ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Разработка с помощью методов квантовой химии и молекулярно-динамического моделирования рациональной и эффективной стратегии создания модифицированных мутантных форм родопсинов с улучшенными спектральными характеристиками для применения в оптогенетике при однофотонном и двухфотонном возбуждении
Optogenetics is a method of studying the functioning of excitable cells with the help of light. The method uses membrane proteins - rhodopsins - which are light-dependent ion channels, or pumps, which are built using genetic engineering methods into the membrane of the cells under study. When irradiated with light, rhodopsins cause depolarization or hyperpolarization of the cell membrane, which leads to excitation or, conversely, shutdown of the cell in question. One of the main advantages of this method is that it opens the possibility to control the activity of certain cell types with high temporal and spatial resolution. The study of tissues using rhodopsins, which have a long-wavelength-shifted absorption spectrum, is one of the most important technologies for the development of the method of optogenetics due to the greater depth of penetration into the volume of tissues and the lower phototoxicity of long-wave radiation. Therefore, today many attempts are being made to create such a technology: new types of rhodopsin proteins that absorb in a longer wavelength region are being investigated by experimental search for natural wild-type rhodopsins, molecular screening among mutant forms obtained by random mutagenesis and chimeric proteins, as well as among rhodopsins , in which the chromophore is replaced by structural analogues. This project proposes a different approach to the creation of rhodopsins with a shifted absorption spectrum, namely, it is supposed to use information about the structure of the active centers of a number of rhodopsins for the rational design of mutant forms of proteins, followed by the calculation of their spectral characteristics using quantum chemistry and molecular dynamics modeling methods. The use of computational methods is an integral, essential and primary part of any large-scale research aimed at creating enzymes and proteins with desired properties. Since optogenetics is a relatively young science, most of the rhodopsins needed and already used in this area have not yet been analyzed in detail and in depth by methods of theoretical chemistry, and the potential of these proteins is far from being fully disclosed, which justifies the novelty of the research proposed in this project. It is expected that this approach will make it possible to develop a more rational strategy for designing mutant forms of rhodopsins and will reduce the experimental costs of searching for the desired protein among a large number of randomly mutated and chimeric proteins. Also, this approach will make it possible to avoid competition in binding to the active center between natural retinal and its artificial synthetic analogs in vivo. Thus, the goal of this project is to develop, using quantum chemistry and molecular dynamics modeling, a rational and efficient strategy for creating modified mutant forms of rhodopsins with improved spectral characteristics for use in optogenetics under single-photon and two-photon excitation. Within the framework of the project, the influence of the local protein environment of the chromophore of mutant rhodopsins from the types of ion pumps and ion channels on the shift of the electronic-vibrational single-photon absorption spectra to red and blue regions will be established. The study will propose which mutations of the selected proteins should be carried out to obtain modified forms of rhodopsins with a red-shifted single-photon absorption spectrum for more effective use in optogenetics, and the single-photon absorption spectra of mutant forms will be calculated. It is also planned to calculate the two-photon absorption cross sections of selected rhodopsins from the types of ion pumps and ion channels and their mutant forms. The role of the local protein environment in ensuring the efficiency of two-photon absorption will be established. Two-photon absorption spectra for selected rhodopsins will be calculated.
Будет установлено влияние локального белкового окружения хромофора мутантных родопсинов из типов ионных насосов и ионных каналов на сдвиг электронно-колебательных спектров однофотонного поглощения в красные и синие области. В исследовании будет предложено, какие мутации выбранных белков следует провести для получения модифицированных форм родопсинов со сдвинутым спектром однофотонного поглощения в красную область для более эффективного применения в оптогенетике, будут рассчитаны спектры однофотонного поглощения мутантных форм. Будет установлен механизм прямых и обратных фотохимических реакций в выбранных родопсинах, будет установлено влияние белкового окружения на фотодинамику реакции фотоизомеризации родопсинов и на их спектральные свойства. В исследовании будет предложено, как именно белок влияет на активность колебательных мод в выбранных родопсинах и в их первичных интермедиатах. Будут рассчитаны сечения двухфотонного поглощения выбранных родопсинов из типов ионных насосов и ионных каналов и их мутантных форм. Будет установлена роль локального белкового окружения в обеспечении эффективности двухфотонного поглощения. Будут рассчитаны спектры двухфотонного поглощения для выбранных родопсинов Таким образом, результаты исследования внесут значительный вклад в развитие метода оптогенетики, так как позволят создать модифицированные формы родопсинов с улучшенными спектральными характеристиками, делающими возможным применение более длинноволнового излучения для изучения функционирования возбудимых клеток, находящихся в глубине исследуемой ткани. Полученные результаты внесут важный вклад в фундаментальное понимание механизмов изомеризации хромофорной группы родопсинов и влияния свойств белкового окружения на данный процесс.
