ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
В проекте будут исследованы структурные и молекулярные особенности белок-белковых и липид-белковых взаимодействий ключевых актинсвязывающих белков. Эта фундаментальная проблема является весьма актуальной, так как многие актинсвязывающие белки до сих пор не закристаллизованы и их атомная структура не известна. Для изучения структуры и конформационных изменений будут использованы современные аналитические методики. На основании разработанного нами ранее комплексного подхода, включающего методики криогенной микроскопии и биоинформатики планируется осуществить трехмерную реконструкцию структуры актинсвязывающих молекул и рассчитать их псевдо-атомную структуру. Научная новизна планируемых исследований состоит в том, что будут получены данные, раскрывающие на молекулярном уровне не изученные прежде специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками, их лигандами, актином и липидами. После опубликования, эта информация может быть применена для планирования экспериментов по направленному мутагенезу с целью идентификации функционально значимых участков в молекулах актинсвязывающих белков-мишеней лекарственных средств.
The project will explore the structural and molecular features of protein-protein and lipid-protein interactions of key actin-binding proteins. This fundamental problem is highly relevant, since many actin-binding proteins have not yet been crystallized and their atomic structure is not known. To study the structure and conformational changes will be used modern analytical techniques. Based on the complex approach developed by us earlier, including cryogenic microscopy and bioinformatics techniques, it is planned to carry out a three-dimensional reconstruction of the structure of actin-binding molecules and calculate their pseudo-atomic structure. The scientific novelty of the planned studies is that data will be obtained that reveal, at the molecular level, the previously unknown specific interactions between actin-binding proteins, their ligands, actin and lipids. After publication, this information can be used to plan experiments on directed mutagenesis in order to identify functionally significant sites in the molecules of actin-binding target proteins of drugs.
В данной работе мы планируем получить впервые трехмерные (3D) структуры актинсвязывающего комплекса Arp2/3 с Gmf и другими инактиваторами (арпин, Crn). Для оценки свободной энергии связывания инактиваторов с Arp2/3 комплексом мы применим метод молекулярной динамики. Для построения профиля свободной энергии будет использован метод зонтичного сэмплирования (umbrella sampling). С его использованием свободная энергия может быть вычислена из потенциала средней силы, рассчитываемого для серии конформаций, получаемых в результате молекулярной динамики. Для определения структур высшего порядка, формируемых F-BAR белками на мембранах и определения трехмерной структуры полноразмерного Nwk, мы используем метод ПЭМ с негативным контрастированием. Введение точечных мутаций позволит определить аминокислотные остатки, участвующие в межбелковом взаимодействии и взаимодействии с активаторами (например с Dap160 (1)). Мы впервые получим 3D реконструкцию полноразмерного Srv2 комплекса, которая в сочетании с томографическими исследованиями и результатами молекулярного моделирования позволит построить молекулярную модель полноразмерного человеческого комплекса CAP. Для интерпретации полученных структурных данных мы планируем разработать методику интеграции данных ПЭМ с известными данными по атомной структуре АСБ. Для интеграции данных будут использованы методы молекулярной динамики с использованием параллельных суперкомпьютерных вычисления для релаксации предварительных структур комплексов (будет использован программный пакет GROMACS 4.6 (2) и суперкомпьютер МГУ «Ломоносов»), методы гибкого докинга (3), основанные на методе молекулярной динамики, позволяющие проводить деформацию молекулярных структур белков, вписывая их в экспериментальную электронную плотность. Возможность взаимной интеграции классического метода электронной микроскопии с современными вычислительными техниками для расчета трехмерной структуры комплекса, а так же для молекулярного моделирования структуры, позволяет существенно ускорять и удешевлять определенные этапы исследования объектов.
Группа структурной биотехнологии под руководством д.б.н. О.С. Соколовой успешно реализовывала несколько проектов по структурной биологии в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы», в создании опережающего научного задела и совершенствовании элементов научной инфраструктуры в области исследования структуры и функций белковых молекул.
