| 1 |
5 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растений |
| Результаты этапа: Исследована способность модельных РНК, синтезируемых в листьях растений N. benthamiana, агроинифльтрированных бинарными векторами, несущими клонированные последовательности этих РНК, транспортироваться по флоэме в верхние листья. Показано, что модельные РНК могут быть детектированы в верхних листьях растений, но их количество там находится на пороговом уровне детекции.
На основе клонированной копии генома Х-вируса картофеля разработана экспериментальная система, которая может быть использована для проверки способности фрагментов различных клеточных и вирусных РНК направлять флоэмный транспорт. Показано, что фрагмент мРНК FT (flowering locus T) A. thaliana и фрагменты изучаемых модельных РНК могут направлять флоэмный транспорт рекомбинантных РНК.
С использованием препаратов ренатурированных рекомбинантных белков, экспрессированных в бактериальных клетках, методом сдвига в геле изучалась способность белков Nt-4/1d90 и NtPBL-C связывать различные РНК. Исследованы сходства и различия в характере связывания этими белками таких РНК-субстратов, как природные тРНК, полученные in vitro транскрипты тРНК, вирусные тРНК-подобные структуры, предшественники миРНК и клеточные РНК, способные к флоэмному транспорту.
Изучена субклеточная локализации белков рр16 и ТСТР. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии листьев N. benthamiana, агроинфильтрированных конструкциями для временной экспрессии, показано, что слитные белки pp16-GFP, GFP-pp16 и TCTP-mRFP распределяются диффузно в цитоплазме и нуклеоплазме. Обнаружено, что ко-экспрессия pp16 и TCTP не меняет локализацию этих белков. Показано, что белок ТСТР не меняет свой локализации в клетках, инфицированных Х-вирусом картофеля.
Обнаружено, что при ко-экспрессии Nt-4/1d90-GFP, который имеет диффузную локализацию в клетках растений, с NbVAP27-mRFP, который локализуется преимущественно в сети эндоплазматического ретикулума (ЭПР), происходит концентрация Nt-4/1d90-GFP вокруг трубочек ЭПР. Изучена наблюдаемая в условиях механического стресса субклеточная ре-локализация белка Nt-4/1d90-GFP в сферические тельца, ассоциированные с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) и NbVAP27-специфическими тельцами на трубочках ЭПР. Выявлено, что сферические тельца ассоциированы с реорганизованными в результате стресса микротрубочками (МТ) и содержат маркер МТ mRFP-MAP4. Показано, что ре-локализация Nt-4/1d90-GFP может быть связана с дефосфорилированием белка.
На модели РНК вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) отработаны условия получения РНК-белковых комплексов и дальнейшего анализа их белкового состава. Подобраны условия, в которых полученный in vitro биотинилированный транскрипт ВВКК при инкубации с флоэмным экссудатом тыквы (Cucurbita maxima) образует РНК-белковые комплексы, которые могут быть очищены на стрептавидин-агарозе для дальнейшей идентификации входящих в их состав белков. Показано, что в этих условиях транскрипт ВВКК взаимодействует с флоэмным белком РР2.
Отработаны методики сайленсинга гена PBL в растениях N. benthamiana. Получены конструкции для локального сайленсинга, несущие в составе бинарного вектора под контролем 35S-промотера две копии фрагмента гена NbPBL в виде инвертированного повтора, и системного сайленсинга, несущие фрагмент гена NbPBL в составе вектора на основе вируса погремковости табака. Проведена оценка эффективности локального и системного сайленсинга с использованием полученных конструкций.