Руководитель проекта, Кусочек Павел Александрович, имеет большой опыт исследования механизмов фотохимических реакций в биомолекулярных системах, в частности, в области изучения фотофизики и фотохимии ретиналь содержащих белков и их хромофорных групп. Кусочек Павел Александрович является экспертом в области многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений XMCQDPT2. Недавно им были исследованы механизмы безызлучательной релаксации и получены оценки средних времен жизни в возбужденном состоянии изомеров протонированного основания Шиффа ретиналя в газовой фазе. Было показано, что динамика релаксации первого электронно-возбужденного состояния 11-цис изомера протонированного основания Шиффа ретиналя сопоставима с характеристическими временами фотоизомеризации в белках зрительной рецепции, тогда как специфичность реакции и средние времена жизни в возбужденном состоянии полностью-транс изомера протонированного основания Шиффа ретиналя значительно различаются в изолированном состоянии и белковом окружении микробиальных родопсинов. Также руководителем проекта были предложены пути управления сверхбыстрой фотоиндуцированной динамикой изолированного протонированного основания Шиффа ретиналя с помощью химических модификаций структуры хромофора. На основе хромофорной группы ретиналь-содержащих белков с заблокированным внутримолекулярным вращением по центральной двойной связи было показано, что среднее время жизни возбужденного состояния может быть на порядок снижено вследствие возникновения стерических взаимодействий и значительного снижения энергетического барьера безызлучательной релаксации. Руководителем проекта была установлена взаимосвязь между структурой активного центра микробиального родопсина KR2 и фотоиндуцированной динамикой его хромофорной группы на ранних временах. Обнаруженная структурная гетерогенность данного белка позволила объяснить природу его реакционноспособных и нереакционноспособных форм.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 8 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. | Разработка новых мутантных форм родопсинов для оптогенетики |
Результаты этапа: I. Исследование механизма прямых и обратных фотохимических реакций в выбранных бактериальных и животных родопсинах Проведен анализ литературы с целью выявление родопсинов, обладающих самой высокой скоростью фотоизомеризации и, таким образом, представляющих интерес для применения в оптогенетике. Установлено, что микробный родопсин KR2 из бактерии Krokinobacter eikastus и бычий зрительный родопсин (ЗР) обладают наибольшей скоростью фотоизомеризации. Проведен анализ литературы с целью выбора репрезентативных кристаллических структур реагентов и интермедиатов исследуемых родопсинов для проведения исследований. Для построения полных атомистических моделей реагентов родопсина KR2, зрительного родопсина (ЗР) и бактериородопсина (БР) были выбраны структуры с идентификаторами PDB ID 6YC3, 1L9H и 1M0L, соответственно, а для построения моделей интермедиатов - структуры с идентификаторами PDB ID 6TK5, 2G87 и 1M0K, соответственно. С помощью молекулярно-динамического моделирования и комбинированного метода квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) получены уравновешанные КМ/ММ оптимизированные полные атомистические модели реагентов и интермедиатов исследуемых родопсинов и проведен анализ структуры их активного центра. Установлено, что реагенты родопсина KR2 и зрительного родопсина обладают близким структурным мотивом активного центра, который характеризуется наличием сильной водородной связи между первичным противоионом и протонированным основанием Шиффа и близостью заряженного остатка к основанию Шиффа. За счет наличия прямой водородной связи полиеновая цепь ретиналя в родопсинах KR2 и ЗР претерпевает скручивание вокруг определенной двойной связи, именной той, которая в дальнейшем претерпевает реакцию фотоизомеризации. В случае родопсина KR2 это связь С13=С14, а в случае ЗР – связь С11=С12. В случае БР между противоионом и протонированным основанием Шиффа ретиналя