|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
"Повышение эффективности криоконсервации биологического материала для длительного хранения и транспортировки на дальние расстояния, в том числе в условиях космоса." (химический факультет)НИР
"Improving the efficiency of cryopreservation of biological material for long-term storage and transportation over long distances, including in space." (Chemistry Department)
- Руководители НИР: Овчинников М.А., Симоненко Е.Ю., Сыбачин А.В.
- Участники НИР: Белова Е.В., Генералов Е.А., Евсеев А.П., Иванова А.А., Коригодский А.А., Марченко О.М., Пигарева В.А., Спиридонов В.В., Яковенко С.А.
- Подразделение: Кафедра высокомолекулярных соединений
- Срок исполнения: 1 августа 2023 г. - 31 декабря 2025 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 23-Ш01-15
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Клеточные технологии
- Классификатор OECD: Химические науки
-
Ключевые слова:
липосомы, носители холестерина, полисахариды, криоконсервация, биобанкинг, радиационное излучение, криопротекторная среда, клеточная мембрана, космос
biobanking, polysaccharides, space, radiation, cryopreservation, cell membrane, cryoprotective medium, liposomes, cholesterol carriers -
Описание:
Сохранение генетического материала, в том числе в условиях бескрайнего космоса
-
Abstract:
Cryopreservation methods allow long-term storage of cells, tissues, seeds and biological objects at low temperatures (-100оС ÷ -270оС) in outer space conditions during long space missions. For successful cryopreservation it is necessary to study in detail: the physicochemical properties of cryoprotective media and their individual components; various freezing methods; the destructive influence of low temperatures and radiation of space conditions on the integrity of DNA and cell membranes; the influence of selected cryopreservation methods on cell proliferation, motility and viability. Despite the active development of cryopreservation methods, the survival rate of cell cultures with slow freezing methods remains low. The main causes of cell death are cold shock, osmotic shock, the formation of heterogeneous nucleation and crystal growth inside and outside the cells, as well as the toxic effect of components of the cryoprotective medium penetrating the cell. Damage to the membrane during storage and cryopreservation of cells is one of the most pressing problems. To stabilize the membrane and increase cell cryotolerance, controlled mechanisms for the delivery and incorporation of cholesterol into the phospholipid layer are required. Within the framework of the project, methods for optimal cryopreservation of biological material will be developed, taking into account various types of radiation effects (corresponding to space conditions and studied within the framework of this school project); The effect of cosmic radiation on DNA and membranes of frozen cells will be assessed. The project will compare different methods for assessing the concentration of cholesterol in the membrane and select the optimal one for use in real laboratory conditions; The role of cholesterol in the formation of cryotolerance, as well as the effect on the functional parameters of human spermatozoa, will be determined. The work will develop several methods for modifying the sperm membrane with cholesterol (using cyclodextrins; liposomes). Using a model liposome system, it is planned to determine the dependence of the fluidity of the lipid layer on the cholesterol concentration using the EPR method. Using X-ray diffraction analysis, the effect of adding cyclodextrins to a cryoprotectant solution on crystal formation will be determined (the sizes of the crystals being formed will be assessed). A mathematical model will be created that describes the mechanism of glycerol penetration into the cell (in a concentration corresponding to a real cryoprotective medium). The model will allow one to assess osmotic stress in cells and allow one to select the most effective cryopreservation regime. A systematic approach to the study of cryobiology will make it possible to transport biomaterial over long distances for a long time; will increase the survival of cells and tissues in space, as well as, if necessary, preserve the biomaterial of astronauts. Overall, space creates unique opportunities for cryobiology that need to be explored and exploited.