Про поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Эти белки были выбраны для исследования в связи с тем, что 1) они являются ключевыми для функционирования цитоскелета, а значит и поддержания формы и обеспечения движений клетки; 2) они имеют отношение к различным процессам сборки и разборки актиновых филамент в клетке. Это особенно важно в связи с тем, что взаимодействие цитоскелета и мембраны определяет характер движений и изменения формы эукариотической клетки в процессе ее морфогенеза. Нарушения в подвижности клеток приводят к драматическим последствиям для всего организма. Все запланированные исследования по проекту были выполнены полностью и в срок. За прошедшие 4 года получены новые данные, раскрывающие на молекулярном уровне специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками, их лигандами и липидами. Исследования проводили с использованием разработанного нами комплексного подхода, включающего в качестве основного, но не единственного метода просвечивающую электронную микроскопию, а также электронную томографию, молекулярное моделирование, флуоресцентную микроскопию, TIRF, молекулярно-биологические и биохимические методы. По результатам работ опубликованы статьи в журналах с высоким импакт-фактором, защищены: диссертация на соискание степени к.б.н. по специальности «биофизика» и диплом специалиста на биофаке МГУ имени М.В,Ломоносова. Результаты докладывались на международных конференциях.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов |
Результаты этапа: При финансовой поддержке РНФ были исследованы трехмерная структура и функции актинсвязывающих белков: CAP, Nwk и сравнены с другими белками, Syndapin и Pinkbar. Были впервые получены трехмерные структуры N-концевого олигомера белка CAP и полноразмерного белка Nwk. Nervous Wreck (Nwk) – белок, регулирующий траффик рецепторов роста в нервно-мышечном синапсе у дрозофилы. В своем составе он содержит F-BAR домен, взаимодействующий с липидной мембраной и изгибающий её и два SH3 домена. Параллельно с деформацией мембраны происходит перестройка актиновых филаментов. Согласованность этих событий лежит в основе образования филоподий, движения клетки, эндо- и экзоцитоза и многих других клеточных процессов. Nwk отличается от других белков тем, что даже в автоингибированном состоянии он способен взаимодействовать с полярной липидной мембраной, хотя и с более низким сродством. В результате работы по проекту нами была предложена модель, объясняющая авторегулирование Nwk. Мембранно-дефомирующая активность F-BAR белка Nwk может авторегулироваться его C-концевыми SH3 доменами за счет электростатических взаимодействий. Основной эффект авторегуляции выражается в ингибировании возможности мембраны формировать изгибы в отсутствии белковых структур более высокого порядка. Комплекс CAP является одним из широко распространенных эукариотических актинсвязывающих белков, играющим основную роль в организации цитоскелета клетки. N-концевой домен комплекса CAP взаимодействует с аденилатциклазным комплексом, и участвует в формировании клеточного ответа путем активации Ras-белков. С-концевой домен белка CAP связывает мономеры актина и участвует в сборке- разборке актинового филамента. Мы опубликовали впервые трехмерную структуру белка N-CAP в Journal of biological chemistry и продемонстрировали, что мышиный N-CAP, как и его гомолог из дрожжей Srv2, является гексамером. В присутствии N-CAP также наблюдали усиление в 8 раз разрезания актиновых филаментов. Было высказано предположение, что структура и функции N-концевого фрагмента Srv2/CAP являются консервативными у разных видов. Взаимодействие N-CAP с F-актином изменяет параметры спирализации филамента, что ведет к дестабилизации и, в конечном итоге, к разрушению актинового филамента. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов |
Результаты этапа: 1) С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изучено трехмерное строение комплексов актинсвязывающего белка Arp2/3 с инактиваторами арпином и Gmf1 1. Впервые получены 3D реконструкции комплекса Arp2/3 с инактивирующими лигандами арпином и Gmf1 1. Разрешение реконструкций составило 22А (согласно объемной корреляции Фурье). 2) Для определения мест связывания инактиваторов с субъединицами Arp2/3 были рассчитаны разностные трехмерные изображения путем вычитания электронной плотности свободного Arp2/3 комплекса из Arp2/3 комплексов с арпином и Gmf1 1. Получены структурные доказательства, что для каждого изученного ингибитора существует два пространственно-разделенных сайта связывания на поверхности комплекса Arp2/3. 