ИСТИНА

На побережье Белого моря в результате постгляциального поднятия некоторые заливы отделяются от моря и превращаются в лагуны и прибрежные озера. Сток с водосбора и осадки постепенно опресняют поверхностный слой, тогда как в нижней части водоема сохраняется морская вода, что приводит к вертикальной стратификации, вплоть до меромиксии. Меромиктические водоемы представляют собой интересный феномен. В пределах одного водного объекта существует несколько экологических сообществ, расположенных одно под другим и связанных потоками вещества и энергии. В верхнем слое воды сообщество аналогично таковым в голомиктических водоемах соответствующего региона. Нижний слой, не охваченный вертикальной циркуляцией слой, в силу изоляции от атмосферы и накопления автохтонных и аллохтонных органических веществ, нередко лишен кислорода, там формируется сообщество анаэробных организмов с главенствующей ролью бактерий. Между ними располагается хемоклин, на который приходится максимум продуктивности за счет аноксигенных фототрофных бактерий. Созданную ими первичную продукцию потребляют гетеротрофные и миксотрофные протисты. В экосистеме таких водоемов определяющую роль играют микроорганизмы. Однако комплексное изучение структуры и функций микробиоценоза не является тривиальной задачей. Микроскопические водоросли определяют альгологи, бактерий изучают микробиологи с иным инструментарием и методами, исследования гетеротрофных протистов ограничены редкостью специалистов и их специализацией по отдельным группам (инфузории, амебы, жгутиконосцы). Применяемые разными специалистами методы имеют ограничения и не позволяют охарактеризовать сообщество в целом. Отчасти решить данную проблему позволяет ДНК метабаркодинг, основанный на высокопроизводительном секвенировании маркерного гена или его фрагмента с последующей идентификацией таксонов в сообществе вплоть до вида. Данная методика также имеет свои ограничения, связанные с многоэтапной и длительной процедурой, а также отсутствием в базе данных маркерных последовательностей ДНК многих таксонов, ранее описанных по морфологии. Компенсировать ограничения разных методов может комплексный подход, сочетающий традиционную идентификацию фототрофных и гетротрофных протистов методами световой и сканирующей микроскопии, оценку пигментов фототрофов спектрально-оптическими методами и ДНК метабаркодинг, позволяющий охарактеризовать состав сообщества по маркерным генам. Данный проект нацелен на характеристику таксономического состава разных компонентов микробиоты, включая фототрофных, гетеротрофных и миксотрофных протистов, а также прокариот стратифицированного водоема отделяющегося от Белого моря на основе комплексного подхода объединяющего методы микроскопии, спектроскопии и ДНК метабаркодинга. В России до настоящего времени методы ДНК метабаркодинга применялись в отношении единичных стратифицированных водоемов для оценки сообществ прокариот, и вовсе не использовались для характеристики сообществ протистов. В результате впервые стратифицированный водоем отделяющийся от Белого моря будет охарактеризован как единая система взаимодействующих микробных сообществ. Впервые будут получены взаимосвязанные данные о составе и метаболическом потенциале сообществ бактерий, а также таксономическом составе сообществ протистов в разных слоях, что позволит описать трофические взаимоотношения между разными компонентами экосистемы в целом. Дополнительно данные ДНК метабаркодинга можно использовать для предсказания функциональных генов и потенциальных метаболических путей в сообществе прокариот (точность 80-100% по сравнению с метагеномным анализом).

