ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Основной целью настоящего исследования является идентификация и первичный анализ регуляторных короткоживущих белков в протеоме человека, которые могут участвовать в специфической модуляции цитотоксического эффекта сочетанной химиотерапии бортезомибом (PS-341, ингибитор протеасом) и доксорубицином (адриамицин, индуктор генотоксического стресса) на опухолевые клетки множественной миеломы. Поскольку известно, что регуляторные белки активно разрушаются протеасомами по убиквитин-зависимому и независимому пути только при непосредственном физическом взаимодействии с протеасомой, мы ожидаем, что при щадящих условиях выделения протеасом, будут также выявлены ассоциированные с ними белковые субстраты. Выполнение данной работы направлено на разработку диагностических подходов, основанных на методах высокопроизводительного анализа белковых взаимодействий между протеасомами и их субстратами. Полученные в ходе выполнения работ данные помогут выявить механизмы цитотоксического действия вышеуказанных лекарств на опухолевые клетки множественной миеломы, а также определить новые белковые маркеры, специфические для этого заболевания. Молекулярные механизмы синергизма между бортезомибом и доксорубицином остаются еще совершенно не изученными и являются насущной проблемой как для фундаментальной, так и для прикладной медицины. В связи с этим, проблема изучения белков «убиквитома», взаимодействующих с протеасомой и накапливающихся в клетках в результате действия бортезомиба и доксорубицина, приобретает чрезвычайную актуальность. Соответственно, решение этой проблемы в рамках предлагаемого нами проекта будет иметь чрезвычайно важное научно-практическое значение и может рассматриваться как пионерское, не имеющее аналогов ни в России, ни за рубежом.
The main objective of this study is the identification and initial analysis of regulatory short-lived proteins in human proteome that can participate in the specific modulation of the cytotoxic effect of combined chemotherapy with bortezomib (PS-341, a proteasome inhibitor) and doxorubicin (adriamycin, genotoxic stress inducer) on multiple myeloma tumor cells. Since it is known that regulatory proteins are actively degraded by the proteasomes of the ubiquitin-dependent and independent pathway only by direct physical interaction with the proteasome, we expect that under conditions of proteasome isolation, the protein substrates associated with them will also be identified. This work is aimed at developing diagnostic approaches based on methods of high-performance analysis of protein interactions between proteasomes and their substrates. The data obtained during the work will help to identify the mechanisms of the cytotoxic effect of the above drugs on tumor cells of multiple myeloma, as well as to identify new protein markers specific for this disease. Molecular mechanisms of synergism between bortezomib and doxorubicin are still not completely studied and are an urgent problem for both fundamental and applied medicine. In this connection, the problem of studying the ubiquitome proteins interacting with the proteasome and accumulating in the cells as a result of the action of bortezomib and doxorubicin is extremely urgent. Accordingly, the solution of this problem within the framework of the proposed project will be of extremely important scientific and practical importance and can be considered as a pioneer one, which has no analogues neither in Russia nor abroad.
- Разработка нового способа одностадийной аффинной очистки убиквитинированных короткоживущих регуляторных белков на основе убиквитин-связывающего домена белка HDAC6. Для реализации данной задачи предстоит оптимизировать методы выделения и очистки протеасом иммуно-аффинным способом, результаты которых будут использованы на всех последующих этапах работы. Планируется создать новый аффинный носитель на основе убиквитин-связывающего домена (УСД) белка HDAC6 для одноступенчатого выделения и очистки убиквитинированных белков. В связи с тем, что убиквитинированные белки гораздо более эффективно разрушаются протеасомами по сравнению с неубиквитинированными, и уровень их содержания в клетке крайне низок, решение этой задачи позволит нам повысить удельное содержание убиквитинированных белков в клетках для их дальнейшей идентификации и локализации сайтов убиквитинирования методом масс-спектрометрии. - Идентификация и анализ убиквитинированных короткоживущих белков, взаимодействующих с протеасомами в клетках линий множественной миеломы (ММ) человека, в норме и после сочетанной обработки бортезомибом и доксорубицином. В рамках этой задачи, сочетая разработанную нами одностадийную очистку убиквитинированных белков с иммуно-очисткой протеасом, планируется идентифицировать и охарактеризовать специфические для клеток множественной миеломы линий Im-9 и RPMI 8226 человека короткоживущие убиквитинированные белки, взаимодействующие с протеасомой. Также будет изучен сочетанный эффект терапии противораковыми препаратами бортезомибом и доксорубицином на состав и количественное содержание этих белков в клетках множественной миеломы.Таким образом будет составлен «протеомный каталог» убиквитинированных белков-субстратов для протеасомной деградации в клетках множественной миеломы. - Идентификация белков протеома человека, взаимодействующих с протеасомами в клетках множественной миеломы по убиквитин-НЕзависимому механизму. Решение этой задачи предполагает создание «протеомного каталога» белков, взаимодействующих с протеасомами по убиквитин-независимому пути. Поскольку известно, что белки, подвергающиеся деградации протеасомами по убиквитин-независимому пути, взаимодействуют напрямую с протеасомами через альфа 7 (PSMA3) субъединицу корового комплекса, в рамках этой задачи планируется определить состав различных белков, взаимодействующих с данной протеасомной субъединицей в контроле и при сочетанной химиотерапии в клетках множественной миеломы и нормальных клетках плазмы крови. Планируется анализ полученных спектров белков, что позволит разбить взаимодействующие с протеасомой белки на две группы: белки-субстраты протеасом и белки-регуляторы активности протеасом. Подготовленный совокупный анализ всех идентифицированных нами белков в нормальных и раковых клетках позволит получить более полную картину протеасомного «интерактома» и выявить новые биомаркеры ММ. - Изучение состава белков, специфически взаимодействующих с убиквитинированным р53. Поскольку одним из главных прогностических маркеров агрессивности множественной миеломы является статус белка-онкосупрессора р53, будет проведена выборочная оценка достоверности данных по специфическому взаимодействию с ним, полученных с помощью масс-спектрометрического анализа, независимыми методами ко-иммунопреципитации и иммуноблоттинга in vitro и in vivo. - Оценка влияния сверхэкспрессии регуляторных короткоживущих белков, выявленных в ходе протеомного анализа, на остановку клеточного цикла и апоптоз в клетках множественной миеломы (с мутантным и нормальным р53, соответственно) при сочетанной химиотерапии. Планируется оценить эффект сверхэкспрессии регуляторных ММ-специфических белков, взаимодействующих с протеасомой, которые будут определены нами в результате проведения запланированных экспериментов, на остановку клеточного цикла и апоптоз в клетках множественной миеломы, отличающихся по статусу р53, на примере двух клеточных линий множественной миеломы: Im-9 и RPMI 8226 - до и после химиотерапии.