находится молекулы воды, и прямой водородной связи между противоионом и протонированным основанием Шиффа не образуется, а полиеновая цепь ретиналя скручена вокруг связи С13=С14 слабее, чем полиеновая цепь родопсина KR2. Полиеновая цепь КМ/ММ оптимизированных структур первичных интермедиатов скручена сильнее, чем в реагентах. Это объясняется тем, что первичные интермедиаты находятся в нерелаксированном состоянии, которое возникает сразу после поглощения фотона и фотоизомеризации. С помощью метода XMCQDPT2/SA-CASSCF (12,12)/(aug)-cc-pVDZ в сочетании с методом EFP для КМ/ММ оптимизированных структур реагентов и интермедиатов рассматриваемых родопсинов были рассчитаны энергии вертикальных переходов и однофотонные электронно-колебательные спектры и проведен анализ колебательной структуры полос электронно-колебательных спектров. Из анализа колебательной структуры спектров реагентов установлено, что в родопсине KR2 при переходе S0-S1 наиболее активной является нормальная мода валентного колебания вдоль двойной связи C13 = C14, а также HOOP колебательная мода атома водорода при данной двойной связи. В зрительном родопсине высокую интенсивность приобретает валентное колебание вдоль связи C11 = C12 , а также HOOP колебательная мода атомов водорода при данной двойной связи. То есть при помещении молекулы РПШО из газовой фазы в белковое окружение родопсина KR2 и зрительного родопсина в ретинале возникают высокочастотное валентное и HOOP колебания при определенной двойной связи. Эти два колебания вместе способствуют фотоизомеризации при данной двойной связи, при этом это именно та двойная связь, которая действительно в дальнейшем подвергается реакции фотоизомеризации. В бактериородопсине, так же, как и в случае родопсина KR2 при переходе S0-S1 наиболее активной является нормальная мода валентного колебания вдоль двойной связи C13 = C14. Но важным отличием от KR2 является то, что в БР HOOP колебание при связи C13 = C14 обладает намного меньшей интенсивностью, чем аналогичное колебание в KR2. Это связано с тем, что ретиналь в БР скручен вокруг связи C13 = C14 слабее, чем в KR2, что вызывает ослабление интенсивности HOOP колебаний при данной связи. Снижение интенсивности HOOP колебаний может являться причиной более низкой скорости фотоизомеризации РПШО в БР (~500 фс) по сравнению с KR2 (~200 фс). Таким образом, установлено, что белковое окружение родопсинов особым образом влияет на структуру собственной хромофорной группы, которая претерпевает скручивание полиеновой цепи, в результате чего при поглощении фотона становятся активными только определенные колебательные моды хромофора, которые способствуют сверхбыстрому протеканию реакции фотоизомеризации вокруг определенной двойной связи. Показано, что образование прямой водородной связи между противоионом и основанием Шиффа ускоряет в несколько раз скорость реакции фотоизомеризации и является важным элементом структуры активного центра в родопсинах, обладающих наивысшей скоростью фотоизомеризации. Анализ колебательной структуры электронно-колебательных спектров для первичных интермедиатов выявил значительные отличия от колебательной структуры спектров реагентов. Так, интенсивность HOOP колебаний в интермедиатах значительно выше, чем в реагентах, так как ретиналь сразу после изомеризации не успевает до конца релаксировать и находится в более скрученной конформации по сравнению с исходным состоянием, что способствует возрастанию интенсивности HOOP колебаний. В интермедиате KKR2 , также как и в исходном реагенте интенсивными являются только одна высокочастотная колебательная мода вдоль связи C13 = C14 и также одна колебательная HOOP мода, которые вместе способствуют обратной реакции фотоизомеризации вокруг связи C13 = C14 . В интермедиате Бато становятся активны сразу две колебательные моды вдоль связей C13 = C14 и C11 = C12 , а также две колебательные HOOP моды при данных двойных связях, что делает обратную реакцию фотоизомеризации зрительного родопсина менее селективной и обладающей меньшим квантовым выходом по сравнению с обратной реакцией