On the coast of the White Sea due to post-glacial uplift, some bays separate from the sea and turn into lagoons and coastal lakes. Watershed runoff and precipitation gradually desalinate the surface layer, while seawater remains in the lower part of the reservoir, which leads to vertical stratification, up to meromixis. Meromictic reservoirs are an interesting phenomenon. Within one water body, there are several ecological communities located one below the other and connected by flows of matter and energy. In the upper water layer, the community is similar to those in holomictic lakes of the corresponding region. The lower layer, which is not involved in vertical circulation is often deprived of oxygen due to isolation from the atmosphere and the accumulation of autochthonous and allochthonous organic substances; a community of anaerobic organisms with the leading role of bacteria is formed there. Between them there is a chemocline, which accounts for the maximum productivity due to anoxygenic phototrophic bacteria. Their primary production is consumed by heterotrophic and mixotrophic protists. Microorganisms play a decisive role in the ecosystem of such reservoirs. However, a comprehensive study of the structure and functions of microbiocenosis is not a trivial task. Microscopic algae are determined by algologists, bacteria are studied by microbiologists with another tools and methods, studies of heterotrophic protists are limited by the rarity of specialists and their specialization in certain groups (ciliates, amoeba, flagellates). The methods used by different specialists have limitations and do not allow one to characterize the community as a whole. This problem can be partly solved by DNA metabarcoding based on high-throughput sequencing of a marker gene or its fragment, followed by identification of taxa in the community up to the species level. This technique also has its limitations associated with a multistage and lengthy procedure, as well as the absence in the database of marker DNA sequences of many taxa previously described by morphology. The limitations of different methods can be compensated by an integrated approach that combines the traditional identification of phototrophic and heterotrophic protists by light and scanning microscopy, the assessment of phototrophic pigments by spectral optical methods, and DNA metabarcoding, which makes it possible to characterize the composition of the community by marker genes. This project is aimed at characterizing the taxonomic composition of various components of the microbiota, including phototrophic, heterotrophic and mixotrophic protists, as well as prokaryotes of a stratified reservoir separating from the White Sea based on an integrated approach that combines the methods of microscopy, spectroscopy and DNA metabarcoding. In Russia, up to now, DNA metabarcoding methods have been applied to single stratified water bodies to assess prokaryotic communities, and have not been used at all to characterize protist communities. As a result, for the first time, a stratified water body separating from the White Sea will be characterized as a single system of interacting microbial communities. For the first time, interconnected data will be obtained on the composition and metabolic potential of bacterial communities, as well as the taxonomic composition of protist communities in different layers, which will make it possible to describe the trophic relationships between different components of the ecosystem as a whole. Additionally, DNA metabarcoding data can be used to predict functional genes and potential metabolic pathways in the prokaryotic community (80-100% accuracy compared to metagenomic analysis).

Организована и проведена экспедиция на Беломорскую биостанцию МГУ в марте 2024 г. для проведения гидрологических измерений в пяти водоемах, отбора зимних проб фитопланктона, выполнения спектрально-оптических измерений. В отчете по проекту будут вертикальные профили всех измеренных параметров во всех водоемах, спектры поглощения света на разной глубине, вертикальное распределение бактериохлорофиллов. Организован и проведен семинар для участников проекта. Его планируется провести в апреле 2024 в г. Санкт-Петербург в рамках ежегодной конференции «Герценовские чтения» в РПГУ им. Герцена. Участники проекта сделают сообщения, что будет отражено в программе конференции и, по желанию докладчиков – опубликованы в сборнике материалов конференции. Экспедиционные работы для наблюдений за гидрологическими характеристиками, спектрально-оптическими параметрами воды и сезонной сукцессией фитопланктона в течение безлёдного периода в выбранном модельном водоеме. Гидрологические наблюдения - не реже, чем 1 раз в месяц. В отчет войдут профили всех измеренных параметров. Отбор проб фитопланктона - не реже 1 раза в месяц по 1 пробе из основных зон водоема (каждая съемка - не менее четырех проб). К концу года первые 1-2 съемки будут обработаны, данные войдут в годовой отчет и будут доложены на ежегодной осенней конференции “MARESEDU-2023” в Институте океанологии (Москва). Проведена комплексная экспедиция для совместного отбора проб фитопланктона, гетеротрофных простейших для микроскопирования и для метабаркодинга в модельном водоеме. Результат – пробы фитопланктона, зафиксированные формалином, доставленные в Москву на кафедру гидробиологии Биологического факультета МГУ для дальнейшей обработки. Пробы с простейшими и, фильтры с микроорганизмами, хранящиеся в жидком азоте, либо выделенная из них ДНК в консерваторе DNA-Shield доставлены в Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург) для дальнейшей обработки. Пробы ДНК просеквенированы, получены таблицы с последовательностями для дальнейшей биоинформатической обработки. На ежегодной конференции MARESEDU-2024 в Институте океанологии РАН – не менее 3 докладов. Не менее 1 статьи подготовлено и сдано в печать в издание, индексируемое в WoS или Scopus.

