Инициация и активация трансляции в митохондриях дрожжейНИР

Initiation and activation of translation in yeast mitochondria

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 20 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Инициация и активация трансляции в митохондриях дрожжей
Результаты этапа: 1. Создание штамма дрожжей с повышенным количеством белка Aim23p Такой штамм был создан при помощи трансформации дрожжей дикого типа плазмидой с клонированным в нее геном AIM23 под сильным промотором, что должно было обеспечить повышенное количество белка, ген которого клонирован в ее составе. 2. Подтверждение повышенного количества белка Aim23p в данном штамме Количество Aim23p в клетках данного штамма было проанализировано методом Вестерн-блот; оказалось, что в штамме дикого типа содержится в 5-10 раз меньше Aim23p, чем в созданном нами штамме. 3-5. Оценка различных параметров митохондриальной функции в клетках дрожжей с геном AIM23 под сильным промотором в сравнении с клетками дикого типа Честно говоря, мы ожидали, что такому штамму будет свойственно хотя бы какой-то фенотипический признак, отсутствующий у штамма дикого типа, однако обнаружить такие признаки нам не удалось. Штамм AIM23++ вел себя абсолютно так же, как и штамм дикого типа, в нескольких экспериментах (оценивались скорость роста на среде с глицерином, характеризующая митохондриальную функцию, скорость поглощения клетками кислорода, профиль митохондриальной трансляции, морфология дрожжевых клеток). Даже профили митохондриальной трансляции у опытного и контрольного штаммов были одинаковы. Мы полагаем, что дрожжевая клетка обладает какими-то неизвестными пока механизмами, которые позволяют ей нивелировать повышенные количества Aim23p и связанные с этим возможные эффекты на процесс митохондриальной трансляции, и планируем в будущем уделить некоторое время изучению этих механизмов. 6-7. Создание двух штаммов дрожжей: (а) не содержащего гена AIM23, на основе штамма, в котором с митохондриальной ДНК вместо белка Cox3p синтезируется белок Arg8p, (б) не содержащего гена AIM23, на основе штамма, в котором в митохондриальном геноме ген COX1 находится в окружении геномных закраин гена COX2, а ген ARG8 - в окружении геномных закраин гена COX1 Исходные штаммы были любезно предоставлены нам доктором Томасом Фоксом, в лаборатории которого они и были созданы при помощи метода биолистической трансформации митохондрий. Мы трансформировали эти штаммы конструкцией, содержащей ген устойчивости к антибиотику G418, фланкированный геномными закраинами гена AIM23, и отбирали клоны, в которых прошла гомологичная рекомбинация, на среде с G418. Отобранные клоны были верифицированы на наличие вставки в нужную область генома при помощи ПЦР. 8. Оценка скорости роста клеток полученных штаммов на среде без аргинина в сравнении с клетками исходных штаммов Данные результаты проиллюстрированы экспериментальными данными в приложенном файле, поскольку словесным описанием митохондриальных генетических экспериментов, на наш взгляд, невозможно добиться полного понимания полученных результатов. Штамм COX3::ARG8 с делетированным геном AIM23, по нашим данным, растет на среде без аргинина ровно с такой же скоростью, что и исходный штамм COX3::ARG8 (см. рис.1 в приложенном файле). С одной стороны, этот результат был для нас неожиданным, так как, в соответствии с данными, полученными нами ранее, белка Cox3p в митохондриях в отсутствие Aim23p становится меньше, чем в его присутствии. Однако это может объясняться различиями в стабильности Cox3p в разных условиях, а также фактом, описанным в научной литературе, согласно которому количества всех трех субъединиц цитохромоксидазы, закодированных в митохондриальном геноме дрожжей, в большой степени зависят друг от друга, причем эта зависимость реализуется, скорее всего, на пост-трансляционном уровне. Мы ранее показали, что в дрожжевых в митохондриях в отсутствие белка Aim23p содержится очень мало белка Cox1p; это и может быть причиной того, что белка Cox3p также становится меньше, а при этом трансляция мРНК СОХ3 происходит нормальным образом (что мы и показали в данной работе). Что касается роста на среде без аргинина другого штамма (не содержащего гена AIM23, на основе штамма, в котором в митохондриальном геноме ген COX1 находится в окружении