-
Планируемые результаты:
1. На основании полученных группой 1 ранее данных рентгеноструктурного анализа будет оценено влияние таких компонент, как ди- и полисахаридов на размеры формирующихся кристаллов в водных растворах глицеринов (базовых криопротекторах), а также подобраны наиболее оптимальные режимы заморозки (скорость, положение образцов). Данные выводы будут проверены на культурах клеток (с оценкой жизненных показателей, степени фрагментации ДНК, целостности мембраны) и проанализированы. Подобная работы была проделана группой 1 ранее для проникающих криопротекторов (группа 1). 2.Будет создана математическая модель, описывающая проникновение криопротектора в сперматозоид человека, которая позволит не только лучше понять механизмы, но и оценить изменения объемов клетки и влияние осмотического стресса для криопротекторных сред, применяемых в лабораториях. Модель будет валидирована по экспериментальным данным. По результатам исследований пунктов 1 и 2 будет предложен наиболее эффективный состав криопротекторной среды, снижающий область гетерогенного ядрообразования кристаллов и приближения к стеклоподобному состоянию, а также метод заморозки (скорость, положение биоматериала). 3. Будет проведено сравнение методов определения концентрации холестерина в мембранах сперматозоидов, предложен наиболее точный, но при этом наименее токсичный метод, реализуемый в клеточных лабораториях. На основе метода будет определена взаимосвязь концентрации холестерина в мембране клеток с их криотолерантностьтю (сравнение клеток здоровых доноров с доказанной высокой степенью криотолерантности с патологическими клетками пациентов и низкой криотолерантностью) - группы 1 и 2. 4.Ранее были проведены работы по модификации мембраны клеток яичным желтком. Работы показали эффективность такой модификации, однако для клеток человека использовать данный компонент запрещено. Поэтому будут разработаны методики стабилизации клеточной мембраны холестерином (компонентом желтка) для повышения выживаемости клеток в процессе заморозке-разморозки. Для этого будет проведен выбор оптимальных носителей холестерина (группы 1 и 2). 5. Одним из важных и принципиально новых результатов проекта станет получение биосовместимого полимер-коллоидного носителя с высокой ёмкостью по включению холестерина и оценка эффективности внедрения инкапсулированного в полимер-коллоидный носитель холестерина в мембраны сперматозоидов. В качестве таких носителей будут рассмотрены липосомы, модифицированные олигосахаридами и полисахаридами, а также мицеллы из биосовместимого и биоразлагаемого полилактида - группа 2. 6. Будет рассмотрено два ключевых подхода к включению холестерина в предлагаемые носители: включение холестерина в гидрофобную область липосом и мицелл, а водорастворимый полимер будет обеспечивать коллоидную стабильность частицам; и использование коллоидной частицы как центр концентрирования полимера, модифицированного холестерином, с целью повышения локальной концентрации холестерина при доставке его в мембраны сперматозоидов - группа 2. 7. На модельных системах липосом методом ЭПР будет определить зависимость текучести мембраны от соотношения фосфолипид:холестерин - группы 1 и 2. На основании исследований 3-7 будет предложен метод модификации клеток холестерином для стабилизации их мембраны при криоконсервации и повышении выживаемости. 8. Будут проведены приближенные к условиям естественной космической радиации экспериментальные исследования и теоретические расчеты радиационного воздействия пучков электронов и ионов для оценки их влияния на нативные клетки, криоконсервированный материал с различными составами криопротекторных сред, а также на клетки с модифицированными мембранами - техническая часть группа 3. 9. Будут подобраны параметры и проведено облучение нативного биологического материала с добавлением антиоксидантов в культуральную среду, а также предварительно криоконсервированного биоматериала на ускорительном комплексе HVEE-500. 10. Будет разработан дизайн эксперимента, подобраны параметры и проведены серии экспериментов на ускорителе кластерных ионов и масс-монохроматоре НИИЯФ МГУ с энергиями от десятков до сотен кэВ и флюенсами заряженных частиц до 1018 см-2 для экспериментальных исследований радиационного воздействия на биологически образцы (группа 3). Каждая научная группа, которая входит в данный проект, является специалистом в своей области. Группа 1 обеспечивает работу с культурами клеток, моделирование, эксперименты с криоконсервацией. Группа 2 специализируется на создании композитов из ноночастиц и полимерных матриц (например на основе альгинатов), а также магнитных наночастиц для адресной доставки химических соединений. Группа 3 обеспечивает имитирование радиационных условий космоса и исследование влияния радиации на замороженный материал биобанка. Данный проект позволит впервые объединить знания и опыт каждой научной группы для решения общей задачи криоконсервации биологического материала в том числе в условиях космоса.