Исследования беломорских прибрежных стратифицированных водоемов на базе Беломорской биологической станции МГУ начались в 1990-х годах, с 2010 г. их организует руководитель данного проекта Е.Д. Краснова. В распоряжении коллектива база данных обо всех изученных за это время водоемах. В результате этих наблюдений определены особенности многолетней гидрологической динамики пяти водоемов в окрестностях Беломорской биостанции МГУ и одного водоема в губе Ковда. Выявлена типовая структура водоемов, отделяющихся от моря, закономерности изменений донной фауны. Результаты этих исследований описаны во множестве публикаций. В комплексных исследованиях беломорских меромиктических водоемов участвует научная группа с кафедры общей физики физического факультета МГУ, которая проводит спектрально-оптические измерения, нацеленные на идентификацию фотосинтезирующих микроорганизмов спектральными методами, с особым вниманием к мало изученным аноксигенным фототрофным бактериям. В данном проекте участвует аспирантка кафедры А.А. Жильцова, участница множества экспедиций, автор и соавтор большого количества совместных статей. Совместно с доцентом каф. гидробиологии Биологического факультета МГУ к.б.н. И.Г. Радченко, начаты исследования фитопланктона. Прослежена сезонная сукцессия фитопланктона в двух водоемах, выявлены общие закономерности изменений таксономического состава, биомассы, трофического статуса. Совместно с сотрудниками Центра коллективного пользования Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (ИКВС УрО РАН, г. Оренбург) начато изучение протистов соленых озер, возглавленное руководителем Центра коллективного пользования «Персистенция микроорганизмов» ИКВС УрО РАН А.О. Плотникова. Получены представительные списки простейших из оз. Кисло-Сладкого, проанализировано биоразнообразие в разных слоях, сопоставлены результаты метагеномного анализа и прямого микроскопирования проб.

С целью изучения таксономического состава и взаимодействия микроорганизмов в сложной многослойной экосистеме прибрежного меромиктического водоема, отделившегося от моря в результате послеледникового поднятия берега, применен комплексный подход, включающий натурные гидрологические измерения, определение спектрального состава света на разной глубине, определение пигментов доминирующих фототрофов спектрально-оптическими методами, идентификацию одноклеточных эукариот методами световой и электронной микроскопии, ДНК-метабаркодинг простистов и прокариот. Полный комплекс исследований применен для модельного меромиктического озера, которое характеризуется наибольшей гидрологической стабильностью – озера Трехцветное. В трех водоемах на разных стадиях изоляции, включая оз. Трехцветное, изучена структура фитопланктона: таксономический состав, численность, углеродная биомасса, вертикальное распределение. Отслежена сезонная сукцессия. Выделены сообщества, соответствующие гидрологическим зонам. Проанализировано влияние абиотических факторов на распределение и сезонную динамику структуры сообщества. Выявлены закономерности, универсальные для прибрежных стратифицированных водоемов: 1) максимум биомассы водорослей в области восходящего диффузионного потока биогенных элементов над границей с сероводородной зоной; 2) сезонная смена преобладающего типа питания фитопланктона по характерной для Белого моря схеме: с автотрофного в ледовый период и в начале лета на гетеротрофный в конце лета и осенью; формирование в зоне хемоклина к концу вегетационного сезона сообщества с хищной динофлагеллятой Oxyrhis marina в качестве вида-эдификатора. Впервые получены данные о видовом разнообразии не только автотрофных, но и гетеротрофных, а также миксотрофных протистов в арктических полуизолированных водоемах с использованием световой и электронной (трансмиссионной и сканирующей) микроскопии. Локальная фауна и флора в базе данных «Каталог биоты Беломорской биостанции МГУ» пополнились 96 видами протистов. Больше половины (64 вида) из оз. Трехцветное, 22 из оз. Кисло-Сладкое, еще 9 были найдены в обоих озерах. 