Структура и динамические свойства метилтрансферазы WBSCR27, ассоциированной с синдромом ВильямсаНИР

Solution structure and dynamics of a Williams syndrome related methyltransferase WBSCR27

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 27 марта 2017 г.-26 декабря 2017 г. Структура и динамические свойства метилтрансферазы WBSCR27, ассоциированной с синдромом Вильямса (этап 1)
Результаты этапа: 1. Оптимизация генно-инженерной конструкции для получения максимально чистых образцов белка WBSCR27, пригодный для исследования их методами ЯМР. Проведена оптимизация генно-инженерной конструкции для получения максимально чистых образцов белка WBSCR27, необходимых для проведения экспериментов ЯМР. Получен вектор, кодирующий 6 остатков гистидина для очистки белка на Ni-NTA агарозе, S-таг, улучшающий растворимость слитых с ним белков, а также сайт узнавания TEV-протеазы, позволяющей удалять таги после выделения белка. Добавление S-тага к конструкции позволило повысить растворимость белка и увеличить выход получаемого образца. Это дает возможность использовать меньше исходных реагентов (включая изотопно-меченые соединения) для получения необходимых количеств образца. Добавление сайта протеолитического расщепления позволило получать образцы, максимально близкие по составу к природному белку. В дополнение к аминокислотной последовательности белка в получаемых образцах остается всего две аминокислоты с N-конца — Glu-Ala, влияние которых на структуру незначительно. 2. Получение образцов белка WBSCR27 обогшащенного стабильными изотопами 13С и 15N. Получено две серии образцов белка WBSCR27, обогащенных стабильными изотопами: 15N-WBSCR27 и 13C,15N-WBSCR27. Образцы переведены в натрий-фосфатный буфер (50 мМ, рН=7), содержащий 50 mM хлорида натрия, 0.02% азида натрия и 10 mM дитиотреитола. Дитиотреитол является важным компонентом поддержания целостности белка (см. ниже), ввиду наличия восьми остатков цистеина. Образцы 13C,15N-WBSCR27 и часть образцов 15N-WBSCR27 переданы в начале 2017 года коллегам из Центра высокопольного ЯМР академии наук Тайваня (Academia Sinica) для регистрации спектров 13C-1H HSQC-NOESY, 15N-1H HSQC-NOESY и HCCH-TOCSY на спектрометре Bruker AVANCE 850 МГц, необходимых для отнесения боковых цепей аминокислотных остатков и получения пространственных ограничений для будущего расчета структуры белка. Оставшаяся часть образцов 15N-WBSCR27 оставлена для проведения экспериментов на спектрометре ЯМР Bruker AVANCE 600 МГц, имеющемся в распоряжении участников проекта. 3. Анализ спектров ЯМР с целью определения отнесения основной белковой цепи WBSCR27. Определение на основе полученной информации вторичной структуры белка. Проведен анализ спектров, зарегистрированных ранее Тайваньскими коллегами на высокопольном спектрометре Bruker AVANCE 850 МГц. В ходе анализа спектров выяснилось одно обстоятельство, чрезвычайно затрудняющее дальнейшую работу со спектрами: было обнаружено, что одинаковые эксперименты, проведенные на одном и том же образце белка в разное время с момента растворения образца, дают существенно различающиеся спектры. Детальный анализ серии спектров 15N-1H HSQC, регистрируемых для контроля перед измерением каждого 3D эксперимента, позволил прийти к заключению, что всего существует два частично пересекающихся набора сигналов, один из которых медленно исчезает, а другой накапливается (см. рис. 1). Изменения в спектрах ЯМР свидетельствует об изменениях, происходящих с течением