниками Института физической химии университета г. Ахен (Германия) были синтезированы образцы рН-и термочувствительных микрогелей. Первый образец представляет собой сополимер N-изопропилакриламида и аминопропилметакриламида, полученный методом осадительной сополимеризации в присутствии сшивающего агента N,N’-метиленбисакриламида. Второй образец получали из первого дополнительно наполимеризовывая на него слой другого рН- и термочувствительного сополимера на основе поли-N,N-диэтилакриламид-со-N,N-диметиламинопропилметакриламида также в присутствии сшивающего агента. Охарактеризованы стимулчувствительные свойства микрогелей типа «ядро» (микрогель 1) и «ядро-оболочка» (микрогель 2) в растворах, в частности влияние рН на степень заряженности (потенциометрическое титрование), а также изменение гидродинамических радиусов микрогелей в зависимости от температуры (динамическое светорассеяние). | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Стимулчувствительные полимерные объекты различной архитектуры для модификации поверхностей и создания биосенсорных систем |
Результаты этапа: На втором этапе выполнения проекта (этап 2018 года) были получены тонкие микрогель-ферментные пленки на твердых поверхностях путем осуществления двух последовательных стадий: адсорбции частиц рН- и термочувствительного микрогеля и их последующего взаимодействия с ферментом (холиноксидаза). Было проведено сравнение двух типов функциональных (ионогенных) микрогелей в отношении их адсорбции и взаимодействия с холиноксидазой: поли-(N-изопропилакриламид-со-N-аминопропилметакриламида) (П(НИПАМ-со-АПМА)), содержащего первичные аминогруппы, и поли-(N-изопропилакриламид-со-N-диметиламинопропилметакриламида) (П(НИПАМ-со-ДМАПМА), содержащего третичные аминогруппы. Стимулчувствительные свойства этих микрогелей в растворах были исследованы методами потенциометрического титрования, динамического светорассеяния и лазерного микроэлектрофореза. Особенности адсорбции каждого из микрогелей и характер их взаимодействия с холиноксидазой были изучены с помощью комбинации экспериментальных методов исследования, применяемых для изучения свойств поверхностей. Заряд поверхностей был охарактеризован методом электрокинетического анализа для графитовой поверхности до и после нанесения на нее микрогеля, а затем фермента при различных условиях. Массы влажных (невысохших) микрогельных и микрогель-ферментных пленок были определены методом пъезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации при последовательном нанесении компонентов на поверхность покрытого тонким слоем золота кварцевого резонатора при аналогичных условиях. Отклики фермента (холиноксидазы) микрогель-ферментных пленок, нанесенных на планарные графитовые электроды, были измерены методом амперометрии. Присутствие функциональных первичных аминогрупп в составе одного из микрогелей (П(НИПАМ-со-АПМА)) позволило, используя глутаровый альдегид, ковалентно пришить глобулы фермента к микрогелю, что привело к существенному улучшению операционной стабильности биосенсоров. Помимо этого на данном этапе выполнения проекта были исследованы свойства стимулчувствительных функциональных полимеров другого типа, а именно, полидиметиламиноэтилметакрилатов (ПДМАЭМА) звездообразной архитектуры, в водных средах. В частности методом потенциометрического титрования были установлены интервалы рН, отвечающие переходу таких звездообразных полимеров из полностью заряженного в полностью незаряженное состояние. Также в щелочных средах были определены значения нижней критической температуры растворения звездообразных ПДМАЭМА. Путем проведения последовательной адсорбции звездообразных ПДМАЭМА при различных значениях рН, а затем адсорбции фермента (холиноксидаза) при нейтральных рН были получены тонкие полимер-ферментные пленки на планарных графитовых электродах. Методом амперометрии исследованы отклики полученных биосенсорных систем на холин. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Стимулчувствительные полимерные объекты различной архитектуры для модификации поверхностей и создания биосенсорных систем |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта исследованы особенности адсорбции на проводящие поверхности и последующего взаимодействия с ферментами стимулчувствительных (рН- и термочувствительных) полимерных объектов следующего типа: 1) линейных узкодисперсных поли-N,N-диметиламиноэтилметакрилатов (ПДМАЭМАn) различных длин (со среднечисловой степенью полимеризации Pn=133, 342, 558, 1400 и 1600); 2) звездообразных поли-N,N-диметиламиноэтилметакрилатов (ПДМАЭМА160)3,7, содержащего в среднем 3,7 луча на одну макромолекулу со среднечисловой степенью полимеризации луча Pn = 160, и (ПДМАЭМА240)24, содержащего в среднем 24 луча на одну макромолекулу со средней степенью полимеризации луча Pn = 240; 3) амфифильных диблок-сополимеров с варьируемым соотношением длин гидрофобного и ионогенного (полиэлектролитного) блоков