49 видов оказались новыми для Беломорского региона и один – новым для науки. Полученный список включает как широко распространенные виды, так и редкие и малоизученные. Некоторые имеют древнее происхождение, другие представляют собой предковые формы крупных клад, позволяющие установить генеалогические связи между ними, третьи обладают уникальными приспособлениями к экстремальным местообитаниям. Оз. Трехцветное может стать источником редких культур для будущих исследований. Вертикальная структура сообществ протистов в оз. Трёхцветное устойчива на протяжении многих лет. В пробах, отобранных в разные годы с одного горизонта, состав протистов имел большее сходство, чем в пробах с разных горизонтов, взятых одновременно. Выделено четыре сообщества: 1) в миксолимнионе, для него специфичны два вида динофлагеллят, 1 диатомея и три вида золотистых водорослей; все – широко распространенные пресноводные виды; 2) в верхнем этаже градиентной зоны – самое богатое сообщество; 3) в нижнем этаже хеомклина – сообщество с преобладанием инфузорий, эвгленовых, солнечников и бесцветных жгутиконосцев; 4) в сульфидной зоне сообщество с анаэробным жгутиконосцем Carpediemonas, обладающим гидрогеносомами вместо митохондрий. Пигментный состав планктона на разной глубине анализировали для экспресс-оценки состава фототрофов, сравнения их количества, а также для сопоставления со световыми спектральными нишами, которые различются на разной глубине и в разных водоемах. С помощью оригинального математического метода, специально разработанного для анализа сходства/различия спектров за несколько лет, мы выяснили, что самой большой межгодовой изменчивостью характеризуется оз. Кисло-Сладкое. В нем пигментный состав похож только в периоды с устойчивой стратификацией при гиперцветении криптофитовых водорослей Rhodomonas в хемоклине за за счет имеющегося в них фикоэритрина. В оз. Еловое выявлены Хл а и β-каротин в поверхностном пресном слое, аллоксантин криптофитовых в пресном и части соленого, фикоцианин-С криптофлагеллят вблизи хемоклина, Бхл d и e в смеси с Хл а в верхней части хемоклина, а под границей сероводородной зоны ‒ только Бхл зеленоокрашенных зеленых серобактерий (ЗСБ). Вертикальное распределение этих таксонов хорошо согласуется со световым климатом на разной глубине. Спектральный диапазон света во всех озерах с глубиной сужается из-за поглощения УФ и синего света растворенным органическим веществом, а ИФ и дальнего красного – водой, в соленой воде этот эффект сильнее. В ряду «Кисло-Сладкое – Еловое – Трехцветное» содержание РОВ возрастает, поэтому спектральные ниши в них разные. В оз. Кисло-Сладкое на границе фотической зоны, которая проходит в хемоклине, зеленая спектральная ниша благоприятна для криптофитовых водорослей с фикоэритрином 545 и антенным хлорофиллом с. В аналогичной зоне оз. Еловое спектральная ниша желто-оранжево-красная, и ее занимали криптофлагелляты с фикоцианинами. В оз. Трехцветное до хемоклина доходит лишь 0,1% светового потока и доминирует красный свет, который эффективно улавливают фототрофы с зелеными пигментами, в том числе – зеленоокрашенные ЗСБ, способные фотосинтезировать при слабом освещении благодаря плотной упкаовке Бхл в хлоросомах. По концентрации Бхл выполнили количественную оценку ЗСБ. Концентрацию Бхл определяли спектрофотометрически и рассчитывали по формуле, разработанной специально для экстрактов в смеси растворителей ацетон:этанол, с которой мы предпочитаем работать по соображениям техники безопасности. Построены вертикальные распределения пигмента. Впервые сделана оценка суммарного количества Бхл в толще воды оз. Трехцветное в разные сезоны. Показано, что в хемоклине концентрируется от 20% зимой до 40% летом всей массы Бхл в толще озера. В более глубоких слоях концентрация Бхл практически не меняется в течение года. Суммарная концентрация Бхл в хемоклине почти втрое возрастала от апреля к августу, после чего вдвое уменьшилась к октябрю. Экспериментальное исследование влияния температуры и облучения УФ и синим светом на флуореценцию бактериохлорофиллов ЗСБ показало, что в живых клетках с увеличением температуры до 35ºС (для Бхл d зеленоокрашенных ЗСБ) и до 50ºС (для Бхл e коричневоокрашенных) интенсивность флуоресценции возрастала, но при более высоких температурах происходили необратимые изменения в фотосинтетическом аппарате. При облучении клеток ЗСБ ультрафиолетом или синим светом флуоресценция Бхл постепенно уменьшалась; в пробах с высокой концентрацией H2S она снижалась медленнее (за десятки минут), тогда как в клетках из верхней части хемоклина «выгорание» флуоресценции Бхл происходило быстрее. От глубины и связанных с ней параметров (солености, солнечной освещенности, температуры воды и др.) у мономерной формы Бхл (в экстрактах) флуоресценция не зависела. В рамках данного проекта впервые была проанализирована вертикальная структура и разнообразие сообществ микроорганизмов в арктическом меромиктическом озере с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликона 18S рДНК (для протистов) и 16S ДНК (для прокариот) с использованием платформы Illumina MiSeq в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. В оз. Трёхцветное выявлено 1136 вариантов ампликонов протистов, относящихся к 14 отделам, 58 классам, 110 порядкам и 138 родам. Выявлены доминирующие виды и их вклад в общий пул ампликонов на разных горизонтах. Доминирующими группами были гетеротрофы и паразиты. Паразитические организмы