Разработка высокочувствительных биоаналитических методов, основанных на применении ДНК олигонуклеотидовНИР

Development of ultrasensitive ioanalytical assays based on use of DNA oligonucleotides

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2017 г.-25 декабря 2017 г. Разработка высокочувствительных биоаналитических методов, основанных на применении ДНК олигонуклеотидов
Результаты этапа: • исследовано влияние структуры аптамера к гемину и присоединенного к нему ДНК олигонуклеотида, а также локализации его присоединения на эффективность катализа нкППДНКзима и его аллостерической активации в присутствии комплементарного олигонуклеотида. • разработаны гомогенные хемилюминесцентные методы определения ДНК на основе аллостерической активации нкППДНКзима; оптимизированы условия проведения анализа определения ДНК, определены их специфичность, чувствительность и точность. • разработаны гомогенные хемилюминесцентные методы определения РНК на основе аллостерической активации нкППДНКзима; оптимизированы условия проведения анализа, определены их специфичность, чувствительность и точность. • разработаны гомогенные хемилюминесцентные методы определения катионов ртути, в основе которых будет лежать взаимодействие пар молекулярных проб, первые из которых будут нкППДНКзимом с присоединенными к нему ДНК олигонуклеотидами, тогда как вторые будут олигонуклеотидами, частично комплементарными к ДНК олигонуклеотидам, присоединенным к нкППДНКзиму, при этом пары молекулярных проб будут содержать в своей структуре несколько тимидинов (Тn), расположенных при образовании дуплекса в позициях друг напротив друга, что позволит в присутствии катионов ртути сформировать дополнительные Т-Hg2+-Т связи, определены их специфичности, чувствительности и точность. • апробирован метод определения катионов ртути в анализе реальных образцов воды. • Опубликованы две статьи (Web of Science, Scopus).
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка высокочувствительных биоаналитических методов, основанных на применении ДНК олигонуклеотидов
Результаты этапа: • Определены оптимальные условия иммобилизации ДНК на поверхности полистироловых планшетов, разработаны три планшетных метода определения ДНК. • разработан хемилюминесцентный метод определения тромбина; оптимизированы условия проведения анализа, определена чувствительность и точность метода. • Синтезированы ковалентный ППДНКзим. Показано, что для разработке высокочувствительных гетерогенных методов анализа ДНК предпочтительно в качестве метки использовать нативную пероксидазу хрена, а не ковалентный ДНКзим • Опубликованы три статьи (Web of Science, Scopus).
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Разработка высокочувствительных биоаналитических методов, основанных на применении ДНК олигонуклеотидов
Результаты этапа: В 2019 году проводились работы по разработке планшетных хемилюминесцентных методов анализа ДНК с применением изотермических методов амплификации нуклеиновых кислот. В качестве модельного аналита как и в предыдущие годы был использован 35-членный фрагмент ДНК вируса гепатита В (5’-TGG GAG GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGG TTA AAG GT-3’). На первом этапе работы была произведена попытка разработки гетерогенного метода анализа ДНК с применением изотермического метода экзонуклеаза III-зависимой циклизации аналита (МЭЗЦА). При работе с экзонуклеазой III требуется контролировать ее активность, поэтому были разработаны 2 модификации простого и чувствительного метода определения активности этого фермента, основываясь на активации пероксидаза-подобного ДНКзима. Предел обнаружения исследуемого фермента составлял 4,8 Ед/мл (7,3 нМ). В нашем методе определения ДНК c МЭЗЦА использовалась следующая схема анализа, в которой реакция амплификации проводилась в растворе при взаимодействии биотинилированного зонда Н1 и аналита в присутствие экзонуклеазы III (из Сибэзима), а образующийся после ферментативного гидролиза фрагмент биотинилированного зонда Н1 (Н1*) количественно определялся при его взаимодействии с флуоресцеин-меченным зондом Н2. Иммобилизацию зонда Н2 производили через антитела против флуоресцеина, предварительно адсорбированные на планшете. Впоследствии биотинилированный фрагмент зонда Н1* реагировал с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза, чья ферментативная активность определялась хемилюминесцентным методом. Данный изотермический метод анализа проводился при 37оС. При проведении данного анализа оказалось, что предел обнаружения был равен ~1 нМ, т.