Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологииНИР

Development of the NMR methods and software for molecular pharmacology tasks

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 3 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии
Результаты этапа: 1. Методами ЯМР спектроскопии исследовано взаимодействие TEN домена с фрагментами нуклеиновых кислот, моделирующих фрагменты активного центра теломеразы. Получена информация о характере связывания TEN домена с фрагментами теломеразной РНК (TER), деломерных повторов ДНК, гетеродуплексов ДНК-РНК и их частично расплетенных аналогов. Установлено, что существует два центра связывания нуклеиновых кислот на поверхности TEN домена. Аминокислотные остатки белка, образующие кластер I, участвуют во взаимодействии с одноцепочечной РНК, РНК-ДНК гетеродуплексами и в меньшей степени с одноцепочечной ДНК. Кластер II специфически и с существенно более высокой аффинностью связывает РНК-ДНК вилку, моделирующую место стыка цепи ДНК на матричной теломеразной РНК. На основании полученных данных предложен механизм участия TEN домена в каталитическом цикле теломеразы дрожжей. Описанные результаты вместе со структурной информацией, полученной в ходе исследований 2016 года, послужили основой публикации в высокорейтинговом журнале Nucleic Acids Research (IF=10.162). 2. На основании анализа серии гетероядерных 3D спектров ЯМР выполнено полное отнесение сигналов белка Est3 теломеразы Hansenula polymorpha (синоним - Ogataea polymorpha. Отнесение химических сдвигов выполнено для 177 из 178 аминокислотных остатков белка (99.4%). Полный набор отнесения резонансов 1H, 15N, 13C’, 13Cα и 13Cβ белка получен для 97.4% остатков белка (исключая остатки пролина, где отсутствуют амидные протоны). Химические сдвиги атомов белковой цепи получены для 98.8% аминокислотных остатков. Полученные данные депонированы в международную базу данных химических сдвигов BioMagResBank (код BMRB-27146). 3. Информация об отнесении сигналов Est3 – компонента теломеразы из Hansenula polymorpha использована для идентификации элементов вторичной структуры белка. Установлено, что белок Est3 имеет достаточно сложную α,β-топологию (семь β-тяжей и пять α-спиралей). Эти результаты вместе с данными об отнесении сигналов Est3 опубликованы в журнале Biomolecular NMR Assignments (WoS, IF=0.459). 4. Проведен анализ спектров 13C-1H и 15N-1H HSQC-NOESY белка Est3. Получено отнесение для 2910 межъядерных расстояниях. Извлечены ограничения для 246 двугранных углов PHI и PSI аминокислотных остатков, находящихся в слабо подвижных участках молекулы. Полученные данные использованы для расчета структуры белка Est3 Hansenula polymorpha в растворе. 5. Начат расчет структуры Est3 методом молекулярной динамики с использованием ограничений на межъядерные расстояния и двугранные углы. Получены первые модели структуры белка в растворе. Установлено, что белок имеет топологию бета-бочки, окруженной пятью альфа-спиралями. На следующем этапе работы будет проведено уточнение конформационного ансамбля белка до получения структуры, соответствующей критериям высокого разрешения. 6. На образцах белка Est3 Hansenula polymorpha проведены эксперименты ЯМР по измерению скоростей продольной (T1) и поперечной (T2) релаксации ядер 15N и ядерных эффектов Оверхаузера 15N-1H. Выполнен анализ релаксационных данных с использованием программы RelaxFit, разработанной на предыдущих этапах выполнения проекта. Получена информация о характере молекулярных движений белковой цепи Est3 в шкале времени от пс до мс. Установлено, что первые 23 N-концевых аминокислотных остатков и 8 C-концевых остатков высоко подвижны. Имеются также области повышенной мобильности (движения в пс-нс шкале времени) и в составе белковой глобулы (а.о. 26-34, 120-130, 145-155). Установлено также, что большое количество аминокислотных остатков Est3 оказываются высоко мобильны в мс шкале времени, участвуя в конформационных обменных процессах. 7. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР исследовано взаимодействие Est3 Hansenula polymorpha с ГТФ и АТФ. Установлено, что в отличие от Est3 из дрожжей Saccharomyces cerevisiae аналог белка из термофильных дрожжей Hansenula polymorpha не обладает заметной АТФ/ГТФ-азной активностью. Можно сделать вывод о том, что наличие ГТФазной активности у аналога из Saccharomyces cerevisiae не связано с функциональной активностью Est3 в составе теломеразы. 8. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР исследовано взаимодействие Est3 Hansenula polymorpha c фрагментами теломеразной ДНК и TEN доменом основной каталитической субъединицы теломеразы. Установлено, что Est3 из Hansenula polymorpha не взаимодействует с теломерными повторами ДНК. Незначительно меняется характер взаимодействия фрагментов теломеразной ДНК и с двумя белками (Est3 и TEN). Так, не наблюдается образование прочного тройного комплекса двух белков и ДНК. Есть вероятность, что Est3 настроен на взаимодействие не с одноцепочечной ДНК, а с квадруплексными структурами, которые формируются G-богатыми теломерными повторами. Эту гипотезу планируется проверить на следующем этапе исследования. 9. Проведен анализ литературных данных и патентных заявок по известным ингибиторам теломеразы. Были собраны и проанализированы литературные данные и патентные заявки по соединениям, ингибирующим активность теломеразы. Среди них были выявлен ингибитор BIBR1532, для которого методом рентгеноструктурного анализа ранее была получена структура его комплекса с каталитической субъединицей жука Tribolium castaneum. 10. Трехмерная атомная модель каталитической субъединицы теломеразы Ogataea polymorpha сконструирована в онлайн-сервере I-Tasser. Значение C-оценки для наилучшей модели составило -0,31, что соответствует высокой достоверности полученной структуры. Структура с кодом 3DU6 была идентифицирована, как ближайший структурный гомолог рассчитанной модели с TМ-оценкой 0,833 и среднеквадратичного отклонения координат атомов 1,10 Å (доля аминокислотных остатков выровненных по структуре шаблона составила 0.846). Среднеквадратичное отклонение координат атомов боковых цепей остатков Asp472, Asp616 и Asp617 в модели каталитической субъединицы теломеразы Ogataea polymorpha от координат аналогичных остатков Asp251, Asp343 и Asp344 каталитической субъединицы теломеразы Tribolium castaneum составило 0.57 Å. 11. С целью поиска соединений – потенциальных ингибиторов основной каталитической субъединицы теломеразы (TERT) Из библиотеки компании InterBioScreen были отобраны лиганды, структурно схожие c известным ингибитором теломеразы BIBR1532 и отвечающие правилам Липински. Выбранные соединения были подвергнуты докингу в программе rDock в участок связывания BIBR1532 в теломеразе T. castaneum. Перед проведением докинга отобранных соединений была проведена валидация оценочной функции и алгоритма докинга в выбранном сайте связывания. Для этого была проверена способность программы rDock воспроизвести экспериментальную конформацию лиганда BIBR1532. Среднеквадратическое отклонение координат наилучшей по энергии конформации от экспериментальных составило 0.823 Å. В результате виртуального скрининга на основании рассчитанных значений оценочной функции и визуального анализа предсказанных мод связывания в качестве наиболее перспективного лиганда было выбрано соединение STOCK7S-39308. 12. Проведен виртуальный скрининг (докинг) низкомолекулярных соединений из библиотек InterBioScreen и ChemDiv с целью отбора потенциальных ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы. В докинге использовалась структура фермента с разрешением 1.36 Å (PDB код 3JWB). Расчеты проводились с помощью программы Algocomb, модифицированной на предыдущих этапах выполнения проекта. Для оценки подобия отобранных соединений структурам соединений-лидеров (С5 и А3), найденных на предыдущих этапах выполнения проекта, использовался комбинированный алгоритм в программе DataWarrior. В результате отобраны 12 соединений, имеющих наивысшие значения скоринговой функции и удовлетворяющие правилам Липински (табл. 4). Отобранные соединения закуплены для экспериментальных исследований. 