|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентностиНИР
Study of bacterial resistance to antibiotics based on the production of recombinant beta-lactamases, determination of their structure and interaction with substrates and inhibitors by mathematical modeling and enzymatic kinetics, development of antibacterial compounds and new drug forms, methods of molecular diagnostics of antibiotic resistance of bacteria and determination of antibiotics in environmental objects and food to create new approaches to effectively combat the resistance
- Руководитель НИР: Егоров А.М.
- Ответственные исполнители: Григоренко В.Г., Рубцова М.Ю.
- Участники НИР: Андреева И.П., Еремин С.А., Клячко Н.Л., Кудряшова Е.В., Левашов П.А., Лопухов А.В., Мухаметова Л.И., Преснова Г.В., Уляшова М.М., Упоров И.В., Филатова Л.Ю., Хренова М.Г.
- Подразделение: Кафедра химической энзимологии
- Срок исполнения: 2 марта 2023 г. - 31 декабря 2027 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): XXX
- Номер ЦИТИС: 123032300028-0
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Безопасность и противодействие терроризму
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.19.29 Анализ органических веществ
- 31.23.25 Антибиотики
- 31.27.17 Энзимология
- 31.27.22 Антимикробные агенты
- 34.15.05 Методы и аппаратура в молекулярной биологии
- 34.15.27 Генетическая инженерия
- 34.27.29 Биология возбудителей заболеваний человека и животных
- 34.43.05 Методы и аппаратура в иммунологии
- 34.57.21 Материалы для биомедицинского применения
- Классификатор OECD: Математическая и вычислительная биология, Биохимия и молекулярная биология, Биотехнология и прикладная микробиология
-
Ключевые слова:
системы доставки антибактериальных препаратов, молекулярно-генетический анализ генов бета-лактамаз, электрохимические биосенсоры, бета-лактамные антибиотики, ингибиторы бета-лактамаз, методы определения антибиотиков, биоинформатический анализ, пролонгированное действие антибактериальных препаратов, антибиотикорезистентность бактерий, поляризация флуоресценции, структура бета-лактамаз, бета-лактамазы, антибактериальные препараты, молекулярное моделирование
bioinformatic analysis, antibiotic resistance of bacteria, polarization fluorescence immunoassay, beta-lactamase inhibitors, molecular analysis of beta-lactamase genes, beta-lactamase structure, electrochemical biosensors, prolonged action of antibacterial drugs, beta-lactamases, beta-lactam antibiotics, molecular modeling, antibacterial drugs, drug delivery systems -
Описание:
В рамках решения комплексных задач Проекта целями исследования в 2023 г. являлись: проведение комплексного фундаментального изучения структуры и механизмов действия бета-лактамаз, включающего биоинформатический анализ бета-лактамаз разных классов, молекулярное моделирование бета-лактамаз, изучение роли различных мутаций на активность и стабильность бета-лактамаз с использованием коллекции рекомбинантных ферментов, разработка систем скрининга активности ингибиторов на основе рекомбинантных ферментов и набора различных субстратов бета-лактамаз, поиск молекул-кандидатов – новых ингибиторов бета-лактамаз на основе скрининга химических молекул, структура которых предложена на основе литературных данных, данных молекулярного моделирования и химического дизайна, создание новых лекарственных форм антибактериальных препаратов с улучшенной системой доставки, создание новых методов мультиплексного молекулярно-генетического анализа генов бета-лактамаз, разработка нового метода модификации полистирола для создания биочипов в лунках 96-луночных планшетов и применение их для определения клинически-значимых генов бета-лактамаз в клинических штаммах бактерий, устойчивых к антибиотикам, разработка методов иммунохимического определения антибактериальных препаратов в различных объектах на основе поляризационного флуоресцентного анализа.
-
Abstract:
The resistance of pathogenic microorganisms to antibiotics and antibacterial drugs (ABD) is currently a global problem of biology and medicine. The increase in the spread of multi- and pan-resistant pathogenic strains that are simultaneously resistant to several classes of antibiotics makes the treatment of infections much more difficult. Currently, beta-lactam antibiotics account for more than 60% of all manufactured ABDs. But bacterial resistance to them is also the most common and requires the development of new integrated approaches to overcome it. This project aims to create a new integrated approach to overcoming bacterial resistance to beta-lactam ABDs based on a combination of new principles of beta-lactamase inhibition, the creation of combinations of ABDs with new inhibitors, the development of alternative ABDs, new methods of delivery of ABDs and new diagnostic methods for antibiotic-resistant bacteria and ABDs. The objectives of the project are: to study the mechanisms of bacterial resistance to beta-lactams caused by the production of the beta-lactamase superfamily using bioinformatic analysis, computer modeling, various physico-chemical methods; to create a collection of recombinant beta-lactamases of different substrate specificity; to study the structure and mechanism of action of beta-lactamases and the effect of their mutations on the activity and stability of enzymes; identification of new inhibition targets; development of systems for screening the activity of inhibitors based on recombinant enzymes and model bacterial cells; selection of candidate molecules inhibiting beta-lactamases; creation of new ABD delivery systems and their prolonged forms; development of new methods of molecular analysis based on biochips for the determination of beta-lactamase genes and methods for the analysis of ABD in environmental objects and food. Studies of the fundamental directions of studying the mechanisms of formation of bacterial resistance to antibiotics will allow us to create a new strategy for the rational use of medicines based on the combination of ABDs with inhibitors aimed at new targets of enzymes involved in the development of bacterial resistance to antibiotics. The following results were obtained in 2023: A bioinformatic analysis of the protein structures of GES-type serine beta-lactamases belonging to molecular class A. The effect of the Gly170Asp and Gly170Ser mutations of the omega-loop on its conformation has been shown using molecular dynamics methods. A full-atom model of serine beta-lactamase TEM-1 has been constructed to search for possible inhibitors of the allosteric center for the regulation of catalytic activity. The structures of ten beta-lactamase complexes with inhibitors were obtained and analyzed by the method of molecular dynamics. The effect of mutations of residues 276 and 290 on the mobility of the omega-loop is shown. The collection of E.coli strains producing recombinant beta—lactamases has been expanded in relation to new mutant forms of TEM type beta-lactamases containing all possible amino acid substitutions of the Met182 residue. Mutant forms of enzymes are obtained in a homogeneous form. The effect of a single amino acid substitution of the Meth182 residue of serine beta-lactamases of the same type on the stability of enzymes using various physico-chemical methods has been studied. It has been shown that single substitutions of the Met182 residue located on the surface of a protein globule far from the active center can have a multidirectional effect on the stability of the enzyme. A screening system for potential NDM-type metallo-beta-lactamase (MBL) inhibitors using chromogenic and fluorescent substrates has been developed. An experimental study of new potential inhibitors of MBL (dipicolic acid derivatives) was carried out. The interaction of inhibitors and NDM-1 MBL has been studied, and the physico-chemical parameters of inhibition have been determined. The study of meropenem complexes with three modified polymer cyclodextrins was carried out. It has been shown that polymer carriers based on hydroxypropyl beta-cyclodextrin crosslinked with 1,6-hexamethylenediisocyanate form complexes with meropenem with high encapsulation efficiency (82%) and increase its stability in aqueous solution. The effect of additives of various combinations of charged amino acids and glycine on lysozyme activity has been studied. Screening of potential low molecular weight factors affecting lysozyme activity was carried out. It has been shown that the use of double and triple combinations of amino acids can lead to significantly greater activation of lysozyme than was possible with the use of single effectors. With simultaneous use of activators, an increase in lysozyme activity was achieved up to 10 times in the presence of a mixture of glutamate, histidine and arginine for human lysozyme. A new technique for photomodification of polystyrene for covalent oriented immobilization of oligonucleotide probes has been developed. Using it, biochips have been developed in the wells of 96-well plates to identify 11 types of genes of all clinically significant beta-lactamases of different molecular classes. Biochips allow simultaneous identification of key single nucleotide polymorphisms (SNP) of class A beta-lactamase genes necessary for the recognition of phenotypes of extended-spectrum beta-lactamases and inhibitor-resistant enzymes. The biochips were tested using 65 DNA samples isolated from clinical strains of bacteria with different resistance phenotypes. A high correlation with real-time sequencing and PCR data is shown. An electrochemical immunosensor based on printed graphite electrodes has been developed for the determination of the antibiotic chloramphenicol in water and milk samples. The limit of detection of chloramphenicol in water was 0.02 mcg/l, in milk - 0.04 mcg/l. The technique has been tested using real milk samples. A new technique for the determination of chloramphenicol by immunoassay with detection based on fluorescence polarization has been developed. For this purpose, fluorescently labeled chloramphenicol conjugates with different spacer lengths between hapten and fluorophore were obtained and characterized, the kinetics of antibody binding to conjugates was studied, and the analysis conditions were optimized. It has been shown that the use of a tracer with a C5 linker makes it possible to reduce the detection limit of the antibiotic to 5 ng/ml. The technique has been tested using real water samples containing chloramphenicol.
-
Планируемые результаты:
Будет проведен биоинформатический анализ структур бета-лактамаз из Protein Data Bank и проведено построение полноатомных моделей модельных бета-лактамаз. Будут созданы штаммы-продуценты и разработаны методы выделения и очистки рекомбинантных бета-лактамаз. Будет проведено экспериментальное изучение новых потенциальных ингибиторов выбранных бета-лактамаз, определены физико-химические параметры ингибирования. Будет изучено взаимодействие ингибиторов и бета-лактамаз. Будет создан дизайн высокоэффективной лекарственной формы меропенема с использованием полимерных циклодекстринов, включающий разработку системы пролонгированного действия и увеличение стабильности препарата. Будут исследованы механизмы резистентности бактерий к защитным факторам иммунной системы, в частности резистентности бактерий к действию фермента лизоцима иммунных фагоцитирующих клеток. Будет проведен скрининг потенциальных низкомолекулярных факторов, нейтрализующих бактериальную резистентность. Будет разработана методика фотомодификации полистирола, обеспечивающая ковалентную ориентированную иммобилизацию олигонуклеотидных зондов, которая будет применена для разработки мультиплексной молекулярной диагностики генов антибиотикорезистентности на биочипах. Будут разработаны новые методики определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания. получить, очистить и охарактеризовать флуоресцентномеченные конъюгаты хлорамфеникола с различной длиной спейсера между гаптеном и флуорофором, изучить кинетику связывания, полученных конъюгатов с антисывороткой к хлорамфениколу, оптимизировать условия FPIA и выбрать пару иммунореагентов для создания методики определения хлорамфеникола. Выявить конъюгат с оптимальной длиной спейсера для FPIA. Апробировать разработанную методику на реальных объектах.
