ИСТИНА

Сурфактин – это циклический липопептид, продуцируемый бактериями рода Bacillus. Он обладает очень высокой поверхностной активностью – поверхностное натяжение воды снижается с 72 до 27 мН/м при концентрации сурфактина всего 0,005% (Cameotra et al., Biosurfactants, 2010, 261). Благодаря этому, сурфактин демонстрирует большой потенциал применения в различных областях промышленности (например, пищевой, косметической, нефтяной и сельскохозяйственной), а также противоопухолевое, антимикробное и тромболитическое действие (Seydlová, Svobodová, Central European Journal of Medicine, 2008, 3, 123; Chen et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2022, 38, 143). Однако сложность получения сурфактина, обусловленная особенностями его структуры, и, как следствие, высокая стоимость ограничивают повсеместное использование этого ПАВ. В настоящий момент промышленное получение сурфактина основано на микробиологическом синтезе, однако эффективность его биосинтеза запатентованными штаммами-продуцентами недостаточно велика. Одной из возможных причин этого является слишком большое количество существенных генно-инженерных модификаций,вносимых в геном бактерий для получения штаммов-продуцентов. Столь серьезное вмешательство в метаболизм клетки может нарушить работу основных систем ее жизнедеятельности, что в результате приводит к неспособности нормально функционировать. Научной проблемой, на решение которой направлен проект, является поиск альтернативных, более щадящих путей индуцированной экспрессии сурфактина. Решение этой задачи позволит существенно повысить количество получаемого вещества и, тем самым, способствовать снижению его себестоимости.

Surfactin is a cyclic lipopeptide that is one of the most powerful surfactants with biological origin. Due to the high value of surface activity, surfactin has a wide range of potential applications in such fields as pharmaceuticals, cosmetics and food processing, oil extraction and soil bioremediation (Santos et al., Journal of Toxicology and Environmental Health Part B, 2018, 21, 382). The use of surfactin is limited by its high cost. Its chemical synthesis is not cost-effective. Producer strains of the genus Bacillus are used for surfactin production, but the amount of substance they secrete is not very high. Finding new ways of induced expression of surfactin is an actual task. One way to influence the expression of a large number of genes simultaneously is to change the number of global transcription regulators in the cell. The subject of our research is small non-coding 6S RNA, capable of competing with gene promoters for binding to the holoenzyme RNA polymerase and influencing its transcription (Wassarman, in book "Regulating with RNA in Bacteria and Archaea", Ed. Storz and Papenfort , 2018, 355). In the bacterium Bacillus subtilis (B. subtilis), which is the subject of this study, two 6S RNA are encoded: 6S-1 and 6S-2. Both are capable of binding to the holoenzyme RNA polymerase. Knockout of 6S-1 and 6S-2 RNA genes does not change the pattern of cell growth under standard conditions (Hoch et al., Biochimie, 2015, 117, 87). There are data in the scientific literature that suggests the involvement of small non-coding 6S RNAs in the regulation of biosynthesis in B. subtilis cells. Thus, the maximum number of copies of 6S-1 RNA per cell is reached in the stationary growth phase, (Steuten, RNA Вiology, 2014, 11, 508), which coincides with the promoter activity of the srfA. This gene encodes the subunits of surfactin synthase (Guan et al., Microbial Сell Factories, 2015, 14, 1). The role of 6S-2 in the process of formation of biofilm in B. subtilis cells is shown (Thüring et al., RNA Biology, 2021, 18, 79). The efficiency of surfactin biosynthesis is related to this process (Mielich‐Süss et al., Environmental Microbiology, 2015, 17, 555). The preliminary data obtained by our scientific team, demonstrating transcription activation of srfA operons’ genes in the absence of 6S-1 RNA, also support the hypothesis we have suggested and were a prerequisite for setting a completely new scientific task. Thus, the main objective of the project is to clarify the role of small non-coding 6S-1 and/or 6S-2 RNA in the biosynthesis of surfactin in B. subtilis cells. No such studies have been carried out before. To solve this problem, we will use the cell lines available to us with 6S-1 and/or 6S-2 RNA gene deletions of two strains, isolated from the soil NCIB 3610 and PY79 used for laboratory research. Within the project we also intend to assess the effects of 6S-1 and 6S-2 RNA not only on the transcription efficiency of the srfA operon, encoding surfactin synthase, but also on the transcription of the genes of other cellular systems related to biosynthesis of surfactin (using transcriptional analysis). Optimal cultivation conditions will be chosen for the most promising cell line, ensuring maximum yield of this surfactant. The efficiency of surfactin synthesis is planned to be evaluated by methods of colorimetric analysis and HPLC. The results obtained by us will make it possible to significantly advance in the fundamental understanding of the molecular mechanism of surfactin biosynthesis and to use the obtained information to create a new system of its induced expression.