|
| 2 |
1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растений |
| Результаты этапа: Проводились исследования структурных особенностей РНК, определяющих способность к флоэмному транспорту. С помощью ранее разработанной в рамках данного проекта экспериментальной системы для анализа способности фрагментов различных клеточных и вирусных РНК направлять флоэмный транспорт модельной РНК в растениях N. benthamiana показано, что структурированный фрагмент первичного транскрипта миРНК содержат сигнал(ы) флоэмного транспорта. С использованием препарата ренатурированного рекомбинантного белка, экспрессированного в бактериальных клетках, методом сдвига в геле было исследовано связывание белка NtPBL-C с мутантными транскриптами предшественника миРНК. Анализ библиотеки первичных чтений длинных флоэмных РНК, полученных ранее методами секвенирования нового поколения, выявил наличие предшественников миРНК. С помощью анализа сравнительной представленности последовательностей предшественников миРНК и мРНК во флоэмном экссудате получены указания на то, что непроцессированные транскрипты миРНК селективно включается в путь флоэмного транспорта.
Была исследована способность структурно несхожих тРНК-подобных структур, локализованных в 3'-некодирующих областях геномных РНК ряда вирусов растений, направлять флоэмный транспорт модельной РНК. Показано, что такая способность присуща вирусным тРНК-подобным структурам трех известных типов.
Проводили исследование возможного влияния РНК-цитозин-метилтрансферазы DNMT2 N. tabacum на межклеточный и флоэмный транспорт Х-вируса картофеля (ХВК). С использованием временной экспрессии рекомбинантных белков методом агроинфильтрации обнаружено, что DNMT2, но не его мутантный вариант, лишенный ферментативной активности, стимулирует накопление вирусных РНК в локусах инфекции ХВК и межклеточный транспорт вируса, но не оказывает значимого влияния на флоэмный транспорт вирусной РНК. Клонирована кодирующая последовательность DNMT2 Arabidopsis thaliana, получен штамм E. coli, продуцирующий AtDNMT2, отработаны условия его очистки и ренатурации. Начаты работы по анализу ферментативной активности рекомбинантного AtDNMT2 in vitro с использованием различных РНК-субстратов. В серии предварительных экспериментов подобраны оптимальные условия для идентификации остатков 5-метилцитозина в РНК-транскриптах, обработанных рекомбинантным AtDNMT2, с помощью бисульфитного секвекнирования.
Был получен бинарный вектор, несущий под контролем 35S-промотера полноразмерный элемент ретРНК N. benthamiana (NbRZ), включающий два LTR и центральную область. Анализ растений, агроинфильтрированных данной конструкцией, выявил накопление (+) и (-) цепей NbRZ в инфильтрированных листьях, что говорило о репликации NbRZ, а также накопление (+)цепей NbRZ в верхних листьях, что служило указанием на то, что происходил системный (дальний) транспорт NbRZ из инфильтрированных листьев в апикальную часть растения.
С использованием биотинилированых транскриптов РНК, способных транспортироваться по флоэме, были выделены комплексы, формируемые этими РНК и белками флоэмного экссудата Cucurbita maxima. Белковые компоненты комплексов разделяли в полиакриламидном геле и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии. Были идентифицированы два флоэмных белка C. maxima, для которых ранее не были описаны РНК-связывающие свойства. Данные белки были экспрессированы в бактериальных клетках и выделены с помощью аффинной хроматографии. Анализ способности рекомбинантных белков связывать различные РНК-субстраты, который проводили методом сдвига в геле, выявил сродство одного из этих белков к РНК, способным транспортироваться по флоэме.
|
| 3 |
1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растений |
| Результаты этапа: Проводилось изучение структурных элементов РНК, несущих сигналы флоэмного транспорта. С использованием препарата ренатурированного рекомбинантного белка, экспрессированного в бактериальных клетках, методом сдвига в геле было продолжено исследование связывание белка NtPBL-C с мутантными транскриптами предшественника миРНК. Вместе с результатами, полученными ранее, полученные данные говорят о том, что район, участвующий во взаимодействии с PBL-С, располагается в дистальной части стебля шпилечной структуры предшественника миРНК.
С использованием экспериментальной системы на основе REP-GFP проводился анализ способности направлять флоэмный транспорт гетерологичной РНК для мутантных производных предшественника миРНК. Обнаружено, что мутации, затрагивающие два различных элемента вторичной структуры предшественника миРНК, не оказывают влияния на его способность направлять флоэмный транспорт гетерологичной РНК.