-
Научный задел:
Имеется
-
Основные результаты:
В процессе получения
- Добавил в систему: Сыбачин Андрей Владимирович
Источник финансирования НИР
| МГУ имени М.В. Ломоносова, грантовый конкурс научных проектов НОШ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 августа 2023 г.-31 декабря 2023 г. | "Повышение эффективности криоконсервации биологического материала для длительного хранения и транспортировки на дальние расстояния, в том числе в условиях космоса." (химический факультет) |
| Результаты этапа: На первом этапе работы были синтезированы серии липосом из смеси катионного катионного липида- диолеоилокси(триметиламмоний) пропана (ДОТАП) и электронейтрального липида- диолеолифосфатидилхолина (ДОФХ) с мольной долей ДОТАП от 5 до 30 мол. %. Размер липосом задавался при синтезе, регулированием размера пор мембран экструдера 50 нм, 100 нм и 200 нм. Для работы в четвёртом квартале были выбраны серии липосом с долей ДОТАП 15 мол.% и 30 мол.%. Для модификации липосом были выбраны в качестве полисахарида – линейный альгинат натрия (АЛГ), и в качестве олигосахарида – карбоксиметил циклодекстрин (КМЦД). За формированием комплексов следили методами лазерного микроэлектрофореза, динамического светорассеяния и кондуктометрии. Эксперименты проводили в буфере Трис с рН 7 в отсутствии дополнительно добавленного NaCl и в присутствии 0.15 М NaCl, моделирующего физиологический раствор. Добавление к суспензии катионных липосом с 30 мол.% ДОТАП с исходным значением электрофоретической подвижности(ЭФП), отражающей поверхностный заряд, +5.2 (мкм/с)/(В/см) раствора АЛГ приводило к последовательной нейтрализации поверхностного заряда частиц вплоть до полной нейтрализации, а затем при дальнейшем добавлении АЛГ наблюдалась перезарядка поверхности комплекса до значения -2.0 (мкм/с)/(В/см). Для липосом с 15 мол.% ДОТАП исходное значение ЭФП составляло +3.2 (мкм/с)/(В/см). Добавление АЛГ к суспензии липосом также приводило к нейтрализации поверхностного заряда комплексов. Однако, концентрация АЛГ, требуемая для полной нейтрализации была в два раза ниже, чем для липосом с 30 мол.% ДОТАП. Таким образом, можно заключить, что взаимодействие ДОТАП/ДОФХ липосом с АЛГ носит электростатический характер, а молекулы ДОФХ не участвуют в формировании межфазного комплекса. Дальнейшее добавление АЛГ к липосомам с15 мол.% ДОТАП также приводило к перезарядке комплекса, а предельное значение ЭФП составило, как и в случае липосом с 30 мол.% ДОТАП, - 2.0 (мкм/с)/(В/см). Иными словами, прекращение адсорбции АЛГ на поверхность комплекса определяется не долей ДОТАП в исходной мембране липосом, а достижением предельного отрицательного заряда на поверхности комплекса, предотвращающего сорбцию АЛГ за счёт электростатического отталкивания. В качестве контроля были синтезированы липосомы, состоящие только из ДОФХ. Для таких липосом добавление АЛГ не приводило к изменению ЭФП комплекса, что свидетельствовало об отсутствии адсорбции АЛГ на поверхность электронейтральных липосом. Размеры формирующихся комплексов регистрировали методом динамического светорассеяния. Было обнаружено, что добавление раствора АЛГ к суспензии ДОТАП/ДОФХ липосом в независимости от доли ДОТАП в мембране приводило к формированию агрегатов в системе в процессе нейтрализации поверхностного заряда. При этом максимум агрегации соответствовал точке электронейтральности. Дальнейшее добавление АЛГ к суспензии комплексов приводило к дезагрегации системы. Для того, чтобы проанализировать, что представляет собой насыщенный комплекс ДОТАП/ДОФХ липосомы/АЛГ, а именно: стабилизированные полимером агрегаты или индивидуальные липосомы, покрытые слоем полимера- был проведён сравнительный анализ размеров исходных липосом и насыщенных комплексов для суспензий липосом одинакового липидного состава, но различающихся диаметром исходных везикул. Для ДОТАП/ДОФХ липосом 30 мол.