ИСТИНА

В растениях рост и морфогенез зависит от межклеточного движения молекул через плазмодесмы, специфические межклеточные цитоплазматические мостики. Плазмодесмы обладают сложной структурой, препятствующей в зрелом листе свободному движению белковых молекул размером более 1 кДа. Однако в определенных условиях, например, в точках роста растения или при стрессовых воздействиях межклеточное сообщение обеспечивается довольно крупными (более 50 кДа) специфическими транскрипционными факторами, способными увеличивать пропускную способность плазмодесм. В этом случае перемещение из клетки, в которой синтезировался транскрипционный фактор, в соседнюю клетку, где он и будет осуществлять свое действие, проходит через этап «открытия» плазмодесм. Такие белковые молекулы получили в английской литературе название non-cell autonomous protein (NCAP, или буквально, «белки, самостоятельные за пределами клетки»). К этой категории белков относятся и транспортные белки вирусов растений. Показано, что во внутриклеточном движении NCAP важную роль играет эндоплазматический ретикулум, а также обнаружена связь с процессом эндоцитоза. Кроме того, предполагается, что NCAP перемещаются через плазмодесмы при взаимодействии со специфическим белком – рецептором NCAP. Такой белок идентифицирован недавно в табаке и получил название non-cell autonomous pathway protein (NCAPP). Мы в своих исследованиях обнаружили, что такой стрессовый фактор как генерируемый растением метанол вызывает открытие плазмодесм соседнего растения и индуцирует активность генов (метанол-индуцируемых генов, МИГов) Nicotiana benthamiana, среди которых ген NCAPP, ингибитора пектинметилэстеразы (PMEi) и ранее неизвестный ген МИГ-21 (MIG-21). Цель данной работы – исследование роли метанол-индуцируемых генов в межклеточном транспорте растений.

В ходе выполнения работы по проекту изучен механизм межклеточного транспорта и репродукции вируса табачной мозаики (ВТМ) в условиях повышенной активности таких метанол-индуцируемых генов (МИГов) как NCAPP (non-cell autonomous pathway protein), BG (бета-1,3-глюканаза) и ранее неидентифицированного гена МИГ-21. Обработка растения газообразным метанолом или агроинъекция в лист векторов, кодирующих BG, NCAPP или МИГ-21, вызывает «открытие» плазмодесм и свободное перемещение из клетки в клетку высокомолекулярного белка. Метанол и МИГи контролируют иммунитет растения. Показано: (а) растение, предварительно инкубированное в присутствии физиологического метанола, приобретает чувствительность к ВТМ; (б) обратный результат наблюдается при инфицировании этих растений бактериальным патогеном, Ralstonia solanacearum: растения, обработанные метанолом, приобретают устойчивость к бактериям; (в) разработана модель участия метанола в качестве сигнальной молекулы, контролирующей иммунитет растения. Изучена структура транскрипционного промотора NCAPPPr Nicotiana benthamiana. Используя прием «шагание по хромосоме», идентифицированы и выделены два перекрывающих участка ДНК длиной 1000 и 1500 пар нуклеотидов, предшествующих гену NCAPP. Проведен анализ этой последовательности и определены элементы промотора NCAPPPr. Промотор NCAPPPr способен контролировать синтез GUS в созданных нами трансгенных растениях N.benthamiana. Показана повышенная экспрессия гена GUS после выдерживания растений в атмосфере с повышенным содержанием газообразного метанола. Для идентификации молекулярных партнеров белка NCAPP разработан метод ко-иммунопреципитации при использовании FLAG-последовательности, слитой с белком NCAPP. При изучении роли метанола в функционировании плазмодесм мы обнаружили в sink-листьях табака повышенный уровень мРНК пектинметилэстеразы (ПМЭ) и увеличенную концентрацию метанола в соке. С помощью метода супрессионной вычитающей гибридизации мы идентифицировали ряд генов, активность которых изменяется при переходе от sink- к source-листьям. Среди них оказались гены, чувствительные к метанолу. Идентифицированные нами гены участвуют в транспорте метаболитов в растении и передаче сигнала. Два гена, sugar transporter (ST) и sieve element occlusion protein (SEOP), непосредственно связаны с транспортом углеводов в растении, а auxin-repressed protein (ARP), elicitor responsible protein (ERP) и salicylic acid binding catalase (SABC) участвуют в росте растения и передаче сигнала в растительной клетке. Важно, что среди идентифицированных генов, по крайней мере, три (SEOP, ARP и SABC) оказались чувствительны к метанолу. Механизм действия метанола на транскрипционную активность генов, участвующих в sink-source переходе, неясен, но, по-видимому, зависит от концентрации метанола в конкретной клеточной микросреде во время процесса модификации клеточной стенки и роста клеток. На основании полученных результатов мы выдвинули предположение о возможном участии метанола в росте и развитии листьев растений.