3) Для более подробного изучения взаимодействий комплекса с инактиваторами проводили структурно-динамический анализ взаимодействий Arp2/3 комплекса с инактиватором Gmf1 1 в двух сайтах связывания методом молекулярной динамики. Были охарактеризованы новые гидрофобные интерфейсы сайтов связывания Gmf1 (I и II). Также в ходе динамики были показаны количественные и качественные изменения водородных связей между Gmf1 1 и Arp2/3. Методом зонтичного сэмплирования было проведено исследование энергии взаимодействия Gmf1 1 1и Arp2/3 комплекса, вычисленная средняя величина энергии взаимодействия составила 330,5 кДж/моль. 4) Были продолжены исследования полноразмерного белка Nervous wreck (Nwk). Получена трёхмерная реконструкция полноразмерного Nwk в автоингибированной конформации. Сравнение этой реконструкции с ранее созданной реконструкцией Nwk на липидной мембране, содержащей заряженные липиды, показало, что связывание с липидами вызывает значительные конформационные изменения в полноразмерном белке. 5) С помощью метода электронной томографии и фитинга получена трехмерная модель полноразмерного актинсвязывающего комплекса Srv2. Показано, что полноразмерный комплекс является гексамером, который стабилизируетcя суперспиральным доменом на N-конце. 6) Разработан подход для изучения взаимодействия белков с липосомами с применением крио-ПЭМ. 7) По результатам исследований опубликовано 6 работ, включая 3 статьи в рецензируемых журналах и 3 тезисов, опубликованных в FEBS Journal. Результаты докладывались на международных конференциях. Был с отличием защищен диплом специалиста на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ на тему «Инактивация Arp2/3 комплекса белком арпином». Подготовлен материал для опубликования на сайте Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (www.msu.ru). | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов |
Результаты этапа: 1. Изучены структурные и динамические основы инактивации Arp2/3 комплекса лигандами Gmf, Crn1 и арпином. Получены структурные доказательства, что для каждого изученного ингибитора существует два пространственно-разделенных сайта связывания на поверхности комплекса Arp2/3. Методом молекулярной динамики охарактеризованы новые гидрофобные интерфейсы сайтов связывания Gmf1 и арпина. Продемонстрирована эволюционная стабильность механизмов инактивации. Статья принята к публикации в JМB (IF=4.333), другая – подготовлена к публикации. 2. Изучены структурные и динамические основы модификации белком Nwk мембран с разным составом Получена впервые 3D реконструкция полноразмерного F-BAR белка Nwk, ассоциированного с липидным монослоем. Показаны впервые конформационные перестройки при автоингибировании Nwk. Предложена модель, объясняющая авторегулирование Nwk С-концевым доменом SH3. Опубликованы три статьи: в Cell reports (IF=7.87), PNAS (IF=9.423), обзор по F-BAR белкам в Acta Naturae (IF=1.77). 3. Получена впервые 3D реконструкция и построена молекулярная модель полноразмерного комплекса Srv2/CAP с помощью комплексного метода, включающего электронную томографию, молекулярное моделирование, моделирование по гомологии и электронную микроскопию макромолекул. Показано, что полноразмерный комплекс является гексамером, стабилизированным N-концевыми OD-доменами; при этом каждый C-концевой домен организован в виде мономера и ассоциирован не более, чем с одним G-актином. Показана эволюционная стабильность структуры и консервативность функций различных доменов комплекса, включая новую функцию разрезания актиновых филаментов. Опубликована статья в JBC (IF=4.573), еще одна статья подготовлена к публикации. 4. Разработаны методические подходы для исследования взаимодействия белков с липосомами с помощью крио-ПЭМ и молекулярного моделирования. Предложен механизм внутриклеточного контроля за моделированием мембраны BAR-доменами. Опубликованы три статьи: в CTC (IF=1.545), PCCP (IF=4.449), Биофизике (IF=0.593); еще одна статья подготовлена к публикации. 5. Разработаны методические основы интеграции данных ПЭМ с данными об атомной структуре АСБ. Построена псевдо-атомная модель полноразмерного белка Nwk, которая показала, что расположение SH3 доменов у Nwk отличается от такового у гомологичных F-BAR-белков. Построена псевдо-атомная модель полноразмерного белка CAP/Srv2 на основе данных томографии и докинга. Предложена модель взаимодействия полноразмерного белка CAP/Srv2 с F-актином и кофилином в клетке. 6. Создан научный задел для будущих исследований по тематике “Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов”. 7. Защищены диссертация на соискание степени к.б.н. по специальности «биофизика» на тему «Регуляция динамики мембран F-BAR-доменным белком Nervous wreck» и диплом специалиста по специальности «биофизика» на тему «Инактивация Arp2/3 комплекса белком арпином». Подготовлен материал для опубликования на сайте Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (www.msu.ru). | ||
