ИСТИНА

Целью проекта является разработка набора методик, позволяющих увеличить эффективность проведения современных электронно-микроскопических исследований за счет сочетания недеструктивных методик мечения исследуемых структур в живых клетках, корреляционной световой и электронной микроскопии и криоэлектронной микроскопии, в том числе – криогенной электронно-микроскопической томографии. Для отработки методик выбраны два типа объектов: 1) индивидуальные генные локусы в контроле и в условиях дисфункции архитектурных белков хроматина, что моделирует такие наследственные заболевания, как сидром Корнелии-де Ланге, и 2) амилоидные структуры, формируемые в клетках прионным белком и альфа-синуклеином, образование которых является причиной нескольких нейродегенеративных расстройств.

The control of the processes of individual development and cell differentiation is realized through the interaction of several mechanisms, one of which is the epigenetic regulation. Regulation at the level of the spatial organization of chromatin is an important but insufficiently studied element of the epigenetic control. Difficulties encountered in the study of the chromatin are related both to the dynamic nature of the chromatin structure and to its sensitivity to external factors. These features limit the efficiency of the molecular analysis methods and puts forward the requirements for verification of experimental results of in vitro methods by the microscopic analysis. However, the structural and functional heterogeneity of genetic material requires the development of non-destructive methods for the detection of individual gene loci. This problem was generally solved by introducing CRISPR / Cas technology, however, to analyze the details of the spatial organization of DNA in chromatin domains, a higher resolution provided by electron microscopy is required. In this project, we plan to develop new unique technologies for the analysis of the three-dimensional structure of individual chromosomal loci by combining in vivo labeling using the CRISPR / Cas system and correlation fluorescence microscopy and cryo-electron tomography. These technologies will be further applied to study the structural rearrangements of chromatin upon changes in its functional state and modulation of architectural chromatin proteins activity. The certain elements of the developed approach will also be adapted for the study of the structure of fibrils that form in the cytoplasm of the cells during the pathological transformation of amyloidogenic proteins, which cause various neurodegenerative disorders.In particular, amyloid structures that are formed in vivo when alpha-synuclein is expressed in neuroblastoma cells will be investigated. The resulting structure will be compared with the structures that are formed in vitro by recombinant alpha-synuclein produced by bacterial cells, both during its spontaneous transformation and with the participation of various chaperonins (double-ring and single-ring) in this process in the presence and in the absence of ATP. Using cryo-electron microscopy and small-angle X-ray scattering, investigations will be continued to study the structure of chaperonins encoded by bacterial viruses (bacteriophages). One of the main tasks is to solve the structure of complexes of phage chaperonins with substrate proteins, which will be used as monomers/oligomers of amyloidogenic proteins (alpha-synuclein, prion protein), since this is of interest for understanding the mechanism of functioning of this new group of chaperonins, previously discovered by us.

В результате выполнения проекта будет разработана уникальная методика анализа трехмерной организации целевых генных локусов в нативном состоянии. Данная методика будет использована для выяснения принципов пространственной организации генома с высоким разрешением и исследования роли регуляторных и архитектурных компонентов хроматина в его формировании и поддержании в норме и патологии. В частности, полученные результаты послужат основой для понимания молекулярных основ развития когезинопатий и других патологий, основу которых составляют нарушения структурно-функциональной организации хроматина. Будут оценены возможности применения разработанного подхода для изучения структуры различных патологических трансформаций амилоидогенных белков, являющихся причиной ряда нейродегенеративных заболеваний. Будет изучено влияние разных шаперонинов, включая фаговые, на процесс фибриллизации альфа-синуклеина и прионного белка, что представляет еще и практический интерес в плане поиска новых лекарственных средств, обладающих нейропротекторными свойствами, для лечения разного рода синуклеинопатий и прионных инфекций. Определение структуры комплексов фаговых шаперонинов с мономерами/олигомерами амилоидогенных белков позволит приблизиться к пониманию механизма функционирования этой еще малоизученной группы шаперонинов.

Недеструктивное мечение будет осуществляться при помощи CRISPR/dCas с использованием dCas-GFP с тэгами для присоединения наночастиц золота и РНК-гида со шпильками в комбинации с экспрессией в клетках вирусных РНК-связывающих белков с флуоресцентной меткой. Для детекции целевых локусов при помощи электронной микроскопии будут использованы конъюгаты наночастиц золота с Ni-NTA. Предварительные эксперименты на клеточных линиях с повторами LacO и экспрессией Lac-репрессора-GFP-6His показали высокую эффективность мечения (Zhironkina et al. 2015; Deng et al. 2016). Проведены эксперименты по адаптации метода на основе «клик-реакции» для выявления реплицированной ДНК с использованием электронно-микроскопической томографии (Sosnovskaya et al. 2022). Введение меток в живые клетки предполагается осуществлять методами in vivo-мечения микроинъекцией (Kireev et al. 2008, Hu et al, 2009), scrap-loading и стрептолизинопосредованная интернализация (Teng et al. 2016; Xiang et al. 2018). Замораживание образцов будет осуществляться при помощи plunge-freezing, а утоньшение ламелей для крио-ТЭМ-томографии - методом крио-ионного травления, отработанного членами научного коллектива. С помощью криоэлектронной микроскопии будут продолжены ранее начатые нами исследования по определению структуры фаговых шаперонинов. Для успешного выполнения проекта имеются необходимые экспрессионные конструкции для наработки рекомбинантных белков в бактериальных и эукариотических штаммах; отработаны методики их очистки до гомогенного состояния, а также проведено исследование очищенных белков различными физико-химическими методами. Установлено, что шаперонины способны препятствовать фибриллизации альфа-синуклеина в отсутствие АТФ и стимулировать образование фибрилл в присутствии АТФ. Была определена структура шаперонинов ОВР и AR9 с разрешением 4,3 Å и 4,5 Å, для ОВР были установлены структуры комплексов с АТФ-гамма S и АДФ с разрешением 5 Å и 6 Å [Stanishneva-Konovalova et al. 2020; Sokolova et al. 2022].