ИСТИНА

B-клетки играют важную роль в развитии и патогенезе как системных, так и орган-специфических аутоиммунных заболеваний. Аутореактивные B-клетки не только продуцируют аутоантитела, но также способны эффективно представлять специфические аутоантигены Т-клеткам. Кроме того, В-клетки могут секретировать провоспалительные цитокины и усиливать патологические процессы саморазрушения. Терапия, при которой происходит селективная элиминация патогенных аутореактивных В-клеток, потенциально может стать универсальным подходом для лечения многих аутоиммунных заболеваний. Стоит отметить, что существующая на сегодняшний день терапия аутоиммунных заболеваний путем практически полного элиминирования В-клеток моноклональным анти-CD20/19 антителом Ритуксимаб (Rituximab), приводит к системным побочным явлениям, и явно требует значительного пересмотра. В данном исследовании будет создан репертуар генетически сконструированных молекул-киллеров В-клеток, которые специфически действуют только на один тип В-лимфоцитов, несущий соответствующий В-клеточный рецептор. Будут сконструированы иммунотоксины, слитые с В-клеточными эпитопами основного белка миелина (ОБМ), и основанные на константном домене антитела IgG.

На первом этапе выполнения проекта у трех групп животных: мышей линии SJL/J, C57/BL6, и крыс линии DA удалось развить экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). У животных произведен отбор крови, сыворотки крови проанализированы на наличие антител к основному белку миелина (МВР), и определен уровень иммуноглобулинов к МВР. Подтверждена прямая корреляция между степенью проявления симптомов ЕАЕ и титра аутоантител к МВР. Показано, что уровень иммуноглобулинов к основному белку миелина в сыворотке крови мышей линии SJL/J с индуцированным EAE значительно выше, чем у мышей линии C57/BL6 с EAE и крыс линии DA c ЕАЕ. В контрольных сыворотках иммуноглобулинов к МВР не обнаруживается. Исследована специфичность аутоантител с помощью сконструированной функциональной «эпитопной библиотеки», соответствующей полноразмерному MBP и представляющей собой 12 перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином. Определены фрагменты МВР – потенциальные эпитопы аутореактивных В-клеток по связывающей активности поликлонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови мышей линии SJL, развивающих EAE. Уровни аутоантител к фрагментам MBP 25-54 (3), MBP 65-132 (6-8) и 145-170 (12) в сравнении с контрольным белком-носителем были достоверно выше в сыворотке крови мышей EAE SJL. Предполагается, что основной сайт связывания сывороточных антител мышей с индуцированным ЕАЕ целиком включает в себя последовательность пептида 7 (TQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPS), а также C-концевую последовательность пептида 6 (QDENPVVHFFK) и N-концевую последовательность пептида 8 (FKNIVTPRTPPPSQG). Для дальнейших исследований выбраны следующие фрагменты ОБМ: пептиды 3, 7, 11, 12 и их укороченные варианты, и на их основе созданы генетические конструкции, кодирующие эти фрагменты, слитные с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов мыши. Плазмидные ДНК, содержащие корректные последовательности интегрированных пептидов ОБМ, использовали для дальнейшей трансфекции клеток CHO и получения стабильных клонов-продуцентов рекомбинантных молекул. На втором этапе выполнения проекта подобраны оптимальные условия трансфекции клеток линии СНО генетическими конструкциями, проведена селекция антибиотиком полученных трансфектом СНО и дальнейшее расклонирование методом предельных разведений. Получены моноклональные линии клеток-продуцентов выбранных фрагментов основного белка миелина, слитных с константными фрагментами иммуноглобулинов мыши. Выбраны клоны-продуценты и подобраны условия для максимальной эффективности и стабильности экспрессии целевых рекомбинантных белков. Проведена криоконсервация наиболее эффективных клонов-продуцентов. Рекомбинантные молекулы иммуноглобулинов мыши, слитные с фрагментами основного белка миелина наработаны в препаративных количествах. Для выделения индивидуальных белков проведена двухстадийная очистка рекомбинантных белков. Проанализирована степень гомогенности очищенных молекул, полученные рекомбинантные белки были изучены рядом физико-химических методов, в том числе масс-спектрометрией, проведено определение N-концевой последовательности. Проведен анализ их функциональной активности in vitro на бесклеточных системах с помощью гибридизации очищенных молекул с анти-ОБМ антителами методом Вестерн-блоттинга и ИФА. Для подтверждения возможности активации каскада системы комплемента методом ИФА, определена степень связывания полученных белков с C1q-компонентом системы комплемента в сравнении с полноразмерными антителами. Показано, что созданные рекомбинантные белки взаимодействуют с молекулой C1q со сравнимой аффинностью. На последнем этапе выполнения проекта на бесклеточных системах с антителами класса IgG из сыворотки больных мышей было показано, что фрагмент ОБМ в составе рекомбинантной молекулы эффективно гибридизуется с антителами, связывающими полноразмерный ОБМ и его фрагменты из библиотеки его эпитопов. Методом проточной цитофлуориметрии было доказано, что при введении цитотоксических молекул происходит уменьшение количества популяции В-клеток, специфичных к ОБМ, по сравнению с общим количеством В-лимфоцитов. Созданные рекомбинантные молекулы были использованы для проведения терапии ЕАЕ в мышах линии SJL/J. Эффективность терапии оценивалась по шкале интенсивности развития симптомов патологии. Было обнаружено, что цитотоксические молекулы 7MBP-Fc и 12MBP-Fc обладают значительным терапевтическим эффектом, превосходящим препарат Copaxone. Показано, что введение данных молекул не только более эффективно подавляет развитие симптомов ЕАЕ, но и приводит к полному выздоровлению животных после стадии первичного обострения.