геномных закраин гена COX2, а ген ARG8 - в окружении геномных закраин гена COX1), то результаты этого эксперимента представлены на рис.2 в приложенном файле. Оказалось, что этот штамм способен к росту на среде без аргинина, пусть и хуже, чем родительский штамм с тем же митохондриальным геномом, но содержащий при этом ген AIM23. Этот результат довольно трудно объяснить, поскольку из наших предыдущих исследований мы знаем, что штамм с условным названием СОХ1, в митохондриальном геноме которого под закраинами гена СОХ1 находится ген ARG8, не способен к росту на среде без аргинина в отсутствие Aim23p (см. рис.1). Это означает, что Aim23p совершенно необходим для нормальной работы UTR гена СОХ1. В то же время, в описываемом штамме Aim23p отсутствует, но UTR гена СОХ1 все равно функционируют, поскольку рост на среде без аргинина может объясняться только синтезом белка Arg8p, контролируемым в данном штамме как раз вышеуказанными UTR. Следовательно, в данном штамме UTR гена СОХ1 частично "активируются" не белком Aim23p, а каким-то другим белком. Мы полагаем, что таким активатором в данном случае может являться сам белок Сох1р. Он присутствует в небольших количествах митохондриях штамма-делетанта, что подтверждается ростом этого штамма на среде с глицерином (см. рис.2). Возможно, белок Сох1р может являться активатором своей собственной мРНК в дрожжевых митохондриях, хотя, безусловно, этот вопрос требует дальнейших исследований. 9. Анализ комплексов IV и V дыхательной цепи митохондрий и интермедиатов их сборки в клетках штамма дрожжей, не содержащего гена AIM23, в сравнении с диким типом, методом Blue-Native PAGE Прежде всего, мы измерили активности комплексов IV и V дыхательной цепи митохондрий в штамме дикого типа и штамме-делетанте по AIM23 спектрофотометрическими методами и показали, что в отсутствие Aim23p активности этих комплексов в численном выражении составляют примерно 1/5 от их активности в клетках дрожжей дикого типа. Это не было для нас сюрпризом, учитывая то, что ранее мы показали разбалансировку митохондриальной трансляции в отсутствии Aim23p, и такая разбалансировка в основном наблюдалась для митохондриально- закодированных субъединиц двух данных комплексов. Более интересным оказался эксперимент, в котором мы сравнили активность комплексов в штамме-делетанте при разных временах инкубации. Дело в том, что в соответствии с полученными нами ранее результатами, штамм- делетант может каким-то образом адаптироваться к отсутствию Aim23p, и если в первые несколько часов роста в жидкой среде функция его митохондрий сильно нарушена, то впоследствии она восстанавливается практически до нормальной. В полном согласии с этими данными, активность комплекса IV через 16 часов роста увеличилась в полтора раза и достигла примерно 35% от уровня дикого типа (пороговый уровень, обеспечивающий более или менее нормальную работу комплекса), а активность комплекса V по прошествии того же времени стала равной таковой в штамме дикого типа (см. рис.6). Более того, используя метод Blue-Native PAGE, мы показали, что процессы сборки данных комплексов в штамме-делетанте нарушены, а также получили указания на участие Aim23p в сигнальном пути между митохондрией и ядром: в его отсутствие в митохондриях накапливается избыточное количество субъединиц комплекса V, закодированных в ядре и импортирующихся в митохондрии из цитозоля. 10. Поскольку мы не смогли приобрести запланированное при подаче заявки оборудование (система гель-документирования) в связи со снятием его с производства и существенно более высокой ценой аналогов, мы приобрели более дешевое, но все равно нужное нам оборудование (прибор для измерения поглощения клетками кислорода), но у нас все равно оставались свободные средства. Самым разумным способом их потратить мы признали их выплату в качестве вознаграждения членам коллектива, но при условии выполнения дополнительных работ, отсутствующих в плане. Таким образом, мы выполнили работы по мутационному анализу Aim23p. Данный белок, являясь хоть и неканоническим, но все же третьим фактором инициации трансляции (IF3), содержит так называемые N- и С-концевые удлинения, отсутствующие в бактериальных ортологах. Для IF3 из митохондрий клеток человека была показана важная роль этих удлинений в работе фактора. В связи с этим, мы создали серию