родопсина KR2. В интермедиате KBR также, как и интермедиате KKR2 активна только одна высокочастотная колебательная мода вдоль связи C13 = C14 . В KBR возбуждается HOOP колебательная мода при связи C13 = C14. При этом также становится активной HOOP колебательная мода при связи C11 = C12, но ее интенсивность в несколько раз меньше таковой при связи C13 = C14 . Поэтому можно утверждать, что возбуждающиеся колебательные моды в интермедиате KBR , как и в KKR2 способствуют обратной реакции фотоизомеризации по связи C13 = C14 . Полученные данные согласуется с результатами эксперимента по измерению квантовых выходов обратных реакций для бактериородопсина и зрительного родопсина, в которых квантовый выход для БР в пять раз выше квантового выхода для ЗР. Таким образом, установлено, что обратные реакции в родопсинах I типа протекают с более высокой степенью селективности, чем обратные реакции в родопсинах II типа, что может быть связано с собственными фотофизическими свойствами изомеров ретиналя в активных центрах интермедиатов. Так, в интермедиатах микробных родопсинов содержится 13-цис изомер, который в газовой фазе изомеризуется на порядок быстрее, чем полностью-транс изомер в газовой фазе, находящийся в интермедиатах животных родопсинов. II. Исследование влияния белкового окружения на величину сечения двухфотонного поглощения ретиналь -содержащих белков первого и второго типа В данном разделе работы было исследовано влияние белкового окружения выбранных родопсинов на сечение их двухфотонного поглощения, свойства, определяющего эффективность использования белков в оптогенетических исследованиях в режиме двухфотонного поглощения. Данный раздел работы является логическим продолжением предыдущего этапа, на котором были исследованы свойства KR2, ЗР и БР при однофотонном поглощении. С помощью комбинированного метода КМ/ММ в варианте XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP были рассчитаны компоненты средних дипольных моментов в начальном (S0) и конечном (S1) состояниях, а также компоненты дипольных моментов переходов между различными электронными состояниями для родопсинов KR2, ЗР и БР. Для изучения влияния белкового окружения были рассчитаны компоненты средних дипольных моментов в начальном (S0) и конечном (S1) состояниях, а также компоненты дипольных моментов переходов между различными электронными состояниями для следующих модельных систем: для изолированных хромофоров в газовой фазе в геометрии из родопсинов KR2, ЗР и БР, для изолированных квантовых частей родопсинов KR2, ЗР и БР. Установлено, что наличие противоионов в ближайшем белковом окружении РПШО оказывает сильное влияние на его фотофизические свойства. Так, энергия вертикального перехода значительно сдвигается в синюю сторону при переходе от изолированного хромофора к белковому окружению. Важно отметить, что наибольший синий сдвиг, который варьируется в диапазоне 0.5–0.8 эВ, во всех трех случаях наблюдается при учете только ближайшего окружения хромофора, входящего в КМ подсистему. Учет вклада электростатического поля всего остального белкового окружения, входящего в ММ подсистему, напротив приводит к небольшому красному сдвигу по сравнению с энергией вертикального перехода в КМ подсистеме. Белок КR2 обладает наименьшим синим сдвигом, что обусловлено наличием только одного противоиона, стабилизирующего заряд на РПШО в его ближайшем белковом окружении. Характер перехода S0 → S1 не меняется при переходе от изолированного хромофора к белковому окружению и характеризуется значительной степенью переноса заряда, о чем можно судить по изменению средних дипольных моментов начального и конечного. Изменения энергии вертикального перехода S0 → S1 и разности средних дипольных моментов происходят симбатно при переходе от изолированного хромофора (в геометрии из белкового окружения) к КМ части и далее ко всему белку: синий сдвиг сопровождается уменьшением величины Δμ10, и, наоборот, красный сдвиг ее увеличением. Это обусловлено стабилизацией основного состояния РПШО в белковом окружении из-за взаимодействия с