е значительно выше, чем предел обнаружения того же аналита с использованием сэндвич анализа без применения амплификации аналита. Показано, что столь высокое значение предела обнаружения связано с наличием побочной активности экзонуклеазы III, приводящей к гидролизу одноцепочечных молекул ДНК. В следующем варианте разрабатываемого нами метода определения ДНК использовался изотермический амплификационный метод с полимеризацией и замещением (АМПЗ). Этот метод основывается на применении ДНК шпилечной структуры (зонда), короткого праймера и ДНК-полимеразы. Структура зонда также содержала флуоресцеин, позволяющий иммобилизовать зонд на поверхности планшета. Так как последовательность, расположенная на 5’-конце и формирующая стебель зонда и часть его петли, комплементарна анализируемой последовательности фрагмента HVB ДНК, это позволяет им специфически взаимодействовать друг с другом с образованием дуплекса и раскрытием структуры шпильки. Праймер, модифицированный биотином, комплементарен 3’-концу стебля зонда. В отсутствие аналита праймер с зондом не должен взаимодействовать, тогда как в присутствии молекулы аналита после образования дуплекса праймер специфически связывается с освободившимся 3’-концом зонда. Связывание праймера инициирует реакцию его элонгации в присутствии ДНК-полимеразы Кленова и дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. В процессе удлинения праймера синтезируемая последовательность вытесняет аналит, переводя его в несвязанное состояние. Это, в свою очередь, позволяет ему гибридизоваться с другой молекулой зонда-шпильки и запускать следующий цикл полимеризации/вытеснения. Из этого следует, что молекула аналита выступает в качестве триггера реакции полимеризации. Параллельно с расходованием зонда происходит накопление дуплекса, состоящего из зонда и синтезированной последовательности, концентрация которого может быть зарегистрирована с помощью конъюгата стрептавидин-полипероксидаза и реакции усиленной хемилюминесценции. Таким образом, изотермический АМПЗ позволяет амплифицировать сигнал при постоянной концентрации ДНК-аналита. Условия проведения данного метода анализа были оптимизированы при варьировании структуры праймера, времени амплификации, температуры анализа, концентрации праймера, дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов и конъюгата стрептавидина и полипероксидазы. Полученная при оптимизированных условиях калибровочная кривая позволила рассчитать значение предела обнаружения, равное 14 фМ. Значения коэффициента вариации метода в рабочем диапазоне лежат в районе 2 - 7%. При изучении специфичности метода также было показано, что аналоги аналита с одной, двумя и тремя заменами понижали интенсивность сигнала на 59, 63 и 74% соответственно. В случае некомплементарной последовательности сигнал был равен фону. Таким образом, нами был разработан специфичный метод определения ДНК с применением АМПЗ. Кроме изотермических методов амплификации, катализируемых полимеразами, также описаны методы амплификации с применением никаз. В нашей работе была использована никаза N.Bst9.I. Для этого с помощью антител против флуоресцеина на поверхности планшета был иммобилизован ДНК-зонд, содержащий на концах флуоресцеин и биотин. Детекция иммобилизованного зонда проводилась с помощью конъюгата стрептавидина и полипероксидазы хемилюминесцентным методом. Данный одноцепочечный зонд не гидролизуется никазой. Однако в присутствии аналита после образования специфического дуплекса никаза приобретает способность гидролизовать зонд, в результате чего дуплекс диссоциирует и число биотиновых остатков на поверхности планшета понижается. Более того, высвобождается молекула аналита, которая способна вступать в реакцию со следующей молекулой зонда, что должно приводить к дополнительному понижению сигнала. Условия проведения данного метода анализа были оптимизированы. Полученная при оптимизированных условиях (100 ед/мл никаза, 10 нM зонд, реакция амплификации -19 час при 55о C) калибровочная кривая позволила рассчитать значение предела обнаружения, равное 300 пМ. Полученные результаты показали, что данный метод не является перспективным, так как он требует высокой концентрации фермента, время затратен, проводиться должен при повышенной температуре, а главное, его чувствительность очень низка. На заключительном этапе проекта проводились работы по разработке метода анализа ДНК с применением метода амплификации, названного «каталитическая сборка шпилек» (МКСШ). В отличие от предыдущих методов амплификации для проведения МКСШ не требуется использования какого-либо фермента. Это обстоятельство может значительно понизить стоимость проведения анализа. Предварительно флуоресцеин-модифицированная шпилька (FAM-HP1) была иммобилизована на поверхности планшета. Структура шпилек (FAM-HP1 и биотин-HP2) была смоделирована в соответствии с теорией МКСШ. В присутствии фрагмента ДНК вируса гепатита B (модельного аналита) FAM-HP1 образовывал дуплекс с аналитом, одновременно переводя его из закрытой в открытую форму и появлению в доступном виде последовательности HP1, комплементарной HP2. Появление этой области приводило к гибридизации шпилек с образованием дуплекса FAM-HP1/биотин-HP2 и одновременному переходу ДНК-мишени в свободное состояние. Высвобожденный аналит инициировал следующий цикл МКСШ. Таким образом, одна молекула