-
Научный задел:
Научные исследования проводились по трем основным направлениям: 1) изучение структурных особенностей бета-лактамаз разных молекулярных классов и анализ структур их комплексов с ингибиторами; 2) молекулярное моделирование бета-лактамаз ТЕМ- и NDM-типов и их комплексов с лигандами и ингибиторами; 3) репозиционирование известных лекарственных препаратов для ингибирования бета-лактамаз; 4) разработка новых молекулярно-генетических методов определениягенов бета-лактамаз. Основные ранее полученные результаты: 1) создана коллекция рекомбинантных бета-лактамаз, относящихся к разным молекулярным классам (сериновых и метало-бета-лактамаз), охарактеризована их каталитическая активность; 2) впервые получены и проанализированы новые кристаллические структуры нативной бета-лактамазы TEM-171 и двух ее комплексов с широко используемым ингибитором тазобактамом; различие в структурах двух комплексов состоит в конформации ингибитора в активном центре фермента; структуры комплексов соответствуют разным стадиям деацилирования ацил-ферментного комплекса; 3) установлена ингибирующая активность известного детоксицирующего антидота 2,3-димеркаптопропан-1-сульфоната (унитиола) против металло-β-лактамаз двух типов; показано, что унитиол действует как конкурентный ингибитор гидролиза меропенема рекомбинантной металло-β-лактамазой NDM-1; показано, что унитиол ингибирует природные металло-β-лактамазы NDM-1 и VIM-2, продуцируемые резистентными к карбапенемам штаммами К. pneumonia и E. сoli; 4) разработаны биочипы с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена для определения генов бета-лактамаз молекулярных классов A, B, D: разработан метод определения специфичных генов бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах.
-
Основные результаты:
Резистентность патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибиотикам и антибактериальным препаратам (АБП) является в настоящее время глобальной проблемой биологии и медицины. Увеличение распространения мульти- и пан-резистентных патогенных штаммов, одновременно устойчивых к нескольким классам антибиотиков делает лечение инфекций значительно более сложным. В настоящее время бета-лактамные препараты составляют более 60% от объема всех производимых АБП. Но и резистентность бактерий к ним является самой распространенной и требует разработки новых комплексных подходов к ее преодолению. Данный проект направлен на создание нового комплексного подхода к преодолению резистентности бактерий к бета-лактамным АБП на основе сочетания новых принципов ингибирования бета-лактамаз, создания комбинаций АБП с новыми ингибиторами, разработки альтернативных АБП, новых методов доставки АБП и новых методов диагностики антибиотикорезистентных бактерий и АБП. Целями проекта являются: изучение механизмов резистентности бактерий к бета-лактамам, обусловленных продукцией суперсемейства бета-лактамаз с использованием биоинформатического анализа, компьютерного моделирования, различных физико-химических методов; создание коллекции рекомбинантных бета-лактамаз разной субстратной специфичности; изучение структуры и механизма действия бета-лактамаз и влияния их мутаций на активность и стабильность ферментов; определение новых мишеней ингибирования; разработка систем скрининга активности ингибиторов на основе рекомбинантных ферментов и модельных бактериальных клеток; выбор молекул-кандидатов, ингибирующих бета-лактамазы; создание новых систем доставки АБП и их пролонгированных форм; разработка новых методов молекулярно-генетического анализа на основе биочипов для определения генов бета-лактамаз и методов анализа АБП в объектах окружающей среды и пище. Исследования фундаментальных направлений изучения механизмов формирования резистентности бактерий к антибиотикам позволят создать новую стратегию рационального применения лекарственных препаратов но основе комбинирования АБП с ингибиторами, направленными к новым мишеням ферментов, участвующим в развитии резистентности бактерий к антибиотикам. По направлениям исследований в 2023 году получены следующие результаты: Проведен биоинформатический анализ белковых структур сериновых бета-лактамаз GES типа, относящихся к молекулярному классу А. С использованием методов молекулярной динамики показано влияние мутации Gly170Asp и Gly170Ser омега-петли на ее конформацию. Построена полноатомная модель сериновой бета-лактамазы ТЕМ-1 для поиска возможных ингибиторов аллостерического центра регуляции каталитической активности. Получены и проанализированы структуры десяти комплексов бета-лактамазы с ингибиторами методом молекулярной динамики. Показана влияние мутаций остатков 276 и 290 на подвижность омега-петли. Расширена коллекция штаммов E.coli—продуцентов рекомбинантных бета-лактамаз в отношении новых мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа, содержащих все возможные аминокислотные замены остатка Met182. Мутантные формы ферментов получены в гомогенной форме. Проведено изучение влияния единичной аминокислотной замены остатка Мet182 сериновых бета-лактамаз ТЕМ типа на стабильность ферментов с использованием различных физико-химических методов. Показано, что единичные замены остатка Мet182, находящегося на поверхности белковой глобулы удаленно от активного центра, могут иметь разнонаправленное действие на стабильность фермента. Разработана система скрининга потенциальных ингибиторов металло-бета-лактамаз (МБЛ) NDM типа с использованием хромогенного и флуоресцентного субстратов. С ее использованием проведено экспериментальное изучение новых