Разработка новых мутантных форм родопсинов для оптогенетикиНИР

Development of new mutant forms of rhodopsins for optogenetics

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. Разработка новых мутантных форм родопсинов для оптогенетики
Результаты этапа: I. Исследование механизма прямых и обратных фотохимических реакций в выбранных бактериальных и животных родопсинах Проведен анализ литературы с целью выявление родопсинов, обладающих самой высокой скоростью фотоизомеризации и, таким образом, представляющих интерес для применения в оптогенетике. Установлено, что микробный родопсин KR2 из бактерии Krokinobacter eikastus и бычий зрительный родопсин (ЗР) обладают наибольшей скоростью фотоизомеризации. Проведен анализ литературы с целью выбора репрезентативных кристаллических структур реагентов и интермедиатов исследуемых родопсинов для проведения исследований. Для построения полных атомистических моделей реагентов родопсина KR2, зрительного родопсина (ЗР) и бактериородопсина (БР) были выбраны структуры с идентификаторами PDB ID 6YC3, 1L9H и 1M0L, соответственно, а для построения моделей интермедиатов - структуры с идентификаторами PDB ID 6TK5, 2G87 и 1M0K, соответственно. С помощью молекулярно-динамического моделирования и комбинированного метода квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) получены уравновешанные КМ/ММ оптимизированные полные атомистические модели реагентов и интермедиатов исследуемых родопсинов и проведен анализ структуры их активного центра. Установлено, что реагенты родопсина KR2 и зрительного родопсина обладают близким структурным мотивом активного центра, который характеризуется наличием сильной водородной связи между первичным противоионом и протонированным основанием Шиффа и близостью заряженного остатка к основанию Шиффа. За счет наличия прямой водородной связи полиеновая цепь ретиналя в родопсинах KR2 и ЗР претерпевает скручивание вокруг определенной двойной связи, именной той, которая в дальнейшем претерпевает реакцию фотоизомеризации. В случае родопсина KR2 это связь С13=С14, а в случае ЗР – связь С11=С12. В случае БР между противоионом и протонированным основанием Шиффа ретиналя находится молекулы воды, и прямой водородной связи между противоионом и протонированным основанием Шиффа не образуется, а полиеновая цепь ретиналя скручена вокруг связи С13=С14 слабее, чем полиеновая цепь родопсина KR2. Полиеновая цепь КМ/ММ оптимизированных структур первичных интермедиатов скручена сильнее, чем в реагентах. Это объясняется тем, что первичные интермедиаты находятся в нерелаксированном состоянии, которое возникает сразу после поглощения фотона и фотоизомеризации. С помощью метода XMCQDPT2/SA-CASSCF (12,12)/(aug)-cc-pVDZ в сочетании с методом EFP для КМ/ММ оптимизированных структур реагентов и интермедиатов рассматриваемых родопсинов были рассчитаны энергии вертикальных переходов и однофотонные электронно-колебательные спектры и проведен анализ колебательной структуры полос электронно-колебательных спектров. Из анализа колебательной структуры спектров реагентов установлено, что в родопсине KR2 при переходе S0-S1 наиболее активной является нормальная мода валентного колебания вдоль двойной связи C13 = C14, а также HOOP колебательная мода атома водорода при данной двойной связи. В зрительном родопсине высокую интенсивность приобретает валентное колебание вдоль связи C11 = C12 , а также HOOP колебательная мода атомов водорода при данной двойной связи. То есть при помещении молекулы РПШО из газовой фазы в белковое окружение родопсина KR2 и зрительного родопсина в ретинале возникают высокочастотное валентное и HOOP колебания при определенной двойной связи. Эти два колебания вместе способствуют фотоизомеризации при данной двойной связи, при этом это именно та двойная связь, которая действительно в дальнейшем подвергается реакции фотоизомеризации. В бактериородопсине, так же, как и в случае родопсина KR2 при переходе S0-S1 наиболее активной является нормальная мода валентного колебания вдоль двойной связи C13 = C14. Но важным отличием от KR2 является то, что в БР HOOP колебание при связи C13 = C14 обладает намного меньшей интенсивностью, чем аналогичное колебание в KR2. Это связано с тем, что ретиналь в БР скручен вокруг связи C13 = C14 слабее, чем в KR2, что вызывает ослабление интенсивности HOOP колебаний при данной связи. Снижение интенсивности HOOP колебаний может являться причиной более низкой скорости фотоизомеризации РПШО в БР (~500 фс) по сравнению с KR2 (~200 фс). Таким образом, установлено, что белковое окружение родопсинов особым образом влияет на структуру собственной хромофорной группы, которая претерпевает скручивание полиеновой цепи, в результате чего при поглощении фотона становятся активными только определенные колебательные