времени в структуре белка. Исчезновение одной группы сигналов и нарастание другой говорит о медленном переходе белка из одной формы в другую. Определение структуры белка, образец которого изменяется в процессе регистрации спектра, крайне затруднительно, поэтому прежде, чем переходить к анализу спектров и выполнению отнесения нам потребовалось выяснить, что вызывает наблюдаемые изменения в спектрах ЯМР и каким образом можно стабилизировать одну форму белка на время, необходимое для регистрации длительных 3D экспериментов ЯМР. С целью выяснения причины изменчивости структуры белка проведен ряд экспериментов на 15N-меченных образцах белка на приборе Bruker AVANCE 600 MHz. Состояние структуры белка контролировалось по спектрам 15N-1H HSQC. Были проверены две гипотезы о природе структурного разнообразия WBSCR27. Гипотеза 1. Превращение белка из одной формы в другую обусловлено образованием или разрывом одной или нескольких дисульфидных связей. В этом случае поведение белка должно меняться при изменении концентрации дитиотреитола (DTT). Увеличение концентрации DTT в растворе должно ускорять процесс разрыва дисульфидных связей, а его отсутствие может приводить к их стабилизации. Для проверки этой гипотезы проведена серия экспериментов с различным содержанием DTT в буферном растворе (от 1 mM до 20 mM) и контролем состояния белка методами гетероядерной спектроскопии ЯМР. Выяснилось, что скорость перехода белка из одной формы в другую не зависит от концентрации DTT. Вместе с тем, было установлено, что в отсутствие DTT белок начинает быстро агрегировать. В этом случае наблюдалось быстрое снижение количества сигналов в спектрах 15N-1H HSQC, вплоть до практически полного их исчезновения спустя 14 часов (см. рис. 2.). Таким образом, было показано, что изменения структуры белка, отражающиеся в спектрах 15N-1H HSQC, не связаны с образованием дисульфидных связей. Кроме того, на основании полученных резкльтатов все последующие эксперименты ЯМР с белком проводили в буфере, приготовленном на дегазированной воде (с целью удаления растворенного кислорода) и в присутствии большого избытка DTT. Гипотеза 2. Белок выделяется из клеток в виде комплекса с кофактором (S-аденозилметионин, SAM) или продуктом превращения SAM (S-аденозилгомоцистеин, SAH), причем связывание белка с кофакторами оказывается настолько прочным, что данные лиганды не отщепляется в процессе очистки белка, включающем, в частности, стадии диализа. В этом случае, с течением времени комплекс может разрушаться, высвобождая апо-форму белка. Добавление SAM или SAH к апо-форме белка должно возвращать его в исходную форму комплекса. Эта гипотеза подтвердилась. Во-первых, в спектрах ЯМР образов белка (в том числе в спектрах 13C-1H HSQC) обнаружены резонансы, соответствующие SAM и SAH (например, характеристичные резонансы CH-1’ рибозного кольца и резонансы CH-2 и CH-8 аденинового остатка). Эти кофакторы, обогащенные стабильными изотопами 13C и 15N, образовались в ходе экспрессии белка в бактериальных клетках. Они сохранились в ходе всех операций по выделению и очистке белка. Во-вторых, удалось перевести одну форму белка в другую путем термостатирования его в течении 4 суток при 35°С. Состояние белка контролировали по спектрам 15N-1H HSQC. Далее к одному образу образовавшегося белка добавили SAM, к другому SAH. В обоих случаях результат оказался практически одинаковым. Белок сразу же перешел в исходную форму. В обоих случаях спектры 15N-1H HSQC оказались