поли-н-бутилметакрилат40-блок-поли-N,N-диметиламиноэтилметакрилат40 (ПнБМА40-б-ПДМАЭМА40), поли-н-бутилметакрилат40-блок-полидиметиламиноэтилметакрилат70 (ПнБМА40-б-ПДМАЭМА70) и поли-н-бутилметакрилат70-блок-полидиметиламиноэтилметакрилат170 (ПнБМА70-б-ПДМАЭМА170); 4) микрогелей, представляющих собой ковалентно сшитые сополимеры поли(N-изопропилакриламид-со-N-аминопропилметакриламид) (П(НИПАМ-со-АПМА)), содержащего первичные аминогруппы, и поли-(N-изопропилакриламид-со-N-диметиламинопропилметакриламид) (П(НИПАМ-со-ДМАПМА), содержащего третичные аминогруппы. Показана возможность формирования на проводящих поверхностях (графит, золото, высокоориентированный пиролитический графит и др.) наноразмерных структурированных полимер-ферментных пленок, систематически исследованы их строение и свойства (в том числе, и устойчивость) в зависимости от типа полимерного объекта, а также условий, при которых происходит взаимодействие и/или адсорбция. Методом потенциометрического титрования было изучено влияние рН на степень заряженности задействованных полимерных объектов в растворе и определены их значения рКа. На основании полученных данных оптимизированы рН условия адсорбции полимерных компонентов на проводящие поверхности на основе графита (рН > 9), а также рН условия последующей электростатической адсорбции ферментов (рН 7). Методом турбидиметрии (для линейных, звездообразных гомополимеров и для диблок-сополимеров) или динамического светорассеяния (для микрогелей) установлены значения температур, при которых наблюдается фазовый переход термочувствительных полимерных объектов, сопровождающийся их обратимой (линейные, звездообразные гомополимеры и микрогели) или необратимой (диблок-сополимеры) гидрофобизацией. С учетом выявленных особенностей термочувствительного поведения полимерных компонентов исследовано влияние температуры на их адсорбцию на проводящие поверхности на основе графита и на последующее электростатическое взаимодействие с ферментами. Методом электрокинетического анализа был охарактеризован заряд исходной проводящей поверхности на основе графита и его изменение после адсорбции каждого из компонентов (полимерного или белкового) полимер-ферментной пленки, а также изменение степени заряженности соответствующей поверхности при изменении рН. Методом атомно-силовой микроскопии проведены сравнительные исследования топографии и свойств пленок, образующихся при адсорбции задействованных в проекте полимерных объектов на поверхности высокоориентированного пиролитического графита. Показано, что адсорбция полимерного компонента и степень заполнения поверхности пленкой полимера увеличиваются при переходе от заряженного состояния (рН < 5,5) в незаряженное состояние (рН > 9), а также при проведении адсорбции полимерных объектов при температуре выше температуры фазового перехода. Последующая адсорбция фермента происходит только в местах локализации молекул полимеров, подтверждая тем самым существование взаимодействия между ними и ферментом, которое реализуется при нанесении компонентов полимер-ферментной пленки методом послойной адсорбции. Массы полимерных и полимер-ферментных пленок были определены методом пьезоэлектрического микровзвешивания с мониторингом диссипации при последовательном нанесении полимерного и белкового компонентов на поверхность покрытого тонким слоем золота кварцевого резонатора при различных рН и температурных условиях. Методом амперометрии проанализирована специфическая ферментативная активность полимер-ферментных пленок, нанесенных на планарные графитовые сенсорные поверхности при различных рН и температурах адсорбции полимерного компонента. Для линейных ПДМАЭМАn установлено, что ферментативная активность и другие физико-химические свойства полимер-ферментных пленок слабо зависят от длины цепи, если степень полимеризации линейного ПДМАЭМА превышает 300. Обнаружено, что повышение объемной плотности заряда звездообразных макромолекул ПДМАЭМА (достигаемое путем увеличения количества их лучей) способствует удерживанию фермента в полимер-ферментной пленке, что выражается в улучшении операционной стабильности сенсорных откликов. Особенностью полимер-ферментных пленок на основе диблок-сополимеров являются значительно более эффективное связывание глобул фермента, что приводит к значительному (5 – 7 кратному) увеличению сенсорных откликов и делает такие системы весьма перспективными объектами для биосенсорных технологий. Присутствие функциональных первичных аминогрупп в составе одного из задействованных в проекте микрогелей (П(НИПАМ-со-АПМА)) позволило при помощи глутарового альдегида ковалентно пришить глобулы фермента к микрогелю, что привело к существенному улучшению операционной стабильности биосенсоров. Для наиболее перспективных вариантов полимер-ферментных пленок исследованы аналитические и функциональные характеристики биосенсоров на холин, сформированных при наилучших условиях адсорбции. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".