были наиболее многочисленны в миксолимнионе, гетеротрофы достигали максимального обилия на границе с хемоклином. Фотавтотрофы демонстрировали тенденцию к увеличению доли с глубиной, что контрастирует с типичным распределением в большинстве водоемов, где их максимум обычно приходится на поверхностные, хорошо освещенные слои. Сопоставление списков таксонов фототрофных эукариот, идентифицированных в оз. Трехцветное с помощью световой микроскопии, электронной микроскопии и метабаркодинга (по морфологическим и генетическим данным) показало, что комбинация этих методов дает более полную характеристику фитопланктонного сообщества, чем каждый метод по отдельности. Результаты продемонстрировали принципиальную согласованность данных. Дополнительно к данным микроскопии с помощью метабаркодинга были выявлены или уточнены 57 массовых видов фитопланктона, ранее определенных лишь до рода. Согласно оценке тотального биоразнообразия прокариот методом ДНК-метабаркодинга по V4 – V5 региону 16S рДНК в оз. Трехцветное выявлен 831 вариант последовательности ампликона организмов из доменов Bacteria и Archaea. Идентифицировано 40 филумов, 71 класс, 140 отрядов, 203 семейства и 279 родов. Анализ альфа- и бета-разнообразия показал, что состав сообществ прокариот сильно различается в зависимости от гидрологической зоны. Наибольшее видовое богатство отмечено в монимолимнионе, наименьшее - в хемоклине. Сообщества прокариот сгруппировались в три кластера, соответствующих гидрологическим зонам водоема. По составу сообщества прокариот, определенному по гену 16S рРНК, охарактеризованы метаболические пути прокариотных сообществ в пределах каждого слоя и оценка вероятных трофических связей в экосистеме в целом с использованием программы PICRUSt2. В оз. Трехцветное установлено 169 кодов «KO», связанных с метаболическими путями, на основе базы данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). В миксолимнионе преобладали процессы энергетического метаболизма, обмен аминокислот, липидов, углеводов, пути биосинтеза вторичных метаболитов. Над хемоклином доминировали процессы, задействованные в фотосинтезе и метаболизме серы. Фотосинтез был более активен в миксолимнионе (оксигенный) и хемоклине (аноксигенный). В монимолимнионе доминировали процессы метаболизма серы и метана, темновой фиксации углерода. Основные пути метаболизма азота были представлены в хемоклине и монимолимнионе. Процессы деградации различных веществ активнее протекали в хемоклине. Функциональная система оз. Трехцветное формируется несколькими вертикальными градиентами. Различия в солености воды определяют меромиктическую структуру с пресным миксолимнионом, где обитают пресноводные организмы, солоноватым хемоклином, подходящим для пресноводных видов с широким диапазоном галотолерантности, солоноватоводных и морских; в соленом монимолимнионе аэробные эукариоты отсутствуют. Кислород, поступающий в поверхностный слой воды из атмосферы, и сероводород из монимолимниона, образованный бактериями-сульфатредукторами, создают градиент окислительно-восстановительного потенциала с границей на глубине 2 м. До этой границы доходит свет, и под ней развиваются аноксигенные фототрофы, в данном случае – ЗСБ, а поскольку свет красный, то зеленоокрашенная форма. В монимолимнионе условия олиготрофные, в анаэробной зоне – гипертрофные за счет деструкции органики и многолетнего накопления биогенных элементов, в хемоклине восходящая диффузия биогенов обеспечивает массовую вегетацию фототрофов, как оксигенных (выше редокс-перехода), так и аноксигенных (в восстановительных условиях. С глубиной меняется и световой климат, от поверхностного горизонта с максимальной освещенностью и широким спектральным диапазоном, который позволяет вегетировать требовательным к свету золотистым водорослям, через желто-оранжево-красный миксолимнион, благоприятствующий зеленым водорослям и криптофитовым с фикоцианином, до очень слабого полностью красного света над хемоклином, доступного только ЗСБ. С такой зональностью хорошо согласуются бактериальные метаболические пути. В миксолимнионе происходит фотосинтез с фиксацией CO2, углеводный обмен и метаболизм основных компонентов живой материи. Ближе к хемоклину световые условия ухудшаются и процессы оксигенного фотосинтеза сменяются активностью аноксигенного, а также усиливается метаболизм веществ, участвующих в клеточном дыхании. В сульфидной зоне, которая служит рефугиумом анаэробного бактериального сообщества, аналогичного тому, которое существовало на Земле в Архее до появиления в атмосфере кислорода, преобладают пути метаболизма серы и метана, а также фиксация углерода, вероятно – хемотрофная. В придонной зоне с сильно восстановительными условиями – максимум активности метаболизма азота.