![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Основная задача, решаемая в данном проекте – выяснение роли четвертичной структуры в транспортной функции мPPp. Этот интегральный белок мембраны представляет собой димер идентичных субъединиц. Кинетические данные показывают, что функциональна лишь одна из субъединиц димера. Мы планируем проверить гипотезу, согласно которой, вторая субъединица выполняет функцию промежуточного аккумулятора энергии, выделяющейся при связывании и гидролизе высокоэнергетического субстрата ( пирофосфата) и используемой в дальнейшем для транспорта катиона. Развитием этой идеи будет унифицированный механизм транспорта Н+ и Na+ пирофосфатазой. Этот механизм, который мы называем «бильярдным» предполагает, что транспортная специфич ность определяется способностью переносч ика связать тот или иной катион на входе в проводящий канал. Триггером транспорта служит протон, образующийся из нуклеофильной воды на стадии гидролиза. За счет кулоновского взаимодействия он выталкивает катион (Н+ или Na+), связанный на входе, в протон-проводящий канал и занимает освободившееся место, но может быть вытеснен натрием до начала следующего каталитического цикла. Такой механизм тоже не был ранее описан для мембранных переносчиков.
The major problem addressed by this project consists in elucidation of the role of oligomeric structure in the transport function of the membrane pyrophosphate-dependent monovalent cation pump mPPp. This integral membrane protein is a homodimer, and earlier kinetic studies suggested that only one subunit is functional. We will test the hypothesis that the partner subunits act as a transient store of the energy released upon substrate binding and hydrolysis and subsequently used for the cation transport. A related problem is the transport mechanism and the way in which it is coupled to high-energy substrate hydrolysis. This idea will be extended to formulate a unified mechanism for Na+ and H+ transport. The mechanism, which we call “billiard-type” mechanism, presumes that transport specificity is determined by the ability to bind a particular cation at the entrance to the ion-conducting channel. The transport is triggered by the proton generated from the nucleophilic water molecule at the hydrolysis step. The proton pushes electrostatically the bound cation (H+ or Na+) into the ion-conducting channel and occupies the vacant place but can be displaced by the medium Na+ before the next catalytic cycle starts. Such a mechanism has not yet been described for any membrane transporter.
Научный коллектив имеет большой опыт работы в области энзимологии, мембранного транспорта, генной инженерии и микробиологии, в том числе с mPPp (мембранными пирофосфатазами); им накоплен значительный опыт в исследовании энергопреобразующих ферментов бактерий с использованием современных биохимических и биофизических методов и подходов. Из достижений прежних лет можно отметить открытие Na+-mPPp как нового типа натриевого насоса (Malinen et al., 2007) и нескольких подсемейств пирофосфат-зависимых переносчиков катионов/мембранных пирофосфатаз (Baykov et al., 2013), установление пути эволюции их катионной специфичности (Luoto et al., 2013) и обнаружена функциональная асимметрия в катализе (Anashkin et al., 2021a). Описан полный каталитический цикл у двух негомологичных нерегулируемых растворимых пирофосфатаз (из семейств I и II) и определены константы скорости всех элементарных стадий (Baykov et al., 2000) и структуры ключевых интермедиатов (Heikinheimo et al., 2001). В работах, посвященных Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазе, разработан метод выделения этого фермента из V. harveyi, обнаружено наличие в нем ковалентно присоединенного остатка FMN (Zhou et al., 1999), определена стехиометрия Na+/e- (Bogachev et al., 1997), методами ЭПР- и оптической спектроскопии с использованием техники быстрого смешивания идентифицирована стадия катализа, сопряженная с трансмембранной транслокацией иона натрия (Bogachev et al., 2001, Bogachev et al., 2009a). Полный оперон nqr из V. harveyi клонирован и гетерологически экспрессирован с хорошим выходом активного белка, который выделен в чистом виде с помощью аффинной хроматографии, налажен сайт-специфический мутагенез (Фадеева et al., 2008).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 12 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Молекулярный механизм трансмембранного транспорта моновалентных катионов пирофосфат-зависимой помпой в бактериях и растениях |
Результаты этапа: Методами молекулярной динамики рассчитаны структуры димера мембранного пирофосфат-зависимого Н+-транспортирующего белка mPPp, содержащего в одном или двух гидролитических центрах по одной молекуле пирофосфата, по две молекулы фосфата или одной молекуле фосфата, а также ионы магния и калия (всего 13 структур в двух повторностях). Соответствующие траектории атомов во времени были получены в диапазоне 200 нс. В качестве исходных были использованы структуры, определенные кристаллографически. Полученные структуры соответствуют четырем стадиям реакции гидролиза пирофосфата (связывание комплекса пирофосфата магния, акт гидролиза, удаление первой молекулы фосфата магния, удаление второй молекулы фосфата магния). С помощью сервиса CHARMM-GUI молекулы белка были помещены в липидный бислой, образованный эквимолярной смесью 1-пальмтоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина и 1-пальмтоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина и гидратированы. В расчетах были использованы силовые поля программы AMBER 22 и взятые из литературы силовые поля для пирофосфата и фосфата. Мы характеризовали конформацию каждой субъединицы по трем расстояниям между Cβ-атомами в выбранных характеристических парах аминокислотных остатков. Этот анализ показал связь между состоянием активного центра и положением периплазматических петель, соединяющих спирали 2 и 3 или 5 и 6. Полученные данные детализируют их роль в связывании субстрата, а также подтверждает обнаруженные нами ранее изменения в структуре субъединицы при связывании аналога субстрата в соседней субъединице гомодимера mPPp. Мы также получили усредненные структуры mPPp в интервале 180-200 нс и сравнили их с помощью наложения. Таким способом удалось идентифицировать дополнительные элементы структуры, претерпевающие изменения в ходе каталитического цикла mPPp. Отдельная часть анализа полученных структур была посвящена движению связанных ионов калия, сопровождающему протекание стадий каталитической реакции. Мы обнаружили, что на разных стадиях каталитической реакции в активном центре mPPp связывается от одного до трех ионов калия. Эти результаты дополняют данные рентгеноструктурного анализа, полученные другими авторами, на основании которых считается, что в mPPp есть только один центр связывания иона калия. Полученные данные детализируют также, каким образом ион калия увеличивает нуклеофильность атакующей молекулы воды и способствует удалению продуктов гидролиза из активного центра. Мы также начали экспериментальную работу по присоединению к mPPp тагов, позволяющих выделять белок с помощью аффинной хроматографии. В дальнейшем это позволит получить гетеродимер, образованный активной природной и неактивной мутантной субъединицами и установить значение второй субъединицы для функционирования первой. Задача присоединения тагов затруднена тем, что mPPаза это интегральный мембранный белок, который не содержит объемные гидрофильные участки на N- или C-конце. Полученные данные показали, что, вопреки общепринятому мнению, N-конец mPPp более благоприятен для введения гексагистидинового тага. | ||
2 | 9 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Молекулярный механизм трансмембранного транспорта моновалентных катионов пирофосфат-зависимой помпой в бактериях и растениях |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".