аналита индуцировала выработку большего числа молекул комплекса FAM-HP1/HP2-биотин. В отсутствие ДНК-аналита шпильки HP1 и HP2 в закрытых формах не реагировали друг с другом. Количество полученного комплекса FAM-HP1/HP2-биотин оценивали, используя реакцию дуплексов FAM-HP1/биотин-HP2 с конъюгатом стрептавидин-полипероксидаза, а измеряя активность пероксидазы с помощью реакции усиленной хемилюминесценции. Для оптимизации экспериментальных условий анализа варьировали концентрацию FAM-HP1 и биотина-HP2, температуру и время проведения МКСШ. Повышение концентрации биотина-HP2 в диапазоне от 1,5 до 12,5 нМ увеличивало как фон, так и сигнал. В то же время было показано, что изменение концентрации биотина-HP2 в реакционном растворе не влияет на величину предела обнаружения. Также показано, что при использовании биотина-HP2 в концентрациях 6,3 и 12,5 нМ коэффициент вариации (CV) составлял 2,5-5,0%. Снижение концентрации биотина-HP2 до 3,1 и 1,5 нМ привело к увеличению значений CV до 24%, т.е. точность анализа резко снижалась. Принимая во внимание вышеизложенное, в дальнейшей работе мы использовали биотин-HP2 в концентрации 6,3 нМ. Время проведения амплификации также было оптимизировано. Наилучшие результаты были получены при проведении МКСШ в течение 30-60 мин. Продление этапа МКСШ до 120 мин приводило к небольшому увеличению предела обнаружения (20 фМ). Кроме того, если этап МКСШ был выполнен вне временного интервала 30-60 минут, наблюдались более высокие значения CV. Следовательно, предлагаемый анализ ДНК имеет лучшие аналитические параметры, когда стадию амплификации проводят в течение 30-60 мин при 25 ° C с использованием концентрации биотина-HP2 6,3 нМ. Зависимость хемилюминесценции от концентрации аналита, полученной в оптимизированных условиях, позволила построить калибровочную кривую для разработанного метода анализа ДНК HBV. Калибровочная кривая подчинялась экспоненциальному уравнению f = yо+a(1- ) (R2 = 0,9859). Значение предела обнаружения и рабочий диапазон для предложенного метода анализа ДНК HBV составили 5 и 12-10000 фМ соответственно. Следует отметить, что коэффициент вариации для определения концентрации ДНК HBV в линейном диапазоне анализа составлял 3-8%. Специфичность предложенного анализа ДНК была исследована путем измерения интенсивности хемилюминесценции в присутствии аналита и последовательностей с заменами одного, двух и трех оснований в последовательности аналита. Замена одного основания в последовательности-мишени снижала его детектируемость на 81%. В случае замены двух и трех оснований ДНК сигналы хемилюминесценции были практически одинаковыми и равными сигналам, полученным для некомплементарной последовательности (3-5%). Эти результаты продемонстрировали высокую специфичность разработанного анализа ДНК. Чтобы продемонстрировать практическую значимость данного метода, мы применили его для обнаружения ДНК-аналита в образцах плазмы здорового человека, используя метод «введено-найдено». Показано, что неразбавленные и 10-кратно разведенные образцы не позволяют корректно определять концентрацию ДНК. В этих случаях значения открытия находились в пределах 3,5-14,5% и 35,5-52% соответственно. В то же время величина этого параметра значительно увеличилась, достигая в некоторых случаях 100%, когда образцы плазмы разводили в 100 раз. Таким образом, полученные результаты открывают многообещающие перспективы для использования предложенного метода обнаружения ДНК в реальных биологических образцах. Таким образом, в этой работе был разработан чувствительный гетерогенный анализ для количественного определения ДНК. Высокая чувствительность анализа была предопределена использованием стратегии тройной амплификации, основанной на МКСШ, применении конъюгата стрептавидин-полипероксидаза и хемилюминесцентном определении активности пероксидазы. Этот подход позволил разработать анализ ДНК с фемтомолярным концентрационным диапазоном. Кроме того, этот анализ продемонстрировал высокую селективность. Использование микропланшетов, которые широко применяются в производстве наборов для иммуноферментного анализа, в предлагаемом гетерогенном анализе предлагает универсальную платформу для практического обнаружения нуклеиновых кислот, поскольку анализы на основе микропланшетов могут быть легко автоматизированы, иметь высокую производительность и безопасность. Кроме того, стандартизированные коммерческие микропланшеты позволили разработать анализ с высокой точностью. Формат анализа, где все этапы определения ДНК выполняются в одной и той же лунке планшета без переноса образцов из одной реакционного сосуда в другой, дополнительно повышает его точность. Наконец, мы проиллюстрировали, что анализ, разработанный в этой работе, позволил количественно определить ДНК HBV в образцах человеческой плазмы. Таким образом, это исследование предоставляет новый эффективный инструмент для обнаружения ДНК.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".