моды хромофора, которые способствуют сверхбыстрому протеканию реакции фотоизомеризации вокруг определенной двойной связи. Показано, что образование прямой водородной связи между противоионом и основанием Шиффа ускоряет в несколько раз скорость реакции фотоизомеризации и является важным элементом структуры активного центра в родопсинах, обладающих наивысшей скоростью фотоизомеризации. Анализ колебательной структуры электронно-колебательных спектров для первичных интермедиатов выявил значительные отличия от колебательной структуры спектров реагентов. Так, интенсивность HOOP колебаний в интермедиатах значительно выше, чем в реагентах, так как ретиналь сразу после изомеризации не успевает до конца релаксировать и находится в более скрученной конформации по сравнению с исходным состоянием, что способствует возрастанию интенсивности HOOP колебаний. В интермедиате KKR2 , также как и в исходном реагенте интенсивными являются только одна высокочастотная колебательная мода вдоль связи C13 = C14 и также одна колебательная HOOP мода, которые вместе способствуют обратной реакции фотоизомеризации вокруг связи C13 = C14 . В интермедиате Бато становятся активны сразу две колебательные моды вдоль связей C13 = C14 и C11 = C12 , а также две колебательные HOOP моды при данных двойных связях, что делает обратную реакцию фотоизомеризации зрительного родопсина менее селективной и обладающей меньшим квантовым выходом по сравнению с обратной реакцией родопсина KR2. В интермедиате KBR также, как и интермедиате KKR2 активна только одна высокочастотная колебательная мода вдоль связи C13 = C14 . В KBR возбуждается HOOP колебательная мода при связи C13 = C14. При этом также становится активной HOOP колебательная мода при связи C11 = C12, но ее интенсивность в несколько раз меньше таковой при связи C13 = C14 . Поэтому можно утверждать, что возбуждающиеся колебательные моды в интермедиате KBR , как и в KKR2 способствуют обратной реакции фотоизомеризации по связи C13 = C14 . Полученные данные согласуется с результатами эксперимента по измерению квантовых выходов обратных реакций для бактериородопсина и зрительного родопсина, в которых квантовый выход для БР в пять раз выше квантового выхода для ЗР. Таким образом, установлено, что обратные реакции в родопсинах I типа протекают с более высокой степенью селективности, чем обратные реакции в родопсинах II типа, что может быть связано с собственными фотофизическими свойствами изомеров ретиналя в активных центрах интермедиатов. Так, в интермедиатах микробных родопсинов содержится 13-цис изомер, который в газовой фазе изомеризуется на порядок быстрее, чем полностью-транс изомер в газовой фазе, находящийся в интермедиатах животных родопсинов. II. Исследование влияния белкового окружения на величину сечения двухфотонного поглощения ретиналь -содержащих белков первого и второго типа В данном разделе работы было исследовано влияние белкового окружения выбранных родопсинов на сечение их двухфотонного поглощения, свойства, определяющего эффективность использования белков в оптогенетических исследованиях в режиме двухфотонного поглощения. Данный раздел работы является логическим продолжением предыдущего этапа, на котором были исследованы свойства KR2, ЗР и БР при однофотонном поглощении. С помощью комбинированного метода КМ/ММ в варианте XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP были рассчитаны компоненты средних дипольных моментов в начальном (S0) и конечном (S1) состояниях, а также компоненты дипольных моментов переходов между различными электронными состояниями для родопсинов KR2, ЗР и БР. Для изучения влияния белкового окружения были рассчитаны компоненты средних дипольных моментов в начальном (S0) и конечном (S1) состояниях, а также компоненты дипольных моментов переходов между различными электронными состояниями для следующих модельных систем: для изолированных хромофоров в газовой фазе в геометрии из родопсинов KR2, ЗР и БР, для изолированных квантовых частей родопсинов KR2, ЗР и БР. Установлено, что наличие противоионов в ближайшем белковом окружении РПШО оказывает сильное влияние на его фотофизические свойства. Так, энергия вертикального перехода значительно сдвигается в синюю сторону при переходе от изолированного хромофора к белковому окружению. Важно отметить, что наибольший синий сдвиг, который варьируется в диапазоне 0.5–0.8 эВ, во всех трех случаях наблюдается при учете только ближайшего окружения хромофора, входящего в КМ подсистему. Учет вклада электростатического поля всего остального белкового окружения, входящего в ММ подсистему, напротив приводит к небольшому красному сдвигу по сравнению с энергией вертикального перехода в КМ подсистеме. Белок КR2 обладает наименьшим синим сдвигом, что обусловлено наличием только одного