ИСТИНА

Одним из наиболее распространенных видов рака среди мужчин является рак предстательной железы (РПЖ). Хорошо зарекомендовавшим себя белковым маркером данного заболевания является простатический специфический мембранный антиген (ПСМА). Его экспрессия на порядки повышается в патологических клетках по сравнению со здоровыми. Из существующих ингибиторов ПСМА, наибольшее распространение получили лиганды на основе мочевины [1, 2]. Смертность больных раком предстательной железы все чаще связывают не с первичной опухолью, а с сопутствующим метастатическим заболеванием. Таким образом, метастазы напрямую влияют на прогноз и клинический исход заболевания. Поэтому их диагностика также играет важную роль в течении заболевания. В настоящее время существуют 2 основных подхода к диагностике онкологических опухолей: 1) использование радионуклидов; 2) использование флуоресцентных красителей. Среди радиофармпрепаратов некоторые уже проходят клинические испытания, а, например, [68Ga]-PSMA-11 уже одобрен FDA. Однако, при использовании радиофармпрепаратов проявляется ряд недостатков, связанных с получением, хранением и временем жизни радионуклидов, а также с продуктами их распада. Использование флуоресцентных красителей является альтернативным методом визуализации злокачественных новообразований, поскольку к их преимуществам относится: длительность хранения, скорость обнаружения, отсутствие радиоактивности, низкая дозировка. Биологическая совместимость флуоресцентных красителей хорошо доказана, например, наиболее известный карбоцианиновый краситель – индоцианиновый зеленый (ICG) – одобрен FDA и широко используется в клинической практике для оптической визуализации, в том числе для ангиографии [3], для визуализации лимфатической, билиарной и кишечной систем и как визуализатор в стоматологии и в онкологической хирургии [4]. В процессе интраоперационной резекции опухоли хирургам необходимо точно знать ее локализацию, что является важной и сложной задачей. Если удалить злокачественное новообразование не полностью, это может снизить эффективность проводимого хирургического вмешательства и привести к рецидиву заболевания. В качестве окрашивающих препаратов зачастую используются флуоресцентные красители, благодаря вышеописанным преимуществам. От структуры флуорофора зависят спектральные характеристики, позволяющие регистрировать состояние системы и локализацию объекта визуализации в ходе диагностики (в случае гистологических исследований) и операций. Уникальные фотофизические свойства карбоцианинов в различных средах и широком диапазоне длин волн поглощения и флуоресценции привели к их использованию в самых разнообразных областях аналитической химии, биологии и медицины для количественного мониторинга процессов в тканях in vitro, ex vivo и in vivo. Проблема и недостаток описанных в литературе конъюгатов с карбоцианинами, направленных на РПЖ, заключается в том, что основной упор на модификацию и улучшение структуры конъюгатов направлен на варьирование и оптимизацию структуры векторного фрагмента. Однако, большое влияние на свойства всей молекулы, может оказать и структура карбоцианина. Описаны случаи, когда при конъюгировании лиганда с высокими показателями сродства (Ki = 10 - 15 нМ) и хорошо зарекомендовавшей себя флуоресцентной меткой, на выходе получался конъюгат с молярными значениями константы ингибирования (Ki = 700 нМ) [5]. Как правило, в таких случаях авторы полностью меняют либо структуру лиганда, либо берут другую коммерчески доступную метку. Таким образом, происходит ограничение в применении уже разработанных лигандов и целых классов карбоцианинов, в то время как решение проблемы может скрываться, например, в недостаточной растворимости конъюгата или в стерических взаимодействиях, которые можно скорректировать за счет структуры метки. На сегодняшний день проведено недостаточно исследований соотношения структура активность между строением флуоресцентной метки на основе карбоцианина и сродством (а также спектральными и физико-химическими характеристиками) конъюгатов к ПСМА.

Surgical resection of malignant neoplasms is one of the effective ways to fight prostate cancer, one of the leading types of cancer among men. The efficiency of intraoperative diagnostics in this case is of fundamental importance, because otherwise part of the tumor tissues can remain, which can lead to recurrence. Tumor visualization is performed using fluorescent dyes conjugated with selectively targeting target protein molecule. In the case of prostate cancer (PCa), the target protein is prostate specific membrane antigen (PSMA). Urea-based low-molecular-weight inhibitors have been widely used as vector-directed PSMA molecules. The introduction of dipeptides into the linker structure of PSMA conjugates has a positive effect on the biological activity of the whole molecule. Based on previous studies, a PSMA inhibitor ligand with a dipeptide structure based on phenylalanine and tyrosine will be taken as the basis of the vector system. On their basis, conjugates with such fluorescent dyes as 800CW, ICG, Cy7, Cy5.5, etc. are being developed. It is worth noting that ICG (indocyanine green) is FDA-approved and used in clinical practice in many areas. However, a disadvantage of the works performed is that there is no systematic choice of the fluorescent tags used, and the resulting conjugates do not always show high affinity to PSMA. The project aims to investigate the structure-activity relationship between the introduction of certain functional groups into the structure of carbocyanines and the affinity to PSMA. This will help facilitate the selection of fluorescent dyes when creating new PSMA fluorescent conjugates for histology kits and intraoperative imaging tools. It is also worth noting that there are no commercially available registered diagnostic conjugates with carbocyanines against PSMA in Russia, which is a significant gap.

Будет проведена разработка и описание методик синтеза модифицированных карбоцианинов и лигандов ПСМА, готовых для дальнейшего конъюгирования. Полученные соединения будут описаны с помощью методов физико- химического анализа 1H ЯМР, 13C ЯМР, HRMS, ВЭЖХ). Планируется получить не менее 5 флуоресцентных красителей и 2 лигандов, модифицированных для реакций пептидного синтеза и азид-алкинового присоединения. Будет проведено описание методики получения диагностического конъюгата и подтверждение его структуры.

В рамках проведенной работы удалось достичь следующие научные результаты Разработан подход к созданию структурных модификаций карбоцианинов с целью направленного синтеза флурофоров для ковалентного связывания с ПСМА-лигандами. Была проведена оптимизация методик получения симметричных и несимметричных трикарбоцианиновых красителей, содержащие атом хлора в мезо-положении полиметиновой цепи. Были выбраны оптимальные пути синтеза гетероциклических солей. Был разработан подход к синтезу трикарбоцианиновых красителей, модифицированных β-аланином в мезо-положении полиметиновой цепи, для осуществления пептидного синтеза с лигандами, а также были индивидуально подобраны условия выделения и очистки для каждого флуорофора. Был синтезирован, выделен и охарактеризован новый флуорофор, содержащий аминокислоту, в основе которого был бензиндолениновый гетероцикл, содержащий алкилсульфонатные группы при четвертичном атоме азота. При введении аминокислоты в полиеновую цепь наблюдалось смещение максимума поглощения в область 640-655 нм из 790-820 нм. Были подобраны методики получения новых флуорофоров, способных вступать в клик-реакцию. Были синтезированы гепта- и пентаметиновые красители, содержащие алкинильный фрагмент в мезо-положении полиметиновой цепи и при четвертичном атоме азота соответственно. В случае гептаметинового конформационно закрепленного красителя для смещения максимума поглощения в 640 нм был введен пропаргиламин в мезо-положение полиметиновой цепи. Синтез пентаметинового красителя был осуществлен последовательным замещением дианила двумя гетероциклическими солями, одна из которых содержала алкинильный фрагмент при кватернизированном атоме азота (максимум поглощения смещался из 515 нм в область 655 нм). В результате удалось выделить ранее неописанные флуорофоры, способные вступать в дальнейшую клик- реакцию с лигандом. Таким образом были разработаны и оптимизированы методологии синтеза карбоцианинов с учетом направления их структурной модификации: природы гетероцикла, длины полиметиновой цепи и природы заместителей в различных структурных фрагментах и в результате получены 11 флуорофоров, 3 из которых являются ранее неописанными в литературе. Была проведена оптимизация методик получения селективно направленных лигандов на простатический специфический мембранный антиген (ПСМА) с терминальной азидо-группой и с терминальной амино-группой. За основу была взята структура мета-хлор замещенный ароматический фрагмент при атоме азота лизина и дипептидной цепочкой в структуре линкера L-Phe-L-Tyr. В частности, была оптимизирована методика удаления t- Bu защитных групп с целевых лигандов при одновременном удалении его с полимерного носителя. Таким образом, было получено 4 лиганда селективно направленных на простатический специфический мембранный антиген: 3 из которых представляют собой структуру мета-Cl L-Phe-L-Tyr для различных способов конъюгирования: с трет-Bu защитными группами в структуре мочевины и терминальной амино-группой, свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной амино-группой, свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной азидо- группой. Также наработан дополнительный лиганд пара-COOH L-Phe-L-Tyr(3-NO2) со свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной азидо- группой. Была проведена оптимизация методик конъюгирования полученных карбоцианиновых красителей и лигандов ПСМА. Было получено 2 конъюгата с использованием активированных эфиров HOBt и NHS. Была разработана методика введения лиганда сразу в полимерную цепь карбоцианина путем замещения атома хлора на азот в терминальной амино-группе в структуре линкера лиганда ПСМА. Полученный таким образом конъюгат охарактеризован масс-спектрометрически и находится на стадии дополнительной очистки. Был получен ранее не описанный конъюгат через [3+2] азид- алкиновое присоединение, с несимметричной флуоресцентной меткой. Максимум поглощения конъюгата соответствует максимуму поглощения не конъюгированной метки. По итогу было получено 3 конъюгата: 1 методами классического пептидного синтеза, 1 по новой синтетической схеме путем нуклеофильного замещения и 1 методом азид-алкинового циклоприсоединения. 1 конъюгат описан основными методами физико- химического анализа и готов к биологическим исследованиям in vitro. Результаты проделанной работы были опубликованы в следующих статьях: 1. Fluorescent conjugates based on prostate-specific membrane antigen ligands as an effective visualization tool for prostate cancer / A. A. Uspenskaia, P. A. Krasnikov, E. K. Beloglazkina, A. E. Machulkin // Biochemistry (Moscow). — 2023. — Vol. 88, no. 7. — P. 953–967. (doi: 10.1134/S0006297923070088) На русском: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ЛИГАНДОВ ПРОСТАТИЧЕСКОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА КАК ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ВИЗУАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ / А. А. УСПЕНСКАЯ, П. А. КРАСНИКОВ, А. Г. МАЖУГА и др. // Биохимия. — 2023. — Т. 88, № 7. — С. 1173–1190 (doi: 10.31857/S0320972523070084)