Был проведен анализ данных высокопроизводительного секвенирования, целью которого была идентификация присутствующих во флоэме предшественников миРНК. В результате было выявлено 11 предшественников миРНК с высокой относительной представленностью во флоэмном транскриптоме; обнаружено, что этот набор имеет только две общих последовательности с набором предшественников миРНК с высокой представленностью в транскриптоме листа.
С целью экспериментальной проверки данных биоинформатичекого анализа была проведена детекция предшественников миРНК в препаратах РНК, полученных из флоэмного экссудата C.maxima. Получены эксперименталтьные данные, подтверждающие вывод о том, что во флоэме C. maxima селективно аккумулируется определенный набор предшественников миРНК.
Для того, чтобы определить способны ли предшественники миРНК транспортироваться по флоэме от одних частей растения к другим, проводились эксперименты по межвидовым прививкам. Привой дыни (Cucumis melo) прививался на растения C. maxima, служившие подвоем. При амплификации с использованием специфических праймеров показано, что предшественники миРНК, синтезирующиеся в подвое, детектируются во флоэмном соке привоя. Таким образом, показано, что предшественники миРНК способны транспортироваться по флоэме. Эти данные указывают на возможную роль предшественников миРНК в системном сигналинге в растениях.
Проводилось изучение роли метилирования оснований РНК в определении способности к флоэмному транспорту. С помощью бисульфитного секвенирования РНК обнаружено метилирование остатков цитозина с образованием 5-метил-цитозина в контрольной тРНК, но не в предшественнике одной из миРНК. С использованием вирус-индуцируемого сайленсинга генов в растениях N.benthamiana проводилось изучение возможной роли метилтрансфераз, катализирующих метилирование остатков аденозина в молекулах РНК с образованием N6-метиладенозина (6mA). Показано, что сайленсинг гена N.benthamiana, кодирующего ортолог МТА, метилтрансферазы A.thaliana, сурессирует проникровение вируса погремковости табака в апикальную меристему. Таким образом, в этих экспериментах впервые показано, что может существовать связь между метилированием остатков аденозина в РНК с образованием 6mA и способностью вирусной РНК к транспорту в меристему.
Проводился анализ флоэмного транспорта ретРНК. Была получена модифицированная конструкция pLH-NbRZ, где центральном районе NbRZ была произведена инсерция дополнительной короткой маркерной последовательности, которую можно использовать в качестве сайта отжига специфического праймера при анализе накопления NbRZ в растениях, и таким образом отличать продукты клонированной копии NbRZ от родственных эндогенных молекул. Показано, что модифицированная таким образом РНК NbRZ способна к репликации и системному транспорту в растениях N.benthamiana. С помощью делеционного мутагенеза выявлено, что циркуляризация и репликация не являются необходимыми для системного транспорта NbRZ. С использование эксперимнетальной системы на основе REP-GFP получены данные, показывающие, что NbRZ содержит сигналы, способные направлять флоэмный транспорт гетерологичной РНК, и эти сигналы локализуются в центральной части последовательности NbRZ.
Проводилось изучение свойств флоэмного серпина-1 (PS-1) и его возможной роли во флоэмном транспорте РНК. Для анализа специфичности связывания РНК белком PS-1 были проведены эксперименты по сдвигу в геле с различными РНК-субстратами. Получены данные, указывающие на то, что PS-1 может неспецифически связывать РНК с образованием комплексов, полностью неспособных войти в гель; взаимодействует со структурированными РНК с образованием подвижных в геле комплексов и, весьма вероятно, образует специфический комплекс с тРНК. Показано, что антитромбин-III, наиболее схожий с PS-1 белок человека, в отличие от PS-1, практически не взаимодействует с РНК. С помощью делеционного анализа и сайт-направленного мутагенеза показано, что N-концевой район белка PS-1 не участвует в связывании РНК.
|