потенциальных ингибиторов МБЛ данного типа – производных дипиколиновой кислоты. Изучено взаимодействие ингибиторов и МБЛ NDM-1, определены физико-химические параметры ингибирования. Проведено исследование комплексов меропенема с тремя модифицированными полимерными циклодекстринами. Показано, что полимерные носители на основе гидроксипропил-бета-циклодекстрина, сшитого 1,6-гексаметилендиизоцианатом, образуют комплексы с меропенемом с высокой эффективностью инкапсуляции (82%) и увеличивают его стабильность в водном растворе. Изучено влияние добавок различных комбинаций заряженных аминокислот и глицина на активность лизоцима. Проведен скрининг потенциальных низкомолекулярных факторов влияющих на активность лизоцима. Показано, что использование двойных и тройных комбинаций аминокислот может привести к значительно большей активации лизоцима, чем это было возможно при использовании одиночных эффекторов. При одновременном применении активаторов достигнуто увеличение активности лизоцима до 10 раз в присутствии смеси глутамата, гистидина и аргинина для лизоцима человека. Разработана новая методика фотомодификации полистирола для ковалентной ориентированной иммобилизации олигонуклеотидных зондов. С ее использованием разработаны биочипы в лунках 96-луночных планшетов для идентификации 11 типов генов всех клинически значимых бета-лактамаз разных молекулярных классов. Биочипы позволяют проводить одновременно определение ключевых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов бета-лактамаз класса А, необходимых для распознавания фенотипов бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-устойчивых ферментов. Апробация биочипов проведена с использованием 65 образцов ДНК, выделенных из клинических штаммов бактерий с разными фенотипами устойчивости. Показана высокая корреляция с данными секвенирования и ПЦР в режиме реального времени. Разработан электрохимический иммуносенсор на основе печатных графитовых электродов для определения антибиотика хлорамфеникола в воде и образцах молока. Предел обнаружения хлорамфеникола в воде составил 0.02 мкг/л, в молоке - 0.04 мкг/л. Методика апробирована с использованием реальных образцов молока. Разработана новая методика определения хлорамфеникола методом иммуноанализа с детекцией на основе поляризации флуоресценции. Для этого получены и охарактеризованы флуоресцентно-меченные конъюгаты хлорамфеникола с различной длиной спейсера между гаптеном и флуорофором, изучена кинетика связывания антител с конъюгатами, оптимизированы условия анализа. Показано, что использование трейсера с линкером С5 позволяет снизить предел обнаружения антибиотика до 5 нг/мл. Методика апробирована с использованием реальных образцов воды, содержащих хлорамфеникол.
- Добавил в систему: Егоров Алексей Михайлович
Источник финансирования НИР
| госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 2 марта 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентности |
| Результаты этапа: По направлению изучения структуры и механизма действия бета-лактамаз с использованием методов биоинформатического анализа и молекулярного моделирования: Выполнен биоинформатический анализ структур сериновых бета-лактамаз GES типа, представленных в Protein Data Bank. Данный тип ферментов является относительно молодым в суперсемействе бета-лактамаз, но в последние годы бета-лактамазы GES-типа, относящиеся к бета-лактамазам расширенного спектра, начали активно распространяться среди клинических патогенных штаммов бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний. Данные ферменты относятся к молекулярному классу А. Активный центр этих ферментов, как и всех бета-лактамаз класса А, содержит каталитические аминокислотные остатки серина и лизина. На первой стадии реакции гидролиза бета-лактамных антибиотиков происходит активация серина, затем происходит нуклеофильная атака серина на карбонильный углерод бета-лактамного кольца антибиотика. Все описанные на данный момент ферменты GES можно разделить на две группы: ферменты расширенного спектра действия и ферменты, проявляющие карбапенемазную активность. Ферменты данного типа ингибируются ингибиторами бета-лактамаз I поколения (клавуланатом, тазобактамом) и ингибиторами II поколения (авибактамом, релебактамом и ваборбактамом). Ферменты GES типа, как и другие типы сериновых ферментов класса А, мутируют с образованием мутантных форм ферментов, имеющих единичные и двойные аминокислотные замены. Некоторые из них являются ключевыми и приводят к расширению спектра субстратной специфичности в отношении карбапенемов. В частности, бета-лактамаза GES-2 по сравнению с GES-1 имеет единственную аминокислотную замену Gly170Asp и проявляет гидролитическую активность в отношении карбапенемов. Замена Gly170Ser в бета-лактамазе GES-5 приводит к увеличению этой активности. Данный остаток располагается на важном структурном элементе бета-лактамаз - омега-петле, образованную остатками 164 – 179 и включающую остаток Glu166, который участвует в реакции активации каталитического остатка серина и деацилирования ацил-ферментного комплекса. Подвижность омега-петли определяет реакционную способность фермента. Для определения влияния мутаций остатка 170 омега-петли на ее подвижность были рассчитаны траектории классической молекулярной динамики длиной 500 нс для бета-лактамаз GES-1, -2, -5. Расчёты проводились в ансамбле NPT (p = 1 атм, T = 298 К). Для белка использовалось силовое поле CHARMM36, для молекул воды – TIP3P. Затем проводился анализ RMSD омега-петли. Для фермента GES-1 значения RMSD достигают 