ИСТИНА

Скелетная мышца обладает пластичностью и способна отвечать на состояние функциональной разгрузки атрофией, снижением диаметра мышечных волокон, содержания белка, снижением силы. Процесс атрофии связан с увеличением белковой деградации и/или снижением белкового синтеза. Для разработки способа предотвращения развития атрофического процесса необходимо выявить фундаментальные механизмы его инициирования. В то же время, именно ранние этапы развития атрофии изучены хуже всего. Цель нашей работы – исследовать триггерные механизмы инициации синтеза основных мышечных E3-лигаз (atrogine-1 и MuRF-1), а также установить их внутриклеточную локализацию и ассоциацию этих молекул с сократительными белками для того, чтобы выявить механизм их активации. Значимость исследований состоит в том, что именно эти две Е3-лигазы (из >1000 известных убиквитин-лигаз) активируются при атрофических процессах, вызванных функциональной разгрузкой мышц. Для выявления механизмов, запускающих активацию работы Е3-лигаз, мы собираемся тестировать 1. Сигнальные пути и транскрипционные факторы, которые способствуют их экспрессии, и 2. возможные физиологические механизмы, приводящие к структурным изменениям титина в волокне, что может приводить к изменениям в его связывании с MuRF-1 при функциональной разгрузке мышц и активированию процессов протеолиза. 1. Для ответа на первый вопрос мы собираемся провести исследование работы гистондеацетилазы 4/5 (HDAC 4/5) и работы связанного с ней транскрипционного фактора миогенина (инициирующего экспрессию MuRF-1 и, возможно, atrogin-1/MAFbx); и следующей задачей ставиться тестирование роли MAP-киназного сигнального пути (в частности p38 MAPK) в экспрессии MuRF-1 и atrogin-1/ MAFbx при функциональной разгрузке мышц. 2. Для исследования физиологических стимулов, которые могут приводить к структурным изменениям и активизации высвобождения MuRF-1 от мест его связывания с сократительными белками мышцы с последующим участием в процессе убиквитинирования сократительных белков мы собираемся провести эксперимент с вывешиванием крыс в течение 1 и 3 дней и анализом связывания MuRF-1 с титином в районе М-линии саркомера. . Новые данные о работе ключевых протеолитических ферментов в атрофирующейся скелетной мышце могут изменить традиционную парадигму о фармацевтических мишенях для её лечения при разгрузке, вызванной постельным режимом, космическим полётом или иммобилизацией.