практически идентичны со спектрами исходного образца (рис. 3). Таким образом, было установлено, что белок из клеток выделяется в виде комплекса. Прочность комплекса настолько велика, что образования апо-формы не наблюдается даже после диализа образца в течение 3 суток при 5°С. Общая схема наблюдаемых изменений строения белка показана на рис. 4. В ходе экспериментов по мониторингу его взаимодействия с SAH выяснилось, что при выдерживании каталитических количеств белка WBSCR27 с избытком SAH в течение нескольких дней при 35°С от молекулы SAH медленно отщепляется аденин (рис. 4). Вместе с тем, сама по себе молекула SAH очень устойчива и может сохраняться в водном растворе при 35°С и рН=7 в течение нескольких месяцев (см. рис. 5). Таким образом, было установлено, что белок WBSCR27 обладает тионуклеозидазной активностью. Отщепление аденозина и определяет постепенный переход от комплекса к апо-форме белка. Следует отметить, что на данный момент ферменты, обладающие этим видом активности, найдены только у прокариот (Parveen & Cornell, 2011), где они регулируют внутриклеточную концентрацию SAH. В эукариотах регуляция концентрации SAH идет по принципиально иному пути, при котором от молекулы SAH для действии SAH-гидролаз отщепляется аденозин (Malanovic et al., 2008). Это различие используется для создания антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность бактерий путем ингибирования тионуклеозидаз (Tang et al., 2017). В этом случае в бактериальной клетке возникает нарушение баланса SAH\SAM, что приводит к разбалансировке регуляции процессов метилирования. После установления причины изменчивости спектров ЯМР белка WBSCR27 было принято решение стабилизировать кофактор-связывающую холо-форму белка, путем добавления в образец 10-кратного молярного избытка SAM перед проведением экспериментов ЯМР. Отнесение сигналов белка выполнено на серии гетероядерных 3D экспериментов (HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)HN, HNCO, HN(CA)CO, HNHAHB и HBHA(CO)HN), измеренных при 850 МГц на холо-форме белка тайваньскими коллегами. Анализ указанных 3D спектров позволил выполнить отнесение для ХХ% атомов основной цепи белка (Cα, Hα, C’, N, HN), а также сигналов Cβ и Hβ (см. рис. 7). Полученные данные о химических сдвигах 1H, 13C и 15N атомов белковой цепи использованы для определения динамических свойств белка и его вторичной структуры. Так, на рис. 8 показаны значения параметров порядка S2, характеризующие амплитуду внутренних движений белковой цепи, элементы вторичной структуры белка. Интересно отметить, что полученная нами информация о вторичной структуре WBSCR27, удовлетворяет укладке Россмана. Белок WBSCR27 состоит их 7 бета-листов, чередующихся с альфа-спиралями. (рис. 9). Такая укладка характерна для нуклеотид-связывающих белков, причем большинство известных метилтрансфераз РНК (43 из 57 известных на 2015 год) имеют именно такую укладку (Schapira, 2015). 4. Отнесение сигналов боковых цепей аминокислотных остатков белка WBSCR27. Анализ 3D спектров HNCACB, CBCA(CO)HN, HNHAHB, HBHA(CO)HN, 15N-1H HSQC-TOCSY, HCCH-TOCSY, HNHA, HNHB, а также спектров 15N-1H HSQC-NOESY и 13C-1H HSQC-NOESY позволил выполнить отнесение большинства сигналов боковых цепей аминокислотных остатков белка WBSCR27 в форме, связывающей ко-фактор. Этот этап работы потребовал наибольшего времени для выполнения. Но именно он определяет перспективу дальнейшего развития исследований, в частности, расчета структуры белка.