мутантных штаммов дрожжей, в которых ген AIM23 был заменен на одну из его мутантных версий: без N-удлинения, без С-удлинения и без обоих удлинений. Оказалось, что одного любого удлинения достаточно для того, чтобы Aim23p функционировал нормально, тогда как отсутствие обоих удлинений приводит к нефункциональности белка. Любопытно, что мы также заменили AIM23 на ген IF3 из митохондрий клеток человека (также в трех вариантах: без N-удлинения, без С-удлинения и без обоих удлинений) и показали, что этому белку для нормальной работы в дрожжевых митохондриях вообще не нужны удлинения. Наконец, мы "пришили" удлинения Aim23p к IF3 из клеток E.coli, и получившийся гибридный белок был так же активен в митохондриях дрожжей, как и Aim23p дикого типа, что в очередной раз подтверждает, что Aim23p действительно выполняет функции третьего фактора митохондриальной трансляции.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Инициация и активация трансляции в митохондриях дрожжей
Результаты этапа: 1. Новые знания относительно физического взаимодействия Aim23p с 5'-НТО мРНК СОХ2 (подтверждение активаторного действия Aim23p на митохондриальную трансляцию) Одна из основных идей тех работ, которые были запланированы на 2018 год, заключалась в описании механизмов, по которым Aim23p мог бы регулировать биосинтез индивидуальных митохондриальных белков дрожжей. Такие механизмы показаны для так называемых трансляционных активаторов дрожжевых митохондрий, большинство из которых физически специфически взаимодействует с 5'-НТО конкретной мРНК в органеллах. Мы решили сфокусироваться на мРНК, кодирующих субъединицы цитохромоксидазы, а из них выбрали мРНК СОХ2, поскольку в наши планы входило использование дрожжевой тригибридной системы, а 5'-НТО мРНК СОХ2 является достаточно короткой (54 нуклеотида). В то же время, в дрожжевой тригибридной системе не рекомендуется использовать РНК длиннее 150 нуклеотидов. Мы надеялись, что это позволит нам детектировать ее взаимодействие с Aim23p, однако наша система дала отрицательный результат. Тем не менее, нельзя однозначно утверждать, что в действительности этого взаимодействия нет. В своем эксперименте мы использовали только фрагмент мРНК COX2, соответствующий 5`-НТО, структура которого может отличаться от той, которую он имеет в полноразмерной мРНК, что также могло препятствовать взаимодействию. Важно также учитывать, что в живой клетке взаимодействие между Aim23p и 5'-НТО мРНК СОХ2 если и происходит, то очевидно в митохондриях, и в это взаимодействие могут быть вовлечены другие митохондриальные факторы. В тригибридной системе это взаимодействие реализуется несколько иначе. Плазмиды находятся и экспрессируются в ядре. Гибридные белки синтезируются в цитоплазме, а гибридная РНК синтезируется в ядре. Два гибридных белка транспортируются в ядро, и там собирается комплекс из трех гибридов системы. В ядре, кроме того, могут отсутствовать те митохондриальные факторы, которые вовлечены во взаимодействие в митохондриях. Наконец, важно отметить, что генетическое взаимодействие между Aim23p и 5'-НТО мРНК СОХ2 нами убедительно продемонстрировано и в этом, и в прошлом году при выполнении гранта. Таким образом, данный результат, хоть и является отрицательным, но нисколько не отменяет возможность специфического воздействия Aim23p на индивидуальные митохондриальные мРНК, в частности, на СОХ2. Данные результаты на момент отчета готовятся к публикации в журнале Journal of Molecular Biology. 2. Новые знания о важности Aim23p для трансляции мРНК СОХ1, СОХ2 и СОХ3 (количественные данные о "силе" активации этих мРНК на основе детекции маркерного белка Arg8p в профилях митохондриальной трансляции и иммунологическим методом) Данные, полученные в 2017 году, заставляют предположить, что хотя бы некоторые из вышеперечисленных мРНК могут транслироваться в отсутствие Aim23p, и было интересным количественно оценить уровень такой трансляции по содержанию маркерного белка. Это позволило бы внести некоторую ясность в вопрос о возможной прямой взаимосвязи количеств трех митохондриально-закодированных субъединиц цитохромоксидазы дрожжей. Мы провели эксперименты по анализу профиля митохондриальной трансляции в штаммах дрожжей, в которых гены СОХ1, СОХ2 или СОХ3 в геноме митохондрий были заменены на ген ARG8, а также в производных трех данных