6 Å, однако в целом распределение делится на две фракции, вершина которых приходится на 2 Å и 4 Å. Среднее значение RMSD равно 2.8 Å. Для фермента GES-2 значения RMSD достигают 7 Å, но более весомая фракция приходится на 2 Å. Среднее значение для GES-2 равно 2.9 Å. Для фермента GES-5 значения RMSD достигают 8 Å, но более весомая фракция приходится на 1.5 Å. Среднее значение для GES-5 составляет 1.9 Å. Также было рассмотрено расстояние между Сα-атомами Glu166 и Lys73, чтобы понять, насколько далеко во время динамики находятся друг от друга эти остатки. Оказалось, что несмотря на то, что средние значения расстояний близки друг к другу и составляют 11.94 Å, 11.87 Å и 11.2 Å для GES-1, GES-2 и GES-5, соответственно, распределение этого расстояния показывает, что омега-петля в ферменте GES-1 чаще находится в открытом состоянии. В свою очередь омега-петля в мутантных формах чаще находится в «закрытом» состоянии (в 80% динамической траектории) у GES-5 и 50% динамической траектории в закрытом состоянии и 30% - в «приоткрытом» у GES-2. Данный факт объясняется наличием замен 170 остатка, который участвует в деацилировании. В GES-1 170 остаток Gly, боковая цепь которого не образует никаких связей с ближайшими аминокислотными остатками. В GES-2 170 остатком является аспарагин, который образует водородные связи аминогруппой с Glu166, который находится на Ω-петле. В GES-5 170 остаток - серин, который тоже образует водородную связь с Glu166. Во всех рассматриваемых ферментах карбонильный фрагмент пептидной цепи остатка 170 образует водородную связь с HN фрагментом остатка Ala234, который относится к другой структурной части белка. Сила этой водородной связи, которая является одной из удерживающей омега-петлю в закрытом состоянии, меняется при мутации 170 остатка. Таким образом, был сделан вывод о преимуществе «закрытого» состояния Ω-петли для более эффективного гидролиза карбапенемов. Другим направлением работы являлось построение полноатомной модели сериновой бета-лактамазы ТЕМ-1 для поиска возможных ингибиторов. Бета-лактамаза ТЕМ-1 является первой обнаруженной бета-лактамазой и часто используется как модельный фермент в исследованиях по разработке новых подходов к инактивации данного семейства ферментов. Согласно современной классификации, ТЕМ-1 относится к сериновым бета-лактамазам класса А. Данный фермент хорошо ингибируется известными ингибиторами бета-лактамной природы. Однако также известно о существовании потенциального сайта аллостерической регуляции между спиралями H10 и H11 в гидрофобном альфа/бета-домене данного фермента. Аллостерические ингибиторы являются перспективной альтернативой ингибиторам, направленным на активный центр фермента, к которым бета-лактамазы приобретают резистентность. Поиск возможных новых ингибиторов бета-лактамазы ТЕМ-1 проводился с помощью программы SECSE. Для получения полноатомной модели фермента была выбрана структура с PDB ID 1ZG4. Программа SECSE на основе исходной структуры с использованием генетических алгоритмов и модуля глубокого машинного обучения способна предсказывать потенциальные ингибиторы. В качестве исходного фрагмента был выбран бензол. Через пять поколений моделирования были отобраны 10 структур с наилучшими показателями докинга (менее -10 ккал/моль). Получены и проанализированы структуры комплексов бета-лактамазы с предложенными ингибиторами в ранее описанном сайте аллостерической регуляции. Для данных систем была проведена классическая молекулярная динамика с использованием программного пакета NAMD. Все расчёты проводились в ансамбле NPT (p = 1 атм, T = 298 К). Для белка использовалось силовое поле CHARMM36, для ингибиторов – CGenFF, молекул воды – TIP3P. Шаг интегрирования составил 1 фс, продолжительность траекторий - 100 нс. На основе анализа полученных молекулярно-динамических траекторий было выполнено сравнение структуры апо-формы фермента и структур комплексов фермента с потенциальными ингибиторами. Стоит отметить меньшее значение RMSD омега-петли белка, принимающей участие в формировании активного центра бета-лактамазы, для некоторых комплексов фермент-ингибитор по сравнению со структурой апо-формы. Меньшая подвижность омега-петли белка может способствовать уменьшению сродства активного центра к бета-лактамным антибиотикам. Кроме того, в присутствии одного из ингибиторов наблюдается увеличение расстояния с 10 Å до 12 Å между Сα-атомами аминокислотных остатков Glu166 (Ω-петля) и Lys73, что может способствовать снижению активности фермента, так как Glu166 участвует в процессах активации каталитического остатка Ser70 и деацилировании ацил-фермента. Для того, чтобы проверить насколько нарушение взаимодействий в области аллостерического сайта может повлиять на динамику омега-петли был произведен расчет классической молекулярной динамики для двух мутантов ТЕМ-1. В первом случае остаток Asn276, а во втором Trp290 заменялся на Ala. Остаток Asn276 взаимодействует с Arg244, а Trp290 образует T-стекинг c Trp229. Все эти остатки находятся в области аллостерического сайта: Trp229 на петле Н10, Asn276 и Trp290 на петле Н11, Arg244 на бета-листах, образующих внутреннюю часть аллостерического кармана. Взаимодействие этих остатков может быть важным для конформации аллостерического сайта и, как следствие, влиять на подвижность омега-петли. Подвижность омега-петли была проанализирована вдоль молекулярно-динамической траектории длиной в 500 нс и сравнивалась с подвижностью петли в ферменте без мутаций. Анализ RMSD показал, что у бета-лактамазы с мутацией Asn276Ala омега-петля