2 15 января 2018 г.-28 декабря 2018 г. Структура и динамические свойства метилтрансферазы WBSCR27, ассоциированной с синдромом Вильямса (этап 2)
Результаты этапа: Целью проекта является определение структуры и изучение динамических свойств метилтрансферазы WBSCR27 (27 кДа, 240 а.о.), ассоциированной с тяжелым генетическим расстройством — синдромом Вильямса. Для этого белка ранее отсутствовала структурная информация, не были исследованы его функциональные свойства. До настоящего времени не установлены мишени его действия в организме. В ходе исследований, проведенных в отчетный период было установлено, что белок при его получении генно-инженерными методами выделяется в виде комплекса с ко-факторами — аденозил-L-метионином (SAM) и продуктом метилтрансферазной реакции S-аденозил-L-гомоцистеином (SAH) в соотношении SAM к SAH 1:2,7. Был разработан способ количественно переводить белок из комплексов с указанными ко-факторами в апо-форму. Это позволило получить образцы апо-формы белка, обогащенные стабильными изотопами 13С и 15N и записать серию гетероядерных 3D экспериментов ЯМР на этих образцах. На основе анализа полученных спектральных данных было выполнено отнесение сигналов аминокислотных остатков апо-формы WBSCR27, которые были депонированы в BioMagResBank. Ранее для белка WBSCR27 была обнаружена тионуклеозидазная активность, т.е. способность отщеплять остаток аденина от молекулы SAH. В отчётный период эти каталитические свойства были исследованы более детально. Установлено, что WBSCR27 катализирует реакцию отщепления аденина не только от SAH, но и от других аналогов этого тионуклеозида — метилтиоаденозина (MTA) и 5'-дезоксиаденозина (5'dAdo). Этим WBSCR27 проявляет себя как трёх-субстратный фермент, что делает этот эукариотический белок похожим на бактериальные тионуклеозидазы. Установлено также, что катализируемая WBSCR27 реакция протекает очень медленно (в шкале времени нескольких суток). Методами ЯМР исследовано взаимодействие WBSCR27 с SAM, SAH и их аналогами (MTA, 5'dAdo, аденин). Установлен характер взаимодействия белок-лиганд, определены аминокислотные остатки белка, участвующие в связывании лигандов. Методом изотермической калориметрии титрования измерены термодинамические параметры взаимодействия белка с SAM и SAH. В отчётный период проведены работы по определению пространственного строения комплекса WBSCR27 с SAM. Получены структуры ЯМР этого комплекса в растворе, которые будут на следующем этапе исследования уточняться для получения семейства структур ЯМР высокого разрешения. За отчетный период в журнале Biomolecular NMR Assignments опубликована статья об отнесении сигналов аминокислотных остатков комплекса WBSCR27-SAM. Готовится к публикации статья о найденных каталитических свойствах WBSCR27. По материалам проведенных исследований участниками проекта сделано 5 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.
3 9 января 2019 г.-27 декабря 2019 г. Структура и динамические свойства метилтрансферазы WBSCR27, ассоциированной с синдромом Вильямса (этап 3)
Результаты этапа: К моменту начала работ по проекту для белка WBSCR27 была известна аминокислотная последовательность, разработана генно-инженерная конструкция для получения белка в клетках E.coli, обогащенного стабильными изотопами 15N и 13С, а также были проведены пробные гетероядерные эксперименты ЯМР. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности белка позволяет отнести его отнести к SAM-зависимой метилтрансферазе первого класса (рис. 1, см. приложение к отчету Figures_2019.pdf). Первые спектры, которые были измерены для 15N-меченого WBSCR27 показали, что они не воспроизводятся от образца к образцу и содержат гораздо больше резонансов, чем можно было ожидать для белка, содержащего 240 аминокислотных остатков (рис. 2). Добавление к раствору белка избытка ко-фактора (аденозил-L-метионина, SAM) или ко-продукта метилтрансферазной реакции S-аденозил-L-гомоцистеина (SAH) приводит к упрощению спектра и исчезновению дублированных сигналов. Присутствие 10 мМ SAM в 0.4–0.6 мМ растворе WBSCR27 обеспечило спектры ЯМР комплекса белка с ко-фактором, воспроизводимые в течение нескольких дней. Это позволило измерить для них серию гетероядерных 3D экспериментов ЯМР (см. детали в разделе «Методы и подходы») и выполнить полное отнесение сигналов 1H, 13C и 15N для комплекса WBSCR27-SAM (рис. 3, Mariasina et al., 2018). Химические сдвиги депонированы в BioMagResBank (код депонирования BMRB-27417). Очевидно, что белок, полученный после очистки, может существовать в виде смеси апо-формы и комплексов WBSCR27 с SAM и/или SAH. Методом ЯМР было установлено, что WBSCR27 после экспрессии и очистки выделяется в виде смеси комплексов с соотношением SAM:SAH = 1:2.7 (рис. 4). Сигналы связанных форм SAM и SAH можно наблюдать и в спектрах HSQC 13С-1H белка, выделенного из клеточной массы, выросшей на обогащенной изотопом 13С среде. Поскольку соотношение связанных с белком SAH и SAM определяли после разворачивания белка в растворе DCl, были проведены эксперименты по возможности рефолдинга WBSCR27. Установлено, что белок, после его разворачивания в 8 М мочевине, успешно сворачивается обратно при удалении мочевины в процессе диализа. Спектры 15N–1H HSQC комплекса белка с SAH до и после рефолдинга были идентичны. Добавление дополнительной стадии диализа против 8М раствора мочевины, во время которой удаляется SAH, позволило получить апо-форму белка в количествах, достаточных для последующего измерения спектров ЯМР. На полученных образцах апо-формы WBSCR27 были измерены гетероядерные 3D эксперименты ЯМР и сделано полное отнесение сигналов белка (рис. 5). Химические сдвиги апо-WBSCR27депонированы в BioMagResBank (BMRB-27578). Значения химических сдвигов 1Hα, 13Cα, 13Cβ, 13C’ и 15N были использованы для определения вторичной структуры апо-формы WBSCR27 и его комплекса с кофактором, а также для идентификации подвижных областей белкового остова с помощью программы TALOS + (Shen et al., 2009). Ядро апо-формы белка (α/β/α «сэндвич» с топологией β6↑β7↓β5↑β4↑β1↑β2↑β3↑) идентично ядру белка в комплексе WBSCR27 с кофактором. Оно содержит семь β-тяжей, чередующихся с шестью α-спиралями. Но в отличие от комплекса с кофактором, где N-концевая область структурирована и содержит три α-спирали, апо-форма WBSCR27 имеет длинный неструктурированный N-концевой хвост до 50-го аминокислотного остатка (рис. 6). Две α-спирали (α1 и α2), хорошо сформированные в комплексе, полностью отсутствуют в апо-форме, а спирали α3 и α4 оказываются значительно более короткими. Протокол получения в препаративных количествах апо-формы WBSCR27, в том числе белка, обогащенного стабильными изотопами 15N и 13C, открыл возможность изучения его взаимодействия с SAH, SAM и его аналогами и/или фрагментами этих соединений. Были проведены эксперименты по ЯМР-титрованию белка WBSCR27 продуктами биотрансформации SAM - метилтиоаденозином (MTA), 5'-дезоксиаденозином (5'dAdo) и аденином (см. рис. 7). Проведенные эксперименты позволили определить отнесение сигналов амидных групп основной белковой цепи WBSCR27 для каждого из комплексов и определить прочность связывания лигандов. На рис. 8 для каждого из исследованных комплексов WBSCR27 приведены изменения химических сдвигов сигналов 1H и 15N амидных групп относительно апо-формы белка. Из изменения химических сдвигов видно, что SAM и SAH связываются с WBSCR27 в кармане, расположенном на вершине цепей β1, β2 и β4. Большинство сигналов аминокислотных остатков, расположенных в этом кармане, также изменяются при замене SAM на SAH. Эти фрагменты являются наиболее консервативными в первичной структуре МТаз класса I (рис. 9). Прочность связывания SAM, SAH, MTA, 5'dAdo и аденина с WBSCR27 была исследована методами ЯМР и изотермической калориметрии титрования. Связывание SAM и SAH с белком является прочным и происходит