13. На соединениях, отобранных по результатам докинга, проведены эксперименты STD, WaterLOGSY и INPHARMA по их связыванию с C. freundii метионин гамма-лиазой. Установлено, что наивысшей аффинностью из группы отобранных соединений – аналогов соединения лидера C5 обладают два соединения (Табл. 4, h4 и g3). Последующее измерение ингибирующих свойств найденных соединений по отношению к MGL в эксперименте in vitro показало, что h4 не обладает заметной ингибирующей активностью, а g3 имеет ингибирующие свойства на уровне соединения-лидера с5. 14. Проведены эксперименты STD и WaterLOGSY на бактериальной рибосоме с использованием в качестве модельных лигандов 3’,5’-AMP, D-триптофана и тринуклеотида ССА. Определены оптимальные экспериментальные параметры для наблюдения сигналов, характеризующие связывание лигандов с рибосомой. Установлено, что наиболее качественные результаты получаются при молярном соотношении концентраций лигандов к рибосоме порядка 3500:1. Определены оптимальные значения других параметров, необходимых для измерения спектров (концентрация рибосомы, температура, частота полосы насыщения сигналов мишени в спектрах STD и т.п.). Показана применимость экспериментов ЯМР для поиска соединений, связывающихся с рибосомой - мишенью мегадальтонного размера. 15. Получены образцы бычьего сывороточного альбумина и альбумина человека, содержащие спиновые метки на основе стабильного радикала TEMPO. Выход реакции присоединения спиновых меток составил 90% для 4-малеимидо-ТЕМПО и 73% для йодацетамидо-ТЕМПО в пересчете на белок. Лиофилизированные образцы модифицированных белков использованы для экспериментов ЯМР по детектированию лигандов, способных связываться с ними. 16. Проведены эксперименты STD, WaterLOGSY и спектры с T1ρ (T2)-фильтром на системах, содержащих модифицированный спиновыми метками альбумин и смесь модельных лигандов (триптофан и глюкоза). Установлено, что введение спиновых меток в бело незначительно изменяет интенсивность сигналов STD и WaterLOGSY. В то же время, эксперименты с T2-фильтром показали высокую эффективность при детектировании взаимодействия белок-линганд. Разработанная модификация эксперимента ЯМР с T2-фильтром, основанная на применении разностной спектроскопии, показала наибольшую эффективность при детектировании сигналов лиганда (триптофан), связывающегося с меченым стабильными радикалами альбумином. Наибольшая чувствительность метода была достигнута при модификации альбумина человека с помощью 4-Малеимидо –ТЕМПО. 17. На предыдущих этапах выполнения проекта были разработаны программы, написанные на языке Python, и предназначенные для модификации параметров силового поля по данным квантовохимических расчетов, анализа населенностей водородных связей на траектории молекулярной динамики, графического изображения изменений различных параметров системы в ходе молекулярно-динамических исследований. Разработанные подходы и программное обеспечение были использованы в исследованиях 2017 года для анализа траекторий молекулярной динамики ангеотензинпревращающего фермента в комплексе с пептидными лигандами. Описанными методами изучено конформационное поведение четырех различных тетрапептидных фрагментов цинк-связывающего домена бета-амилоида человека в активном центре ангиотензинпревращающего фермента. Полученные результаты описаны в статье, опубликованной в журнале Scientific Reports (IF=4.259). 18. В 2017 году было завершено начатое ранее исследование строения, конформационных и динамических свойств синтетических полипептидов пептидов из класса β-пролинов. Эти исследования проводились, в частности, при использовании программы анализа полной формы линии ЯМР и расчета динамических свойств Muses, разработанной на предыдущих этапах выполнения проекта. В отчете за 2015 год были представлены некоторые результаты этого исследования. Полученные результаты стали предметом статьи в журнале Frontiers in Chemistry (IF= 3.994). 19. 21 сентября 2017 года участником творческого коллектива Лизуновым А.Ю.была успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.01.02 «Биофизика». Тема диссертации «Учет внутрилигандных взаимодействий при докинге с оценочной функцией на основе усредненных потенциалов межатомного взаимодействия» имеет непосредственное отношение к настоящему проекту.