более подвижна и находится в «открытом» состоянии, при мутации Trp290Ala омега-петля находится в закрытом состоянии на протяжении всей динамики. Сравнение динамики омега-петель мутантных форм фермента и исходной структуры фермента ТЕМ-1 показал, что петля в ТЕМ-1 может находиться в обеих конформациях, но чаще находится в более открытой, такой же как в ферменте с мутацией Asn276Ala. Таким образом, в результате проведенного исследования сайта аллостерической регуляции бета-лактамаз ТЕМ типа показана роль мутаций остатков 276 и 290 на динамику омега-петли. По направлению изучения механизма действия бета-лактамаз с использованием методов ферментативной кинетики и физико-химических методов: Задачей данного этапа исследования являлось изучение влияния единичной аминокислотной замены остатка Мet182 сериновых бета-лактамаз ТЕМ типа на активность и стабильность фермента в рамках исследований влияния широкого полиморфизма бета-лактамаз в формировании механизмов резистентности к антибиотикам грам-отрицательных бактерий. Ферменты данного типа являются наиболее часто мутируемыми среди описанных типов бета-лактамаз. У белков данного типа имеется восемь так называемых «ключевых» мутаций, которые приводят к расширению спектра субстратной специфичности (БЛРС, фенотип 2be) и устойчивости к ингибиторам (клавулановая кислота и др.) (фенотип 2br). Был проведен анализ неключевых - так называемых «сопутствующих» мутаций, роль которых пока не установлена. Показано, что подавляющая часть «сопутствующих» мутаций затрагивает аминокислотные остатки, расположенные на значительном удалении от активного центра фермента, часть из них является поверхностными. Большой интерес представляет анализ роли замены остатка метионина 182 на треонин, которая часто встречается у БЛРС, и, как известно, приводит к значительной стабилизации фермента, молекулярный механизм которой остаётся до конца не выясненным. Для изучения механизмов влияния мутаций бета-лактамаз на стабильность белковой глобулы и ее элементов ранее нами был предложен метод построения сетей внутрибелковых взаимодействий (RINs – Residue Interaction Networks) на основе анализа траекторий молекулярной динамики. При построении сетей RINs для бета-лактамаз с заменой М182Т было выявлено перераспределение внутрибелковых контактов от остатка 182 до остатков омега-петли, расположенной у входа в активный центр. Было выявлено, что остаток R65 может участвовать в изменении сети контактов аминокислотных остатков. В отчетном периоде проведено экспериментальное изучение влияния замен остатка М 182 на стабильность бета-лактамаз ТЕМ типа. Для этого была создана коллекция рекомбинантных бета-лактамаз со всеми возможными заменами этого остатка. В 2023 г. созданы 6 рекомбинантных штаммов E.coli – продуцентов рекомбинатных бета-лактамаз с заменами метионина в положении 182 на лейцин, серин, изолейцин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту; разработана система экспрессии, выделения и очистки, получены и исследованы соответствующие рекомбинантные бета-лактамазы ТЕМ типа. Таким образом, с учётом ранее полученных в лаборатории рекомбинантных ферментов с заменами в 182 положении был получен полный набор из 20 уникальных ферментов. Были оптимизированы условия культивирования бактериальных клеток, получения их периплазматических фракций и дальнейшей очистки гомогенных рекомбинантных бета-лактамаз. Все ферменты были получены в активной и растворимой форме. При одинаковых условиях культивирования, индукции, выделения и очистки периплазматические фракции всех полученных бета-лактамаз характеризовались одинаковым уровнем экспрессии рекомбинантного белка. Измеренные в величины КM и kкат для рекомбинантных форм бета-лактамаз были похожими для мутантных ферментов, содержащих замены в положении 182. Это свидетельствует о том, что замены в 182 положении не оказывает существенного влияния на активность фермента. С использованием физико-химических методов выявлены индивидуальные особенности соответствующих единичных аминокислотных замен на способность ферментов к обратимой инактивации. Показано, что единичные замены в 182 положении имеют разнонаправленное действие. Так единичные замены М182С и М182L приводят к дестабилизации фермента; замена М182A - к стабилизации бета-лактамазы на уровне, соответствующему самому термостабильному из природных бета-лактамаз (ТЕМ-135 с заменой M182T), а ферменты с единичными заменами E182 и I182 были более стабильными по сравнению с бета-лактамазой ТЕМ-135. Определение температур плавления (Тпл0С) методом дифференциально сканирующей флуориметрии также свидетельствует о разнонаправленном действии остатков в 182 положении на процесс денатурации мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа. Самой высокой температурой плавления (Тпл=56,20С) обладает мутант Т182, далее следует S182 (Тпл=53,60С), А182 (Тпл=50,50С) и С182 (Тпл=50,60С). Четыре мутанта Q182, N182, H182, V182 характеризуются схожими с исходным ТЕМ-1 данными (Тпл=48,90С). Остальные замены приводят к значительному снижению Тпл по сравнению с ферментом дикого типа (ТЕМ-1), при этом самой низкой Тпл обладает мутант с заменой L182 (Тпл=41,10С). Проведённое исследование термоинактивации мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа позволило выявить индивидуальные особенности соответствующих единичных аминокислотных замен на способность ферментов к обратимой инактивации. Для объяснения полученных результатов требуется дальнейшее изучение ферментов методами компьютерного моделирования и РСА. По направлению экспериментального изучения бета-лактамаз и создания новых ингибиторов: По данному направлению проведено изучение 103 новых химических соединений в качестве ингибиторов металло-бета-лактамаз (МБЛ). Патогенные бактерии, продуцирующие МБЛ, представляют серьезную угрозу при лечении бактериальных инфекций, поскольку они характеризуются высокой каталитической активностью в отношении разных групп бета-лактамных антибиотиков, кроме монобактамов. В зависимости от гомологии первичной структуры, профиля субстратной специфичности и количества ионов цинка в активном центре МБЛ делятся на три подкласса: B1, B2 и B3. Ферменты подклассов В1 и В3 являются бицинковыми, а подкласса В2 – моноцинковыми. Строение активного центра МБЛ и его окружение демонстрируют высокую вариабельность для разных подклассов, что усложняет поиск новых ингибиторов широкого спектра действия. Наиболее клинически значимые МБЛ относятся к подклассу B1; к ним относятся и МБЛ NDM типа, которые характеризуются наиболее широкой субстратной специфичностью среди всех бета-лактамаз. Поиск ингибиторов МБЛ включает различные подходы: поиск соединений, хелатирующих ионы цинка, и поиск соединений, взаимодействиующих с аминокислотами активного центра. Несмотря на годы интенсивных исследований и более чем 500 потенциальных ингибиторов, описанных в литературе, до сих пор не существует ингибитора МБЛ, одобренного для клинического использования. Разработка эффективных ингибиторов МБЛ осложняется их структурным разнообразием, влияющим на активный центр и возможные мишени. Целью данного этапа исследования являлось изучение производных дипиколиновой кислоты в качестве потенциальных ингибиторов МБЛ NDM-1. Выбор данной группы соединений обусловлен ранее показанными хелатирующими способностями дипиколиновой кислоты в отношении ионов цинка. Химические соединения – производные дипиколиновой кислоты были синтезированы и предоставлены ФГБНУ "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе". Для исследования активности потенциальных ингибиторов в отношении МБЛ была разработана система скрининга с использованием хромогенного и флуоресцентного субстратов. Из набора протестированных химических соединений четыре соединения (LTA-03, LTA-04, LTA-05 и LTA-86) обладают выраженным ингибирующим действием в отношении МБЛ NDM-1, восемь соединений оказывают некоторое ингибирующее действие при концентрации 50 мкМ, однако при разведении в 10 раз (до 5 мкМ) ингибирующий эффект исчезает. Данный эффект связан с хелатирующими свойствами этих соединений, поскольку в буфере, содержащем ионы цинка, ингибирующее действие не проявляется. Для соединений LTA-03, LTA-04, LTA-05 и LTA-86 было определено значение параметра IC50 в реакции гидролиза хромогенного субстрата CENTA, которые составили 0,46, 0,44, 0,29 и 0,76 мкМ, соответственно. Были определены значения констант ингибирования (Ki) МБР NDM-1 в реакции гидролиза флуоресцентного субстрата FC-4, которые составили 30 нМ для соединений LTA-03, LTA-04, LTA-05 и 40 нМ – для LTA-86. По направлению создания новых лекарственных препаратов с улучшенными системами доставки: Для создания новых методов пролонгации действия и увеличения стабильности АБП разработан инновационный дизайн лекарственной формы меропенема с использованием полимерных циклодекстринов. Проведено исследование новых носителей для меропенема на основе трех различных полимеров, представляющих собой гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПЦД), сшитый 1,6-гексаметилендиизоцианатом (ГПЦД-Пол-ГМД), лимонной кислотой (ГПЦД-Пол-ЛК) и ангидридом янтарной кислоты (ГПЦД-Пол-ЯК). Полученные полиэфиры и полиуретановые наночастиц имееют размер 120–200 нм, их структура исследовалась с использованием ЯМР и Фурье-спектроскопии. Порошковой рентгеновской дифракцией показано, что полимеры на основе ГПЦД формируют комплексы с меропенемом (МП), причем доля инкапсулированного МП довольно высока: эффективность включения МП в матрицу полимера ГПЦД-Пол-ГМД составляет около 82%. Полимеры ГПЦД-Пол-ГМД и ГПЦД-Пол-ЯК повышают стабильность МП в его водном растворе во время хранения в 1,4 и 1,2 раза соответственно. Напротив, полимер ГПЦД-Пол-ЛК негативно влияет на стабильность МП. Показано, что полимер ГПЦД-Пол-ГМД является перспективным для пролонгации действия меропенема при лечении инфекционных заболеваний. По направлению изучения механизмов резистентности бактерий к защитным факторам иммунной системы: По данному направлению проводится изучение резистентности бактерий к действию фермента лизоцима иммунных фагоцитирующих клеток Лизоцим является одним из важнейших факторов врожденного иммунитета и присутствует в организме человека в свободном виде в качестве самостоятельного антибактериального агента. Он также входит в состав лизосом иммунных клеток для дезинтеграции бактерии и презентации бактериальных антигенов с последующей регуляцией синтеза антибактериальных антител. Таким образом, активация лизоцима является альтернативным методом преодоления антибиотико-резистентности бактериями. В качестве модельного микроорганизма в работе исследовалась кишечная палочка (Escherichia coli), которая является типичным представителем семейства энтеробактерий. Изучено влияние на активность лизоцима добавок различных комбинаций заряженных аминокислот и глицина. Эффект усиления антибактериальной активности ферментов в присутствии эффекторов сравнивали для человеческого и куриного лизоцима. Было обнаружено, что использование двойных и тройных комбинаций аминокислот может привести к значительно большей активации лизоцима