в медленном пределе обмена (в шкале времени ЯМР): в спектрах ЯМР имеется два набора сигналов, которые принадлежат как апо-форме белка, так и соответствующему комплексу. Связывание MTA, 5'dAdo и аденина с WBSCR27 намного слабее, чем связывание SAH или SAM и протекает в условиях быстрого обмена между свободной и связанной формами. Из экспериментов по ЯМР титрованию удалось вычислить величины Kd, которые составляли 40 ± 10 мкМ для МТА и 100 ± 60 мкМ для 5'Ado при 35°С. Метод ИКТ был использован для получения термодинамических характеристик взаимодействия WBSCR27 с SAM и SAH (рис. 10). Эксперименты ИКТ были выполнены сотрудниками ИМБ РАН В.А. Митькевичем и О.И. Кечко в рамках совместной работы. Стехиометрия связывания для обоих лигандов составляла 1: 1. Связывание SAM и SAH с WBSCR27 изучали при трех различных температурах, 15, 25 и 37°C, и результаты суммированы в таблицах 1 и 2. Сродство WBSCR27 для SAM уменьшилось в восемь раз, когда температура увеличилась с 15° C (Kd = 0.4 мкМ) до 37° C (Kd = 2.9 мкМ). Значение Kd для связывания SAH с WBSCR27 увеличилось в 20 раз с 0.08 мкМ (15° С) до 1.61 мкМ (37° С). Построив зависимость энтальпии связывания от температуры, мы получили значения изменения теплоемкости (ΔCp) для взаимодействия WBSCR27 с SAM и SAH (таблица 2). Связывание SAM и SAH с WBSCR27 характеризуется большими величинами ΔCp, равными -530 и -660 кал•моль-1К-1, соответственно. Считается, что изменение теплоемкости соответствует изменению площади, доступной для растворителя (SAA), в ходе связывания лиганда. Это говорит о значительной компактизации молекулы белка при образовании комплекса с SAM и SAH. Интересно отметить, что SAH, побочный продукт реакции метилирования, связывается с белком с заметно более высокой аффинностью, чем кофактор, SAM. Методом ЯМР была исследована стабильность SAM и SAH в свободном состоянии и в виде комплексов с WBSCR27. Установлено, что SAH в свободном состоянии стабилен в течение месяцев: не наблюдалось образования продуктов деградации этого соединения даже после 70 суток нагревания при 35°С в водных растворах. SAM менее устойчив в свободном состоянии. Он подвергается почти полному превращению в МТА плюс гомосерин-лактон и S-рибозил-L-метионин плюс аденин за 122 часа при 35°С (рис. 11). Каталитические количества WBSCR27 не влияют на скорость этой конверсии. Наиболее интересными оказались данные о стабильности SAM и SAH в виде комплексов с WBSCR27. Установлено, что SAM, связанный с WBSCR27, претерпевает быструю трансформацию в SAH, что отслеживалось в серии спектров 15N-1H HSQC (рис. 12). Время поупревращения SAM в SAH в белке составляет 3.5 ± 0.5 ч при 35°С. Но SAH в составе комплекса с белком также не является устойчивым. В этом случае наблюдается отщепление остатка аденина от SAH с образованием S-рибозил-L-гомоцистеина. Для почти полной конверсии молекулы SAH (~ 90%) при температуре 35°С требуется около 17 суток. Установлено также, что не только SAH, но и MTA и 5'dAdo подвергаются каталитическому отщеплению остатка аденина (рис. 13). Накопление аденина и уменьшение количества SAH, MTA и 5’Ado наблюдалось в спектрах ЯМР 1H растворов этих лигандов после добавления WBSCR27 (рис. 14). Измеренная методом ЯМР константа скорости реакции для 5'Ado составляла менее 8×10-7 с-1. Константы Михаэлиса не могли быть надежно определены по кривым изменения интенсивности ЯМР. Аналогичный эксперимент был также проведен с аденозином; однако установлено, что WBSCR27 не расщепляет его. Отщепление аденина приводит к образованию продуктов, которые связываются с белком гораздо слабее, чем SAH, что позволяет отделить их от белка путем диализа. Это еще один способ получения апо-формы белка. Таким образом, нами была обнаружена нуклеозидазная активность у WBSCR27. Скорость этой реакции низкая, но в отсутствие фермента она не протекает. Интересно отметить, что скорость расщепления аденина увеличивается в ряду SAH, MTA