2 9 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии
Результаты этапа: Исследования, проведенные в 2018 году, выполнялись в соответствии с планом работ и были посвящены решению актуальных задач молекулярной фармакологии методами ЯМР и программными средствами, в том числе разработанными на предыдущих этапах выполнения проекта. Получен фрагмент 1-195 TEN-домена каталитической субъединицы теломеразы Tetrahymena thermophila. Измерение спектров гетероядерной корреляции 1H-15N этого белка показало, что он обладает существенно более низкой стабильностью в сравнении с аналогом из Hansenula polymorpha и склонен к агрегации. Указанные свойства не позволяют использовать методы ЯМР для определения его структуры и функциональных свойств. Методом ЯМР определена структура высокого разрешения в растворе белка Est3 теломеразы из Hansenula polymorpha. Для расчета структуры белка использовано 2262 ограничения на расстояния между протонами, полученными из анализа спектров NOESY, и 228 двугранных углов, полученных из анализа химических сдвигов атомов основной белковой цепи. Координаты атомов семейства из 20 структур ЯМР депонированы в банк белковых структур (PDB ID 6Q44). Белок Est3 содержит структурированное ядро (остатки 22 – 172), а также неструктурированные N- и C-терминальные хвосты. Ядро белка сформировано пятью β-листами и шестью α-спиралями. Структура центральной части белка имеет высокий уровень структурной гомологии с белком Est3 из Saccharomyces cerevisiae (PDB ID 2M9V) и теломерным белком человека TPP1 (PDB ID 2I46). Укладка белковой цепи Est3 имеет т.н. OB-фолд характерный для белков, связывающихся с олигосахаридами и/или олигонуклеотидами (например, TPP1). Проведен поиск вероятных партнеров Est3 по связыванию среди фрагментов ДНК и/или РНК, соответствующих вероятному окружению белка в теломеразном комплексе. Для мониторинга специфического белок-НК взаимодействия использовали Est3, обогащенный изотопом 15N, и методы гетероядерной корреляции 1H-15N. Исследования проводили как на системах Est3-НК, так и на тройных системах Est3-TEN-НК. В числе исследованных нуклеиновых кислот были фрагменты одноцепочечной РНК, одноцепочечной ДНК, квадруплексные структуры ДНК, РНК шпилька, РНК-ДНК гетеродуплексы, РНК-ДНК вилка. Во всех случаях специфического связывания Est3 с нуклеиновыми кислотами не наблюдали. Вероятно, оно происходит только в случае полностью собранного теломеразного комплекса, или же для взаимодействия Est3-НК необходим еще один белковый партнер (например, теломеразный белок Est1). Для ДНК аптамера RA-36 (ингибитор тромбина, 31 нуклеотидных остатков) изучены условия формирования квадруплексных структур в присутствии ионов калия и бария. RA-36 состоит из двух одинаковых фрагментов, каждый из которых способен образовывать G-квадруплексную систему из двух G-квартетов при действии одновалентных или двухвалентных ионов. Два фрагмента соединены коротким линкером из одного остатка тимидина. Формирование G-квартетов отслеживали по появлению характеристичных резонансов иминных протонов в области 10-12 м.д. Установлено, что присутствие ионов калия индуцирует образование одного из двух квадруплексов. При этом образуется конформационно подвижная система. В присутствии ионов бария формируются два G-квадруплекса и система становится конформационно жесткой. Изучение серии полинуклеотидов с одиночными заменами остатков гуанозина на инозин и тимидина на дезоксиуридин позволило сделать отнесение всех сигналов в спектрах ЯМР G-квадруплексных систем. Продолжены исследования возможностей использования методов ЯМР-скрининга для изучения взаимодействия низкомолекулярных лигандов с мишенями мегадальтонного размера, на примере бактериальной рибосомы. Установлено, что для таких больших мишеней эксперименты ЯМР могут быть информационно полезными лишь в довольно узком диапазоне величин Kd. Тем не менее, в условиях равновесия между свободными и связанными с рибосомой формами лигандов, можно наблюдать эффекты INPHARMA и ILOE, характеризующие взаимное расположение лигандов в сайте связывания. Методы ЯМР были использованы для определения структуры двух антибиотиков, найденных методами высокопроизводительного скрининга. В отчетный период проведены исследования по применению комплексов парамагнитных ионов лантанидов в экспериментах по ЯМР-скринингу. Такие комплексы вызывают парамагнитное усиление релаксации и псевдоконтактные сдвиги близкорасположенных сигналов белка и лигандов. Эти эффекты могут быть использованы для идентификации лигандов, способных связываться с белком. Синтезированы комплексы ионов гадолиния, диспрозия, европия и тербия. Получены образцы человеческого сывороточного альбумина (HSA), модифицированного комплексами лантанидов. Модифицированный белок использован в экспериментах ЯМР на модельной системе, содержащей L-триптофан и D-глюкозу. Показано, что сигналы триптофана, связывающегося с HSA, уширяются в случае модификации белка комплексами, содержащими гадолиний. При использовании HSA, модифицированного комплексами диспрозия, индуцирующего псевдоконтактные сдвиги, в спектрах ЯМР наблюдаются изменения химических сдвигов некоторых сигналов триптофана. Эти эффекты могут быть использованы для получения структурной информации о положении лиганда по отношению к парамагнитной метке, связанной с белком. Написана и отлажена импульсная последовательность для измерения профиля дисперсии релаксации сигналов 1Н лигандов, находящихся в равновесии между свободной и связанной с биомишенью формами. Эксперименты по дисперсии релаксации позволяют определить скорость диссоциации лиганда из комплекса с мишенью. Оптимизированы условия проведения эксперимента ЯМР с использованием спинового замка. Проведены измерения на тестовой системе, содержащей L-триптофан и бычий сывороточный альбумин, а также на найденных на предыдущих этапах выполнения проекта ингибиторах метионин гамма-лиазы. Проведено теоретическое исследование по оценке качества структур биомолекул, определенных методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ЯМР. Отобраны наборы структур из PDB, определённых этими методами. Разработан способ описания распределения атомов на поверхности молекулы белка. Написана программа для вычисления поверхности, доступной растворителю на уровне отдельных атомов белковых структур. Разработан и реализован в виде компьютерной программы способ сравнения распределений атомов на поверхности различных групп белковых структур. Показано значимое отличие в распределении атомов на поверхности структур белков, определённых методами РСА и ЯМР. Найдено теоретическое объяснение причины этого различия. Также показано, что структуры ЯМР имеют в среднем более рыхлую укладку, чем структуры РСА. В 2018 году опубликован обзор по методам ЯМР-скрининга, представляющий результаты проведенных исследований и современные достижения мировой науки в этой области. Три статьи находятся в редакциях журналов на различных стадиях рецензирования или внесения изменений после получения замечаний рецензентов. Все журналы, в которых опубликованы или рассматриваются работы, реферируются WoS, Scopus и РИНЦ и находятся в первой квартиле (Q1) списка WoS. Успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по тематике настоящего проекта. Члены трудового коллектива принимали участие в работе трех международных конференций и пяти международных или российских научных школ.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".