Целью исследования является 1.выявление триггерных механизмов инициации синтеза основных мышечных E3-лигаз (atrogin-1 и MuRF-1), а также установление их внутриклеточной локализации и ассоциации этих молекул с сократительными белками при функциональной разгрузке мышц для выявления механизма их активации. Конкретной фундаментальной задачей в рамках указанной проблемы является исследование роли а) транскрипционного фактора миогенина и б) MAP-киназного сигнального пути (в частности p38 MAP-киназы) в активировании экспрессии Е3-лигаз. Мы показали, что исследованные нами ранее отдельные сигнальные пути и транскрипционные факторы вносят 20-25% вклад в регулирование процесса атрофии мышцы при её разгрузке. Необходимо определить недостающие звенья, контролирующие этот процесс. Следующей задачей является выявление внутриклеточной локализации и ассоциации молекул Е3-лигаз с титином при разгрузке. Мы полагаем, что процесс убиквитинирования сократительных белков Е3-лигазами при разгрузке мышц запускается при их отсоединении от молекул титина. В связанном состоянии Е3-лигазы могут быть не активны. Решение этих задач может существенно расширить представление о фундаментальных механизмах развития атрофических процессов в мышце и разработать подходы фармакологической коррекции негативных последствий функциональной разгрузки мышц. Для выявления роли гистондеацетилазы 4/5 (HDAC 4/5) и активируемого ею транскрипционного фактора миогенина в инициации экспрессии Е3-лигаз планируется ингибировать гистондеацетилазы в течение 3х-дневного вывешивания крыс методом введения его специфического ингибитора трихостатина А (Dupre-Aucouturier S., 2015). Известно, что максимум экспрессии Е3-лигазы атроген-1/MAFbx и MURF1 достигается уже на третьи сутки вывешивания, в связи с этим и выбрана продолжительность эксперимента. Одна группа крыс Wistar будет служить контролем (n=7), вторая будет подвергаться вывешиванию (n=7, описание в разделе «Методы») и третья группа будет вывешена с введением трихостатина А. в m.soleus. Животные будут наркотизированы авертином и будет выделена m.soleus. Мы ожидаем получить ответ на вопрос, являются ли гистонацетилазы 4/5 и миогенин факторами, регулирующими экспрессию Е3-лигаз (MuRF-1, атрогена-1) при разгрузке мышц. Кроме HDAC 4/5 и транскрипционного фактора миогенина мы собираемся проверить альтернативный путь инициации MuRF-1 и atrogene-1 - содержание другого транскрипционного фактора, регулирующего их работу - pFOXO3/FOXO3 и фософорилирующего его pAkt/Akt и, конечно, компоненты убиквитин-протеасомной системы: Е3-лигазы, количество конъюгированного убиквитина. Мы надеемся обнаружить снижение степени атрофии m.soleus в результате такого воздействия. Перед этими исследованиями нами будет проведён дополнительный эксперимент, чтобы оценить изменение экспрессии транскрипционного фактора миогенина на ранних этапах разгрузки (без введений ингибитора). Одна группа животных будет служить контролем, а вторая подвергнется одно- и трёх-суточному вывешиванию. Животные будут наркотизированы авертином и будет исследована m.soleus. Содержание миогенина на таких ранних сроках вывешивания ранее не исследовалось. В результате первого года исследований мы должны ответить на вопрос, является ли миогенин транскрипционным фактором, контролирующим экспрессию ведущих Е3 лигаз (MuRf-1 и atrogine-1) при функциональной разгрузке мышц. Для того чтобы проверить эту гипотезу об активации миогенина на ранних стадиях функциональной разгрузки мышц будет проверено его содержание в soleus на первые и третьи сутки вывешивания крыс, а также будет проведён эксперимент с введением крысам в m. Soleus специфического ингибитора гистондеацетилазы 4/5 HDAC трихостатина А. Кроме содержания миогенина, будет определена работа каскада Akt-FoxO для выявления роли активации альтернативного mTOR cигнального пути в экспрессии MuRF-1. В частности, будет выявлено соотношение pAkt/Akt, pFOXO3/FOXO3, определено количество конъюгированного убиквитина, HDAC 4/5, миогенина методом фореза и блота. Методом РТ-ПЦР мы выявим содержание мРНК MuRF-1 и atrogine-1. В случае, если при ингибировании работы миогенина мы обнаружим отсутствие увеличения содержания Е3-лигаз MuRF-1 и atrogine-1, а также предотвращение (или замедление) развития атрофии, наша гипотеза о контролировании миогенином экспрессии этих лигаз окажется верна.

В течение ряда лет коллектив занимался исследованием физиологии мышечной деятельности, морфологии и биохимии скелетных мышц (человека и животных) при их повышенной и пониженной физической активности. Впервые было показано, что: - кальций является сигнальной молекулой, способной активизировать активность протеолитических ферментов в скелетных мышцах при гипокинезии, а также активировать некоторые транскрипционные факторы тяжелых цепей миозинов; Регуляция активности мю-кальпаина при разгрузке m. soleus связана с модуляцией работы L-каналов. Разрушение цитоскелетного белка десмина происходит до начала процесса атрофии мышцы и ассоциировано с аутолизом мю-кальпаина. Регуляция уровня мРНК Е3-лигаз MuRF1 и MAFbx не связана с работой L-кальциевых каналов. -Введение ингибитора кальпаинов PD150606 вывешенным животным препятствует увеличению экспрессии кальпаина-1, MAFbx и убиквитинированию белков, способствует сохранению уровня pAkt и pFoxO3 и предотвращает развитие атрофии, воздействуя и на катаболические и на анаболические сигнальные пути. -Ингибирование протеасом бортезомибом при функциональной разгрузке m.soleus предотвращает увеличение экспрессии Е3-лигаз MuRF-1 и MAFbx, увеличение убиквитинирования белков и содержания кальпаина-1 и не влияет на содержание pAkt, pP90RSK, p-P70S6k, pGSK и p-4E-BP. Таким образом, ингибирование протеасом не затрагивает анаболический сигналинг и снижает активность компонентов катаболических сигнальных путей, чего оказывается недостаточно для предотвращения атрофии в скелетной мышце. На основе фундаментальных исследований, финансируемых РФФИ, за последние несколько лет получено 7 патентов применения препаратов, имеющих протекторное действие на белки скелетных мышц при различных повреждающих воздействиях.