противоиона, стабилизирующего заряд на РПШО в его ближайшем белковом окружении. Характер перехода S0 → S1 не меняется при переходе от изолированного хромофора к белковому окружению и характеризуется значительной степенью переноса заряда, о чем можно судить по изменению средних дипольных моментов начального и конечного. Изменения энергии вертикального перехода S0 → S1 и разности средних дипольных моментов происходят симбатно при переходе от изолированного хромофора (в геометрии из белкового окружения) к КМ части и далее ко всему белку: синий сдвиг сопровождается уменьшением величины Δμ10, и, наоборот, красный сдвиг ее увеличением. Это обусловлено стабилизацией основного состояния РПШО в белковом окружении из-за взаимодействия с первичным противоионом и характером перераспределения электронной плотности при возбуждении. Вычислены значения сечений двухфотонного поглощения при фотовозбуждении S0 → S1 в микробных и животных родопсинах, которые рассчитаны в рамках N-уровневых моделей при возрастании количества состояний N, которые входят в суммирование. Установлено, что аналогично результатам, полученным для флуоресцентных белков, начальное и конечное состояния при фотовозбуждении S0 → S1 дают наибольший вклад в сечение двухфотонного поглощения микробных и животных родопсинов, а значения сечений хорошо описываются при помощи двухуровневой модели TLM, которая включает только два канала, учитывающих постоянные дипольные моменты состояний S1 и S0, а именно 0 → 0 → 1 и 0 → 1 → 1. Обнаружено, что двухуровневая модель TLM может быть использована для данных белков, так как однофотонный переход S0 → S1 является ярким и сопровождается большим перераспределением электронной плотности. В рамках классического двухфотонного поглощения сечение зависит от разности средних дипольных моментов этих состояний, и установлена четкая корреляция между увеличением сечения двухфотонного поглощения и увеличением средних дипольных моментов при переходерис. В результате проведенных исследований установлено, что сильная зависимость величин сечения двухфотонного поглощения от локальной структуры активного центра родопсинов I и II типов связана с электростатическим полем белка и его влиянием на поляризацию электронной плотности хромофора РПШО в основном и электронно-возбужденном состояниях. Наибольшее значение наблюдается у микробного родопсина КR2 (610 ГМ), при этом величины сечений у родопсинов первого типа могут варьироваться в широких пределах в зависимости от структурного мотива активного центра белка и влияния ближайшего белкового окружения, в первую очередь, противоионов, стабилизирующих положительный заряд на хромофоре. Введение точечных мутаций в родопсины первого и второго типа, приводящих к сдвигу максимумов поглощения в более длинноволновую область, будут приводить к увеличению сечения двухфотонного поглощения. Влияние электростатического поля белка в родопсинах первого и второго типов противоположно влиянию белкового окружения на нелинейные фотофизические свойства хромофорной группы флуоресцентных белков из-за разной относительной поляризуемости возбужденного и основного электронных состояний хромофоров этих белков вдоль направления переноса заряда при их возбуждении. III. Исследование влияния мутаций на фотофизические свойства родопсинов Проведен обзор литературы с целью поиска закономерностей, влияющих на сдвиг спектра поглощения родопсинов. Установлено, что наличие полярных аминокислотных остатков вблизи β-иононового кольца приводит к смещению спектра поглощения родопсинов в более длинноволновую область. Установлено, что наличие отрицательно заряженных и полярных аминокислотных остатков вблизи протонированного основания Шиффа ретиналя приводит к смещению спектра поглощения родопсинов в более коротковолновую область. На основе обзора литературы выбраны мутации P219T и S254A для проверки их влияния на спектр поглощения родопсина KR2 на уровне теории XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP. С помощью молекулярно-динамического моделирования и комбинированного метода квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) получена уравновешанная КМ/ММ оптимизированная полная атомистическая модель мутантной формы родопсина KR2 с двумя мутациями P219T и S254A. С помощью метода XMCQDPT2/SA-CASSCF (12,12)/(aug)-cc-pVDZ в сочетании с методом EFP для КМ/ММ оптимизированной структуры мутантной формы родопсина KR2 была рассчитана энергия вертикального перехода и однофотонный электронно-колебательный спектр. Установлено, что введенные мутации смещают спектр поглощения в красную область по сравнению с родопсином KR2 дикого типа.
2 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. Разработка новых мутантных форм родопсинов для оптогенетики
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".