штаммов с геномными делециями гена AIM23. Оказалось, что в отсутствие Aim23p скорость синтеза Arg8p в контексте НТО СОХ1 практически равна нулю, а в контексте НТО СОХ2 и СОХ3 снижена по сравнению с родительскими штаммами, но все же является достаточно существенной. При этом ранее мы провели эксперименты, согласно которым количества Arg8p в штаммах-делетантах по AIM23 СОХ1 и СОХ2 недостаточно для роста на среде без аргинина, а в штамме СОХ3 (также делетанте) - достаточна. Вполне возможно, что данное противоречие связано со стационарными концентрациями Arg8p в митохондриях мутантных штаммов. Мы оценили это количество посредством Вестерн-блот гибридизации и показали, что штаммы СОХ1 и СОХ2 в отсутствие гена AIM23 содержат существенно меньшие количества Arg8p, чем штамм СОХ3. Надо полагать, что именно стационарные концентрации этого белка определяют возможность штаммов расти на среде без аргинина. Таким образом, наши результаты показывают, что в ряду мРНК СОХ1, СОХ2 и СОХ3 их способность транслироваться транслироваться в отсутствие Aim23p возрастает, хотя ни для одной мРНК не является нормальной. Вопрос о конкретных причинах такой зависимости пока остается открытым. Дело в том, что в митохондриях дрожжей существуют не до конца описанные механизмы взаиморегуляции количества митохондриальных белков. Возможно, что Aim23p напрямую необходим только для трансляции мРНК СОХ1, а критическое снижение количества белка Сох1р вызывает компенсаторное снижение трансляции других мРНК. Данные результаты на момент отчета готовятся к публикации в журнале Journal of Molecular Biology. 3. Новые знания о возможной связи Aim23p с системой трансляционных активаторов дрожжевых митохондрий (на основе возможной супрессии отсутствия AIM23 при помощи больших количеств того или иного трансляционного активатора) Супрессия отсутствия одного трансляционного активатора повышенным количеством другого - классический способ детекции генетического взаимодействия активаторов друг с другом. Мы попытались применить аналогичный подход к основному объекту нашего исследования, белку Aim23p, поскольку полагаем, что он также оказывает активаторные эффекты на анализируемые митохондриальные мРНК. В наших экспериментах мы использовали 8 активаторов трех митохондриальных мРНК (СОХ1, СОХ2 и СОХ3). Мы создали штаммы дрожжей с повышенной экспрессией их генов, делетировали в них ген AIM23 и оценили скорость их роста на среде с глицерином в сравнении со штаммами, в которых ген AIM23p не был удален. К сожалению, в семи из восьми случаев наши результаты оказались невоспроизводимыми, что говорит о нестабильности полученных нами штаммов. В литературе имеются данные, согласно которым повышенные количества некоторых трансляционных активаторов могут приводить к генетической нестабильности, хотя эти данные и несколько противоречивы, что позволяло нам надеяться на успех наших опытов. Тем не менее, для восьмого активатора, а именно для Pet111p (единственного известного активатора мРНК СОХ2) нам удалось достоверно показать увеличение скорости роста в штамме-делетанте по AIM23 в ответ на повышенные количества данного активатора. Таким образом, мы детектировали генетическое взаимодействие между Aim23p и Pet111p. Это является еще одним указанием на вовлеченность Aim23p в работу системы дрожжевых активаторов митохондриальной трансляции. Данные результаты на момент отчета готовятся к публикации в журнале Journal of Molecular Biology. 4. Новые знания о способности белка Aim23p или его укороченного варианта (без концевых удлинений) функционировать в качестве третьего фактора инициации трансляции в клетках E.coli В 2017 году мы показали, что третий фактор инициации трансляции E.coli при "пришивании" к нему концевых удлинений Aim23p способен полностью заменить этот белок в дрожжевых митохондриях, поэтому в 2018 году мы провели обратный эксперимент, а именно экспрессировали ген AIM23 (либо полноразмерный, либо без концевых удлинений) в клетках бактерий в условиях минимальной экспрессии их собственного гена infC, кодирующего третий фактор инициации. Полностью подавить экспрессию данного гена было невозможно, так как внутри него находится промотор нескольких жизненно важных генов E.coli. Отметим, что данная задача потребовала командировки в Тартусский университет (Эстония) для отработки