4 | 2 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов |
Результаты этапа: При поддержке РНФ на молекулярном уровне изучали специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками и другими элементами цитоскелета, а также их лигандами. Впервые с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием образцов получена структура полноразмерного белка танкираза-1 с разрешением 22А и определены его конформационные изменения при взаимодействии с лигандом арпином. На примере дрожжевого белка Hof1, гомологичного белку млекопитающих PSTPIP1, была впервые исследована двойная функция белка при определении полярности клетки: N-концевой домен формирует направленные актиновые тяжи, соединяющие клетку дрожжей с дочерней клеткой при почковании, и в тоже время SH3-домены этого белка взаимодействуют с формином и ингибируют нуклеацию лишних филаментов. Это подтверждается результатами SIM-микроскопии, показывающей, что при нокауте гена Hof1, в клетке образуется большое количество хаотично расположенных актиновых тяжей. Таким образом, в клетке нарушается везикулярный транспорт. Проведено измерение механических свойств (модуля Юнга) фибробластов крысы с нокаутированным геном белка промежуточных филаментов виментина методом наноиндентации с помощью атомно-силового микроскопа. По сравнению с контрольными клетками, клетки без виментина оказались более мягкими. Высказано предположение, что роль виментиновых промежуточных филаментов в миграции клеток связана с их способностью стабилизировать клеточную полярность. По результатам исследований опубликовано 4 работы, 2 статьи приняты к публикации. Результаты докладывались на международных конференциях | ||
5 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Комплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов |
Результаты этапа: 1) Определена функция белка Танкиразы (TNKS1) в перестройке актинового цитоскелета при миграции клеток. Показано, что TNKS1 является основным функциональным партнером для ингибитора Arp2/3-комплекса Арпина и способствует его мембранной ассоциации. 2) С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изучены проекционные и трехмерные структуры ULF-фрагмента виментиновых промежуточных филаментов. Разрешение 3D реконструкции составило 15Å (согласно объемной корреляции Фурье). Для интерпретации реконструкции использована кристаллическая структура тримера фрагмента виментина (код в базе Protein Data Bank - 4YV3). 3) Для измерения механических свойств мигрирующих клеток с использованием метода АСМ разработана новая модельная система с использованием клеток, растущих на рельефной подложке. Измерена жесткость (модуль Юнга) на лидирующем и хвостовом краях фибробластов. Выдвинута гипотеза, что виментин отвечает за жёсткость лидирующего края в мигрирующих фибробластов. 4) Опубликованы трёхмерные реконструкции комплексов полноразмерного F-BAR белка Hof1 с C-концевой частью формина Bnr1, а также комплексов отдельных доменов этих белков. Для создания 3D модели комплекса Hof1 с C-Bnr1 было использовано 4650 частиц, для 3D модели F-BAR-домена c FH2-доменами ‒ 3500 частиц. 5) При построении начальных 3D моделей методом RCT (случайного конического наклона) в программе EMAN 2.1 работа велась с парами частиц (в каждой паре - одна и та же частица, снятая под разными углами). Для улучшения моделей использовалась программа Relion-2.0. Итоговые реконструкции получены без наложения симметрии (тип С1), разрешение реконструкций составило 10Å. 6) С помощью программы UCSF Chimera известные кристаллические структуры F-BAR-домена Hof1 (код 4WPE в Protein Data Bank) и FH2-домена Bnr1 (код 1UX5 в Protein Data Bank) вписаны в созданные 3D реконструкции. В результате была предложена модель, в которой концевые участки F-BAR-домена Hof1 перекрывают актин-связывающие сайты FH2-доменов Bnr1 и, таким образом, ингибируют Bnr1-зависимую сборку актиновых филаментов. 7) С помощью просвечивающей электронной микроскопии впервые показано, что белок Hof1 может взаимодействовать с септинами и индуцировать объединение их в пучки. Получены впервые проекционные структуры актиновых филаментов, взаимодействующих с септиновыми пучками при посредстве белков Hof1. 8) Изучены основы взаимодействия белка Abp1 (фактор нуклеации II типа) с Arp2/3 комплексом. Опубликованы 3D структуры Arp2/3-комплекса - свободного (разрешение 18Â) и с Abp1 (разрешение 21Â). Координаты структур депонированы в базу данных EMDB (EMD-4267, EMD-4268, EMD-4269). На основе структурного исследования предложена схема формирования и стабилизации ветвей актина при взаимодействии Arp2/3-комплекса с Abp1. Высказано предположение, что Abp1 может иметь две независимые функции в регуляции динамики комплекса Arp2/3: а) стимуляция |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".