% ДОТАП разница в гидродинамических радиусах комплексов (Rкомп) и исходных липосом (Rлип): ΔR = Rкомп-Rлип составила 25 нм как для липосом с диаметром 80 нм, так и для липосом с исходным диаметром 150 нм. Для ДОТАП/ДОФХ липосом 15 мол.% ДОТАП было установлено, что ΔR = 20 нм как для липосом с диаметром 90 нм, так и для липосом с исходным диаметром 140 нм. Таким образом можно заключить, что насыщенный комплекс имеет строение: единичная липосома, поверхность которой покрыта слоем АЛГ. Для того, чтобы оценить состав насыщенного комплекса ДОТАП/ДОФХ липосома/ АЛГ был использован метод контуктометрии. Добавление раствора АЛГ к суспензии липосом приводило к увеличению электропроводности системы, связанному с высвобождением противоионов, сконденсированных возле АЛГ и поверхности липосом. Формирование насыщенного комплекса приводило к изменению наклона кривой кондуктометрического титрования и формированию линейного участка, идущего параллельно калибровочной кривой для раствора АЛГ в отсутствие липосом. Оценка состава системы в точке перегиба на кондуктометрической кривой позволяет установить состав насыщенного комплекса. Для катионных липосом на одну молекулу ДОТАП в насыщенном комплексе в среднем приходится 1.5 карбоксильных групп АЛГ. Известно, что электростатические комплексы чувствительны к присутствию низколомелкулярных солей в системе и могут диссоциировать на исходные компоненты при повышении ионной силы раствора. Формирование комплексов ДОТАП/ДОФХ липосом с АЛГ исследовали в буфере Трис с рН 7.0 в присутствии 0.15 М NaCl. За комплексообразованием следили методом лазерного микроэлектрофореза, поскольку кондуктометрические измерения в присутствии 0.15 М NaCl проводить невозможно- регистрируемые изменения электропроводности при формировании комплекса на порядки меньше фоновых значений солевого раствора. В присутствии соли исходные значения ЭФП суспензии липосом с 30 мол.% ДОТАП и 15 мол.% ДОТАП составили +3.5 (мкм/с)/(В/см) и +2.1 (мкм/с)/(В/см) соответственно, что хорошо согласуется с теорией двойного-электрического слоя. Добавление АЛГ привело к сохранению закономерностей зависимостей ЭФП комплекса от концентрации добавленного АЛГ для обеих фракций липосом. Причём полная нейтрализация поверхностных зарядов липосом достигалась при тех же значениях концентрации АЛГ, что и в буфере без NaCl. Формирование комплексов в избытке АЛГ приводило к получению систем с ЭФП +1.1 (мкм/с)/(В/см), что также связанно с влиянием низкомолекулярного электролита на дзета-потенциал заряженной поверхности. Ёмкость липидной мембраны катионных липосом по холестерину (Хол) была оценена по способности смеси ДОФХ/ДОТАП/Хол формировать везикулы методом экструзии, применяемом в ходе данной работы для получения липосом, с сохранением доли ДОТАП 30 мол.%. Было установлено, что введение 40 мол.% Хол в мембрану позволяет обеспечить формирование везикул, в то время как введение более 50 мол.% приводит формированию суспензии, которая не подвергается экструзии с формированием малы моноламеллярных липосом, что, по-видимому, связано с изменением фазового состояния смешанной липидной мембраны. По материалам этапа подготовлена статья в журнал Macromolecular Symposia (на данный момент статья находится в стадии ответов на комментарии рецензентов). | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".