первичным противоионом и характером перераспределения электронной плотности при возбуждении. Вычислены значения сечений двухфотонного поглощения при фотовозбуждении S0 → S1 в микробных и животных родопсинах, которые рассчитаны в рамках N-уровневых моделей при возрастании количества состояний N, которые входят в суммирование. Установлено, что аналогично результатам, полученным для флуоресцентных белков, начальное и конечное состояния при фотовозбуждении S0 → S1 дают наибольший вклад в сечение двухфотонного поглощения микробных и животных родопсинов, а значения сечений хорошо описываются при помощи двухуровневой модели TLM, которая включает только два канала, учитывающих постоянные дипольные моменты состояний S1 и S0, а именно 0 → 0 → 1 и 0 → 1 → 1. Обнаружено, что двухуровневая модель TLM может быть использована для данных белков, так как однофотонный переход S0 → S1 является ярким и сопровождается большим перераспределением электронной плотности. В рамках классического двухфотонного поглощения сечение зависит от разности средних дипольных моментов этих состояний, и установлена четкая корреляция между увеличением сечения двухфотонного поглощения и увеличением средних дипольных моментов при переходерис. В результате проведенных исследований установлено, что сильная зависимость величин сечения двухфотонного поглощения от локальной структуры активного центра родопсинов I и II типов связана с электростатическим полем белка и его влиянием на поляризацию электронной плотности хромофора РПШО в основном и электронно-возбужденном состояниях. Наибольшее значение наблюдается у микробного родопсина КR2 (610 ГМ), при этом величины сечений у родопсинов первого типа могут варьироваться в широких пределах в зависимости от структурного мотива активного центра белка и влияния ближайшего белкового окружения, в первую очередь, противоионов, стабилизирующих положительный заряд на хромофоре. Введение точечных мутаций в родопсины первого и второго типа, приводящих к сдвигу максимумов поглощения в более длинноволновую область, будут приводить к увеличению сечения двухфотонного поглощения. Влияние электростатического поля белка в родопсинах первого и второго типов противоположно влиянию белкового окружения на нелинейные фотофизические свойства хромофорной группы флуоресцентных белков из-за разной относительной поляризуемости возбужденного и основного электронных состояний хромофоров этих белков вдоль направления переноса заряда при их возбуждении. III. Исследование влияния мутаций на фотофизические свойства родопсинов Проведен обзор литературы с целью поиска закономерностей, влияющих на сдвиг спектра поглощения родопсинов. Установлено, что наличие полярных аминокислотных остатков вблизи β-иононового кольца приводит к смещению спектра поглощения родопсинов в более длинноволновую область. Установлено, что наличие отрицательно заряженных и полярных аминокислотных остатков вблизи протонированного основания Шиффа ретиналя приводит к смещению спектра поглощения родопсинов в более коротковолновую область. На основе обзора литературы выбраны мутации P219T и S254A для проверки их влияния на спектр поглощения родопсина KR2 на уровне теории XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP. С помощью молекулярно-динамического моделирования и комбинированного метода квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) получена уравновешанная КМ/ММ оптимизированная полная атомистическая модель мутантной формы родопсина KR2 с двумя мутациями P219T и S254A. С помощью метода XMCQDPT2/SA-CASSCF (12,12)/(aug)-cc-pVDZ в сочетании с методом EFP для КМ/ММ оптимизированной структуры мутантной формы родопсина KR2 была рассчитана энергия вертикального перехода и однофотонный электронно-колебательный спектр. Установлено, что введенные мутации смещают спектр поглощения в красную область по сравнению с родопсином KR2 дикого типа. | ||
2 | 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. | Разработка новых мутантных форм родопсинов для оптогенетики |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".