Авторы заявки занимаются изучением воздействия пост-трансляционных модификаций на ферментативные активности протеасом и регуляцию стабильности и активности онкосупрессорного белка р53 уже довольно длительное время. За это время были получены приоритетные результаты о том, что генотоксический стресс, индуцируемый доксорубицином в клетках проэритролейкемии человека, вызывает фосфорилирование и убиквитинирование альфа и бета субъединиц 20S протеасомы. Результаты двумерного электрофореза (2ДЭ) и масс-спектрометрического исследования белкового материала были подтверждены иммуноблоттингом со специфическими антителами, узнающими данные пост-трансляционные модификации. При этом протеолитическая активность протеасом при обработке клеток доксорубицином повышалась, а при in vitro убиквитинировании - снижалась. Наши неопубликованные данные свидетельствуют о том, что в результате иммунопреципитации протеасом из клеток, с их последующим фракционированием в градиенте плотности, они (протеасомы) мигрировали как существенно более тяжелые комплексы по сравнению с ожидаемым весом в 2МДа, что свидетельствует в пользу того, что протеасомы ассоциированы с множеством белков, многие из которых являются субстратами для протеолитической деградации. Нами выявлены, помимо описанных ранее в литературе белков альфа5 и альфа1, субъединицы 20S протеасом, обладающие РНКазной активностью - альфа6 и альфа7. Нам удалось получить приоритетные данные о том, что геномная РНК вируса гриппа гидролизуется очищенным препаратом протеасом. Нами были получены приоритетные данные о существовании ассоциированных с протеасомами малых некодирующих РНК, по размерам соответствующих малым интерферирующим РНК. Также нам удалось идентифицировать несколько десятков ассоциированных с протеасомой белков, которые участвуют в сплайсинге. Механизм этого феномена пока не известен.
Hами показано, что сочетанная обработка клеток множественной миеломы человека линии RPMI8226 бортезомибом и доксорубицином приводит к подавлению всех трех типов пептидазных активностей протеасом. Нами созданы новые аффинные носители: на основе убиквитин-связывающего домена (УСД) белка HDAC6 для одноступенчатого выделения и очистки убиквитинированных белков и на основе субъединицы протеасом PSMA3 – для очистки протеасомо-ассоциированных белков. Использование данных носителей на модели сочетанной обработки клеток ММ бортезомибом и доксорубицином позволило нам повысить удельное содержание в клетках как короткоживущих убиквитинилированных белков, так и потенциальных белков-мишеней убиквитин-независимого протеолиза, соответственно. Проведенная масс-спектрометрическая идентификация соответствующих белков из клеток ММ человека до и после сочетанной терапии показала, что вышеописанные белки слияния (GST-UBD_HDAC6 и GST-PSMA3) связываются примерно с сотней различных белков, выполняющих разнообразные клеточные функции и участвующих в таких процессах, как транскрипция, трансляция, метаболизм РНК. Также, в этой совокупности белков обнаружен ряд субъединиц протеасом, шаперонов и шаперонинов, митохондриальных белков, а также компонентов цитоскелета. Результаты масс-спектрометрического анализа связывания белков клеток множественной миеломы с протеасомной субъединицей альфа7 (PSMA3) подтверждены иммуноблоттингом с антителами к белкам hnRNP A2/B1, hnRNP K, hnRNP L, hnRNP C1/C2, ELAVL1 (HuR), eeF1A, HSP70, GRP78, PSME1 и ACTG1. Кроме того, нами впервые показано масс-спектрометрическими методами, что некоторые из альфа-субъединиц 20S протеасом, обладающих специфической регулируемой эндоРНКазной активностью по отношению к смысловым и антисмысловым последовательностям AU-богатых мРНК, несут ряд не идентифицированных ранее пост-трансляционных модификаций, оказывающих влияние на их РНКазную активность.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. | Протеомный анализ влияния сочетанного повреждения ДНК и подавления активности протеасом на развитие миеломы у человека |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Протеомный анализ влияния сочетанного повреждения ДНК и подавления активности протеасом на развитие миеломы у человека |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Протеомный анализ влияния сочетанного повреждения ДНК и подавления активности протеасом на развитие миеломы у человека |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".