по сравнению с использованием одиночных эффекторов. При одновременном применении активаторов достигнуто увеличение активности лизоцима до 10 раз в присутствии смеси глутамата, гистидина и аргинина (по 5 мМ каждой аминокислоты) для человеческого фермента и в присутствии смеси лизина, гистидина и аргинина (5 мМ каждой аминокислоты) для куриного лизоцима. По направлению создания новых методов диагностики антибиотикорезистентных бактерий и антибактериальных препаратов: Распространенность бактерий, устойчивых к антибиотикам, разнообразие механизмов устойчивости и их сочетание в бактериях с множественной устойчивостью обуславливают необходимость разработки методов мультиплексного анализа для идентификации и характеристики устойчивых к антибиотикам бактерий, которые могут применяться не только в крупных диагностических центрах, но и в клинических микробиологических лабораториях лечебных стационаров. Наиболее высокой мультиплексностью характеризуется технология ДНК-биочипов, идентификация генов и мутаций на которых основана на амплификации необходимого участка нуклеиновой кислоты с одновременным введением метки в ПЦР. Далее проводится аллель-специфичная гибридизация ДНК с зондами, основанная на принципе комплементарности оснований. Новым направлением технологии биочипов стал поиск технологических решений, при которых несколько микрочипов могут объединяться на одном держателе, что позволяет упростить проведение стадий инкубации, отмывки и детекции. В рамках создания новых высокопроизводительных методов мультиплексного молекулярно-генетического скрининга бактерий на наличие генов бета-лактамаз разработана новая методика фотомодификации полистирола для ковалентной ориентированной иммобилизации олигонуклеотидных зондов. С ее использованием разработаны биочипы в лунках 96-луночных планшетов для идентификации 11 типов генов всех клинически значимых бета-лактамаз разных молекулярных классов (3х типов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) и 8 типов карбапенемаз). Биочипы в лунках одновременно позволяют проводить определение 16 ключевых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов бета-лактамаз класса А, необходимых для распознавания фенотипов БЛРС и ингибитор-устойчивых ферментов. Апробация биочипов проведена с использованием 65 образцов ДНК, выделенных из клинических штаммов бактерий с разными фенотипами устойчивости. Показана высокая корреляция с данными секвенирования и ПЦР в режиме реального времени. Принципиальным шагом вперед технологии бичипов в лунках планшетов является возможность количественного анализа нуклеиновых кислот, что было продемонстрировано при определении искусственно полученных транскриптов генов модельных бета-лактамаз. По направлению создания новых методов диагностики антибактериальных препаратов: В рамках разработки экспресс-методов анализа АБП для определения чистоты продуктов питания и образцов воды, как в лаборатории, так и на месте требования, проводится разработка методов иммуноанализа антибиотиков с использованием электрохимической детекции и детекции на основе поляризации флуоресценции. Эти методы подходят для создания современных методов контроля АБП в различных лабораториях и во вне-лабораторных условиях, поскольку доступны небольшие портативные приборы для регистрации сигнала. Разработан электрохимический иммуносенсор на основе печатных графитовых электродов для определения антибиотика хлорамфеникола в воде и образцах молока. Показано, что иммобилизация специфичных к хлорамфениколу антител в жидкокристаллическом слое мембраноподобного дидодецил-диметиламмоний бромида позволяет сохранить подвижность и доступность активных центров антител, добавление наночастиц золота улучшает перенос электронов с поверхности электрода на окислительно-восстановительные центры пероксидазы хрена, используемой в качестве метки. Предел обнаружения хлорамфеникола в воде составил 0.02 мкг/л, в молоке - 0.04 мкг/л. Получены и охарактеризованы флуоресцентно-меченные конъюгаты хлорамфеникола (трейсеры), состоящие из трех частей: низкомолекулярного гаптена, флуоресцентной метки и спейсера между ними. Поскольку длина спейсера влияет на чувствительность анализа, изучены конъюгаты с различной длиной спейсера, изучена кинетика их связывания с антителами с конъюгатами. Показано, что использование трейсера с линкером С5 позволяет снизить предел обнаружения антибиотика до 5 нг/мл. Разработана методика определения хлорамфеникола в воде, она апробирована с использованием реальных образцов воды, содержащих хлорамфеникол. | ||
| 2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентности |
| Результаты этапа: | ||
| 3 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентности |
| Результаты этапа: | ||
| 4 | 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. | Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентности |
| Результаты этапа: | ||
| 5 | 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. | Изучение резистентности бактерий к антибиотикам на основе получения рекомбинантных бета-лактамаз, определения их структуры и взаимодействия с субстратами и ингибиторами методами математического моделирования и ферментативной кинетики, разработки антибактериальных соединений и новых лекарственных форм, методов молекулярной диагностики антибиотикорезистентности бактерий и определения антибиотиков в объектах окружающей среды и продуктах питания для создания новых подходов эффективного преодоления резистентности |
| Результаты этапа: | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".