сложных методологических подходов, которыми мы ранее не владели. Полученные нами результаты оказались совершенно неожиданными. Aim23p без концевых удлинений был абсолютно неактивен в бактериальных клетках, а вот полноразмерный Aim23p оказался даже несколько токсичен для E.coli. Хотя это и выходило за рамки запланированных работ, мы не смогли не попытаться разобраться в причинах этого феномена и поставили серию экспериментов по воздействию Aim23p на бактериальные рибосомы In vitro. Канонический IF3 в таких экспериментах связывается только со свободными малыми субъединицами и способствует диссоциации рибосом (так называемая пассивная диссоциация посредством блокировки ре-ассоциации). Aim23p вел себя абсолютно по-другому: он связывался и большими (50S), и с малыми (30S) субъединицами, и с целыми рибосомами (70S), а вместо диссоциации стимулировал формирование неизвестной ранее рибосомной структуры с коэффициентом седиментации 60S. Aim23p без концевых удлинений при этом вообще не связывался с рибосомами и никак не влиял на их диссоциацию. Мы предположили, что 60S-структура является промежуточным динамическим этапом диссоциации рибосом, который по каким-то причинам фиксируется белком Aim23p, точнее, его концевыми удлинениями. Действительно, эксперименты по кросс-сшивкам показали, что 60S не является стабильной структурой, а добавление к 60S-структуре очень малых количеств бактериального IF3 приводило к нормальной диссоциации на 30S и 50S. Таким образом, наше предположение оказалось верным: судя по всему, Aim23p способен фиксировать промежуточное состояние диссоциации рибосом, указания на существование которого имелись еще в классических работах 50-летней давности. Данные результаты частично опубликованы в журнале PeerJ, частично приняты к печати в журнале International Journal of Molecular Sciences. Получив такие неординарные результаты, мы решили на всякий случай проверить, каким образом Aim23p взаимодействует с дрожжевыми митохондриальными рибосомами. Помимо необычного способа взаимодействия с бактериальными рибосомами, наши сомнения подогревались полученными нами в этом году результатами, согласно которым Aim23p не должен рассматриваться как канонический фактор инициации, поскольку он явно способен к специфическому воздействию на индивидуальные митохондриальные мРНК. Проведя эксперименты по диссоциации дрожжевых миторибосом in vitro, мы обнаружили, что Aim23p в этой гомологической системе ведет себя нормально: он связывается только с малыми субъединицами миторибосом и стимулирует диссоциацию целых рибосом на субъединицы. Более того, мы провели эксперименты по ко-иммунопреципитации митохондриальных белков дрожжей с использованием антител к Aim23p и идентифицировали около 20 белковых партнеров этого белка. Все они оказались белками малых миторибосомных субъединиц. Это также указывает на нормальный характер воздействия Aim23p на миторибосомы. Конечно, в этом эксперименте мы очень надеялись идентифицировать хотя бы какие-нибудь трансляционные активаторы, но этого нам не удалось. Скорее всего, причина этого кроется в том, что активаторы присутствуют в дрожжевой клетке в крайне малых количествах (не более сотни молекул на клетку). Данные результаты приняты в печать в журнале Biochemistry Moscow.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Инициация и активация трансляции в митохондриях дрожжей
Результаты этапа: Созданы штаммы дрожжей, в геномах которых к генам восьми трансляционных активаторов мРНК СОХ1, СОХ2 и СОХ3 добавлены последовательности, кодирующие Myc- и/или HA-тэги. Проведена имунопреципитация белков с использованием антител к Myc- и/или HA-тэгам, анализ преципитатов на наличие Aim23p посредством Вестерн-блот гибридизации с антителами к Aim23p. Созданы штаммы дрожжей, содержащих гены AIM23 и восьми трансляционных активаторов мРНК СОХ1, СОХ2 и СОХ3, клонированные в вектора для дрожжевой дигибридной системы. Проведена оценка взаимодействия Aim23p c активаторами мРНК СОХ1, СОХ2 и СОХ3 с использованием дрожжевой дигибридной системы. Проведена оценка параметров митохондриальной функции (профиль митохондриальной трансляции, скорость поглощения кислорода, активность дыхательных комплексов) в штамме-делетанте по AIM23 до и после адаптации к отсутствию Aim23p

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".