В ходе выполнения проекта ожидается получить следующие результаты. 1. Определить влияние нокаута гена 6S-2 РНК, а также обоих генов 6S-1 и 6S-2 РНК одновременно в штаммах NCIB 3610 и PY79 B. subtilis на уровень транскрипции генов оперона srfA, кодирующего субъединицы сурфактин-синтетазы. Сравнить эти результаты с экспериментальными данными, полученными в наших предварительных исследованиях для 6S-1 РНК. Это позволит решить фундаментальную задачу – выяснить роль каждой из 6S РНК в природном, выделенном из почвы и используемом в лабораторных исследованиях штаммах B. subtilis, соответственно, в биосинтезе сурфактина. 2. Разработать методики по полуколичественному и количественному определению сурфактина в культуральной жидкости бактерий. Это даст возможность оценить эффективность биосинтеза сурфактина не только в имеющихся клеточных линиях, но и в потенциальных штаммах-суперпродуцентах, которые могут быть получены в дальнейшем. 3. С помощью методов биоинформатического анализа выявить различия в геномах штаммов PY79 и NCIB 3610 B. subtilis, имеющих разное происхождение. Это позволит объяснить различия в эффективности транскрипции оперона srfA, кодирующего сурфактин-синтетазу, наблюдаемые нами в предварительных экспериментах для штаммов PY79 и NCIB 3610 дикого типа. 4. Установить влияние одной из 6S РНК на системы жизнедеятельности клетки, сопряженные с биосинтезом сурфактина. Для этой цели выполнить транскриптомный анализ того мутантного штамма (с нокаутом гена только 6S-1 РНК/с нокаутом гена только 6S-2 РНК/с нокаутом генов 6S-1 и 6S-2 РНК одновременно), который демонстрирует наибольшую эффективность биосинтеза сурфактина и, как следствие, наибольший потенциал промышленногоиспользования. 5. Исходя из данных литературы выявить гены, кодирующие белки-регуляторы транскрипции оперона сурфактинсинтетазы (активаторы и ингибиторы), а также белки, вовлеченные в функционирование клеточных систем, связанных с биосинтезом сурфактина. 6. Подобрать оптимальные условия роста, в том числе состав питательной среды, обеспечивающие наибольшее количество секретируемого сурфактина лучшей клеточной линией B. subtilis с точки зрения эффективности биосинтеза этого ПАВ. 7. На основе полученных данных будет предложена стратегия конструирования штамма-суперпродуцента сурфактина.Принимая во внимание потенциал сурфактина как поверхностно-активного и лекарственного средства, а также широкий спектр потенциальных сфер применения, создание бактериального штамма с индуцированной экспрессией этого вещества позволит не только существенно понизить стоимость уже существующих промышленных товаров и препаратов на его основе, но и откроет пути по внедрению сурфактина в новые отрасли производства, а также уменьшит уровень загрязнения окружающей среды поверхностно-активными соединениями, получаемыми химическим синтезом.

Нашей научной группой были получены предварительные данные, демонстрирующие активацию транскрипции генов, отвечающих за биосинтез сурфактина в клетках B. subtilis при делеции гена 6S-1 РНК. В качестве объектов исследования были использованы те же штаммы B. subtilis, с которыми предполагается работать в рамках обсуждаемого проекта – PY79 и NCIB 3610. В этих штаммах с помощью ОТ-кПЦР был определен уровень транскрипции трех первых генов srfAA, srfAB и comS оперона srfA в клетках дикого типа и с нокаутом гена 6S-1 РНК. Согласно полученным данным, уровень транскрипции генов оперона srfA в нокаутных клетках примерно в 3-4 раза выше, чем в клетках дикого типа. Данный эффект является общим для обоих штаммов, что говорит о достоверности и значимости полученных результатов. Также стоит отметить, что эффект наблюдается только в стационарной фазе роста, что согласуется с профилями экспрессии как 6S-1 РНК, так и оперона srfA в клетках B. subtilis. Так как все гены внутри оперона srfA находятся под контролем одного промотора, мы предположили, что 6S-1 РНК влияет на транскрипцию всего оперона, кодирующего субъединицы сурфактин-синтетазы и, следовательно, может играть важную роль в регуляции биосинтеза сурфактина.