и 5'dAdo. В то же время, удаление аденина из аденозина не происходит, хотя это соединение отличается от 5'Ado только наличием одной гидроксильной группы в положении 5 '. Этот факт дополнительно подтверждает ферментативный характер этой реакции. Гидролитическое удаление аденинового основания из SAH катализируется бактериальными ферментами MTA/SAH нуклеозидазами (Cornell et al., 1996). Эти ферменты участвуют в катаболизме SAH и MTA и регуляции внутриклеточного метилирования. Однако пути катаболизма SAH у эукариот и прокариот значительно различаются, и у высших организмов отсутствуют аннотированные ферменты, способные гидролизовать SAH до аденина и рибозилгомоцистеина. В эукариотах SAH разлагается на аденозин и гомоцистеин под действием SAH-гидролазы (de la Haba & Cantoni, 1959). Все прокариотические нуклеозидазы SAH являются трех-субстратными ферментами, катализирующими удаление аденина не только из SAH, но также из двух других продуктов цикла SAM - MTA и 5'dAdo. Это делает WBSCR27 сходным с бактериальными ферментами, хотя нуклеозидазная активность WBSCR27 значительно ниже по сравнению с бактериальными MTA/SAH нуклеотидазами. Однако для этого типа каталитической активности мы не смогли найти аналогов WBSCR27 среди эукариотических ферментов. Для апо-формы WBSCR27 и для комплекса WBSCR27-SAH проанализированы результаты экспериментов ЯМР с целью получения параметров, необходимых для расчета структуры в растворе. Были проанализированы спектры 13C-1H HSQC-NOESY, 15N-1H HSQC-NOESY, спектры IPAP, измеренные в анизотропных средах, из которых получены величины остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия (см. раздел «Методы и подходы»), эксперименты по обмену амидных протонов на дейтерий. Эти экспериментальные данные использованы для расчета структуры апо-формы белка и комплекса WBSCR27-SAH (рис. 15-17). Анализ структуры белка и сопоставление с известными структурными данными для МТаз (рис. 9) позволяет сделать вывод о том, что центр узнавания субстрата метилирования формируется N-концевыми спиралями α1 – α3 и петлей 67. При этом, связывание SAH (или SAM) индуцирует структурирование α-спиралей, подготавливая белок к узнаванию субстрата. Петля 67 при этом остается неструктурированной. Расстояние между спиралями α1 – α3 и петлей 67 указывает на то, что субстратом метилирования с наибольшей вероятностью является крупная молекула (РНК, ДНК или белок), но не низкомолекулярное соединение. На данный момент — это единственная информация о потенциальном субстрате WBSCR27. Несмотря на интенсивные попытки определить мишень метилирования этого белка методами протеомики, предпринятые нашими коллегами под руководством проф. П.В. Сергиева, субстрат фермента WBSCR27 остается пока неустановленным. В результате выполнения проекта было подготовлено две статьи, посвящённые определению отнесения сигналов ЯМР белка и изучению ферментативных свойств WBSCR27. Одна статья опубликована (в журнале Biomolecular NMR Assignments), вторая находится на стадии рецензирования в FEBS Journal. Результаты определения структуры апо-формы WBSCR27 и его комплекса с SAH в растворе, вместе в данными о динамических свойствах белковой цепи, являются предметом еще одной готовящейся публикации. Результаты исследования по проекту являются основой кандидатской диссертации ключевого исполнителя Марьясиной С.С. Диссертация планируется к защите в 2020 году. За время выполнения проекта и при частичном использовании средств гранта РФФИ были оборудованы две комнаты для генно-инженерных и клеточных работ: «чистая» комната, оснащенная системой фильтрации воздуха (рис. 18) и «холодная» комната для работ по выделению и очистке белков, оснащенная системой кондиционирования, поддерживающей температуру +5°С (рис. 19). Это позволяет выполнять практически полный цикл работ по получению белков непосредственно в лаборатории ЯМР.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен