Новый класс препаратов для рациональной терапии социально-значимых заболеваний печени человека на основе гликоконъюгатов тритерпеноидов и тканеспецифических лигандовНИР

New classes of drugs for liver deseases based on triterpenoid glycoconjugates

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 10 июля 2017 г.-7 июля 2018 г. Синтез гликоконъюгатов тритерпеноидов и их первичное тестирование
Результаты этапа: Результаты по первому этапу проекта: 1) Синтезированы азидопроизводные N-ацетилгалактозамина, специфичные к связыванию с асиалогликопротеиновому рецептору и способные к селективной конъюгации с биоактивными молекулами с помощью методов клик-химии. Итого 3 моносахарида. 2) Получены предшественники конъюгатов тритерпеноидов на основе бетулина и бетулиновой кислоты, содержащие в себе остатки гексиновой кислоты (1 или 2 остатка). Итого 6 предшественников. 3) Синтезированы моно- и бивалентные конъюгаты бетулина и бетулиновой кислоты и азидопроизводных N-ацетилгалактозамина. Всего 9 конъюгатов. 4) Все полученные соединения охарактеризованы с использованием методов спектроскопии ЯМР и ИК, ВЭЖХ и масс-спектрометрии выского разрешения. 5) Осуществлен докинг гликоконъюгатов бетулина в активный сайт связывания АСГП-рецептора. Выявлены оптимальные параметры структур с рекомендациями для последующего синтеза.
2 10 июля 2018 г.-30 июня 2019 г. Анализ фармакологических свойств гликоконъюгированных тритерпеноидов
Результаты этапа: Пентациклические тритерпеноиды (далее по тексту – ТТ) относятся к одному из наиболее перспективных и исследуемых классов растительных метаболитов. Согласно литературным данным, они обладают множественной биологической активностью – противоопухолевой, антимикробной, противовирусной, антидиабетической, противопаразитарной и т.д. [Paduch R., Kandefer-Szerszen M. Antitumor and antiviral activity of pentacyclic triterpenes //Mini-Reviews in Organic Chemistry. – 2014. – Т. 11. – №. 3. – С. 262-268; Podolak I., Janeczko Z. Pharmacological activity of natural non-glycosylated triterpenes //Mini-Reviews in Organic Chemistry. – 2014. – Т. 11. – №. 3. – С. 280-291]. В то же время существенные недостатки фармакологического профиля большинства нативных терпенов и их полусинтетических производных не позволяет использовать имеющийся терапевтический потенциал в полной мере [Zhou M. et al. Prodrugs of triterpenoids and their derivatives //European journal of medicinal chemistry. – 2017. – Т. 131. – С. 222-236]. Ключевую роль в этом играют низкая растворимость и метаболическая устойчивость [JC Furtado N. A. et al. Pentacyclic triterpene bioavailability: an overview of in vitro and in vivo studies //Molecules. – 2017. – Т. 22. – №. 3. – С. 400]. В результате особую актуальность приобретают работы по созданию систем адресной доставки тритерпеноидов к биомишеням. Известно, что придание адресных свойств молекулам позволяет существенно повысить стабильность в физиологических условиях, локализовать активную концентрацию в мишени, снизить системную токсичность и эффективную дозу препарата, как следствие уменьшить число или степень проявляемых побочных эффектов [Ivanenkov Y. A. et al. Development of liver cell-targeted drug delivery systems: experimental approaches //Russian Chemical Reviews. – 2017. – Т. 86. – №. 8. – С. 750]. Настоящий проект посвящен разработке ковалентных систем адресной доставки пентациклических тритерпеноидов в печень за счет получения селективных конъюгатов к асиалогликопротеиновому рецептору на поверхности гепатоцитов [Huang X., Leroux J. C., Castagner B. Well-defined multivalent ligands for hepatocytes targeting via asialoglycoprotein receptor //Bioconjugate chemistry. – 2016. – Т. 28. – №. 2. – С. 283-295]. Согласно опубликованным в литературе работам, выбранные объекты исследования (бетулин, бетулиновая, урсоловая, олеаноловая и глицирретиновая кислоты) проявляют значительную активность в отношении социально-значимых заболеваний печени, среди которых гепатоклеточная карцинома (далее – ГЦК), малярия, вирусный гепатит С, сахарный диабет и др. [M. Lange et al. // Biochemical Pharmacology, V. 118, P. 9–17 (2016); Y. Cai et al. // Mol. Pharmaceutics, V. 13, P. 699–709 (2016) и др.]. Учитывая высокую общую смертность для перечисленных болезней, выполняемый проект имеет высокое значение в рамках современной высокоэффективной рациональной медицины. Согласно предложенному плану работу на втором этапе проекта предстояло осуществить оптимизационный синтез предложенных гликоконъюгатов ТТ, провести сравнительный скрининг цитотоксических свойств in vitro (MTT-тест), выбрать соединение-лидер, для которого затем изучить стабильность в физиологических условиях, оценить предполагаемый механизм действия (влияние на митохондриальный потенциал и уровень активных форм кислорода АФК в клетках HepG2). Кроме того требовалось осуществить синтез «флюоресцентно-меченных» аналогов соединения-лидера и с их помощью изучить проникновение и накопление in vitro на целевой культуре клеток HepG2. Также была поставлена задача провести анализ структура-активность (SAR) для полученных конъюгатов ТТ – N-ацетил-D-галактозамин (далее по тексту – GalNAc). По итогам второго этапа проекта был выполнен следующий план работ в соответствии с заявленными пунктами: 1. Оптимизация структуры конъюгата бетулина, проявившего цитотоксичность в отношении клеточных культур гепатоцеллюлярной карциномы путем конъюгирования бетулина с 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозой. На первом этапе проекта было показано, что оптимизацию конъюгатов можно проводить с использованием 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы (3) в качестве адресного лиганда. Данное производное галактозамина обладает более лучшим связыванием за счет наличия гликозидного фрагмента с аллиловым спиртом. Конъюгирование предшественника конъюгата с соединением (3) осуществили с помощью реакции [3+2]-азидалкинового циклоприсоединения по отработанной на первом этапе методике. В результате был получен гликоконъюгат (33) (далее – ТТ-48), содержащий в себе аллилгликозид GalNAc (схема 8, стр. 19 дополнительных материалов). К сожалению, соединение ТТ-48 не проявило сопоставимой активности с другими конъюгатами. Возможно, что в данном случае не достигается необходимая геометрия молекулы, при которой остатки GalNAc взаимодействуют с углевод-распознающими сайтами рецептора на поверхности гепатоцитов. В дополнение к представленному плану исследований, на втором этапе проекта нами также были получены гликоконъюгаты GalNAc и тритерпеноида аллобетулина (3-5) (схема 1, стр. 3). Для этого осуществили ацилирование исходной молекулы хлорангидридом гексиновой кислоты с последующим CuAAC-конъюгированием с азидопроизводными GalNAc (1-3). Кроме того, на основе бетулиновой кислоты был синтезирован гликоконъюгат ТТ-23 (9) (схема 2, стр. 5), содержащий в своей структуре свободную карбоксильную группу. Введение фрагмента щавелевой кислоты осуществили действием оксалил хлорида с последующим гидролизом в кислых условиях. Все вышеуказанные новые гликоконъюгаты ТТ были в последствии изучены на наличие цитотоксических свойств против клеточных линий гепатокарциномы и контрольных линий клеток. При этом стоит отметить, что соединение ТТ-23 показало самый высокий уровень цитотоксичности среди синтезированных конъюгатов. 2. Синтез серии конъюгатов бетулина и бетулиновой кислоты, в которых фармакофорные группы С-3 и С-28 будут незамещенными. Синтез будет осуществлен через реакционный центр С-30. Во многих случаях на первом этапе проекта молекулы бетулина и бетулиновой кислоты теряли свои цитотоксические свойства при конъюгировании через реакционные центры С3 и С28. В связи с этим нами была предложена схема синтеза конъюгатов с GalNAc (схема 5, стр.10), в результате которой в структуру тритерпеноидов была введена азидо-группа в положение С-30 углеродного скелета лупана для последующего циклоприсоединения с пропаргиловым гликозидом N-ацетил-β-D-галактозамина (4). Таким образом, предполагалось получить конъюгаты бетулина и бетулиновой кислоты через положение, которое предположительно не участвует в механизме цитотоксического действия. При этом фармакофоры С-3 и С-28 остаются свободными. Таким образом, последовательностью реакций ацилирования Ac2O, радикального аллилбромирования NBS двойной связи и нуклеофильного замещения брома на азидогруппу NaN3 были получены 30-азидопроизводные 3,28-диацетата бетулина и 3-ацетата бетулиновой кислоты. Ключевую стадию конъюгирования алкина GalNAc (4) и азидов ТТ осуществили с помощью реакции медь-катализируемого [3+2]-азидалкинового циклоприсоединения в присутствии каталитической системы CuI/DIPEA в безводном ДМФА. Продукты (22-23) выделяли колоночной хроматографией на силикагеле (элюент — CH2Cl2:MeOH 50:1), структуру идентифицировали методами спектроскопии ЯМР. На заключительном этапе реализации синтетической схемы (схема 5) провели снятие ацетильных защитных групп 0.1 н раствором NaOH в метаноле при комнатной температуре в течение 48 часов. Таким образом, с помощью простых химических превращений, были получены новые конъюгаты GalNAc с бетулином и бетулиновой кислотой через линкер в виде 1,2,3-триазольного цикла в положении С(30) углеродного скелета тритерпенов. В дальнейшем полученные соединения были изучены на цитотоксичность in vitro и аффинность к ASGP-R. 3. Синтез конъюгатов бетулина с оптической меткой (SulfoCy5) (схема 7, стр. 17). Для изучения клеточного накопления in vitro на культуре клеток HepG2 (ASGP-R положительные клетки) нами был осуществлен синтез конъюгата бетулина ТТ-50 (32), содержащего в своем составе как остаток GalNAc, так и оптическую метку SulfoCy5. Данный флюорофор интересен тем, что значительно увеличивает растворимость конъюгатов в воде, совместим с большинством флюоресцентных микроскопов и приборов, а также широко используется в исследованиях адресной доставки терапевтических молекул в печень. В качестве исходного соединения использовали моно-гликозид бетулина (побочный продукт синтеза соответствующего бивалентного конъюгата на первом этапе проекта). Кроме того, параллельно мы получили контрольное соединение (30), которое не содержит в своей структуре тканеспецифический компонент GalNAc (схема 7, стр. 17). Данное производное использовалось в качестве отрицательного контроля в опытах на клеточное проникновение и накопление, ему был присвоен шифр ТТ-49. Реакции конъюгирования в синтезе ТТ-50 и ТТ-49 проводили с помощью CuAAC-реакции в отработанных на первом этапе проекта условиях, с последующим хроматографированием смеси. В результате нами были синтезированы флюоресцентно-меченные соединения, которые затем были использованы для анализа рецептор-опосредованного клеточного эндоцитоза. Их структура была установлена методами спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии высокого разрешения ESI HRMS. Следует отметить, что несколько сниженный выход ТТ-50 и ТТ-49 связан, скорее всего, с их высокой полярностью, и как следствие потерей на колонке с силикагелем. 4. Изучение цитотоксического потенциала новых конъюгатов на клеточных линиях HepG2, Huh7 с помощью MTS-анализа в сравнении с исходными молекулами. Дополнительный отбор конъюгатов для расширенных испытаний. 5. Изучение цитотоксического потенциала на клеточных линиях HepG2, Huh7 для ASGPR-гликоконъюгатов олеаноловой и глицирретовой кислот, полученных на первом этапе проекта. Дополнительный отбор конъюгатов для расширенных испытаний. На втором этапе проекта предстояло завершить начатый отбор кандидатов для расширенных испытаний среди всех синтезированных соединений по итогам первого и второго этапа. Определение цитотоксической активности определяли тестом на клеточную выживаемость с использованием МТТ-реагента. В качестве целевых клеточных линий были использованы клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 (ASGPR ++) и Huh7 (ASGPR+). Для контроля были использованы клеточная линия рака предстательной железы РС3 (ASGPR-) и здоровая линия эмбриональных клеток человека Hek293. Кроме того, ряд соединений также был протестирован против клеток аденокарциномы легкого А459 и рака молочной железы MCF7. Шифры протестированных соединений приведены в Таблице 1 на странице 20 дополнительных материалов. Шифры «ТТ-№» вместо номеров при тестировании соединений использованы для исключения перекрестной нумерации между соединениями, синтезированными на первом и втором этапах проекта. Методика эксперимента на клеточную выживаемость приведена на странице 24 дополнительных материалов. В качестве препарата сравнения использовался доксорубицин (положительный контроль), ДМСО (отрицательный контроль). Одновременно тестировали исходные тритерпеноиды для сравнительной характеристики конъюгатов. В результате на цитотоксическую активность было изучено (Таблица 2, стр. 25) 34 новых соединения из которых в качестве соединения лидера для расширенных испытаний был выбран бивалентный конъюгат ТТ-13 на основе бетулина. Отбор соединения лидера был сделан, учитывая результаты молекулярного докинга in vitro (первый этап проекта) и аффиности к рецептору (спектроскопия поверхностно-плазмонного резонанса или ППР-спектроскопия, методика приведена на странице 38, тестирование проведено дополнительно к заявленному плану исследований). В заключительной части по итогам отбора среди гликоконъюгатов ТТ и GalNAc предстояло изучить ряд важнейших фармакологических показателей для соединения-лидера ТТ-13: 6. Оценка предполагаемого механизма цитотоксического действия отобранных гликоконъюгатов тритерпеноидов (влияние на аутофагию клеток in vitro или оценка мембранного потенциала митохондрий). Одной из важнейших задач проекта является изучение возможного механизма противоопухолевого действия низкомолекулярных конъюгатов тритерпеноидов. С этой целью проведена оценка влияния препарата TT-13 на трансмембранный потенциал митохондрий и выработку реактивных форм кислорода в клеточной линии HepG2 (гепатокарцинома человека) при длительном воздействии препарата (72 часа) и при краткосрочной инкубации (1 час). Концентрация препарата в среде соответствовала IC50 (индекс цитотоксичности) на основании проведенного ранее МТТ анализа при 72 часовой инкубации с TT-13. Для определения митохондриального потенциала клеток использовали флуоресцентный краситель TMRE, который избирательно накапливается в митохондриях с высоким трансмембранным потенциалом, а интенсивность его флуоресценции характеризует их АТФ-синтезирующую способность. Высокий трансмембранный потенциал характеризует популяцию жизнеспособных клеток, в то же время низкий трансмембранный потенциал характерен для апоптотических клеток. Для выявления активных форм кислорода использовали краситель 2’,7’- дихлорофлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA), который является маркером наличия в клетке пероксида водорода и других перекисных соединений, а также гидроксильного аниона. В присутствии активных форм кислорода (АФК) в клетке образуется флуоресцирующий продукт окисления 2’,7’- дихлорофлуоресцеиндиацетата – дихлорофлуоресцеин (DCF). Всего было сделано по три эксперимента (стр. 26) 1. 72 часовая инкубация с препаратом TT-13 (стр. 28) Анализировали только трансмембранный потенциал митохондрий (краситель TMRE). Эксперимент был проведен в 3 повторах в одном 6 луночном планшете: 4 лунки – клетки из флакона №1. Образцы Контроль 1 и 2, Эксперимент 1 и 2. Клеточный монослой к моменту анализа занимал 80% от площади поверхности лунки; 2 лунки из флакона №2. Образцы Контроль 3, Эксперимент 3. Количество клеток к моменту анализа - 60% от площади лунки. 2. 72 часовая инкубация с препаратом TT-13 (стр. 29) Анализировали трансмембранный потенциал митохондрий (краситель TMRE) и активные формы кислорода. Эксперимент был проведен в 3 повторах в одном 6 луночном планшете. Клеточный монослой к моменту анализа занимал от 60 до 70% площади лунок. 3. 1 часовая инкубация с препаратом TT-13 (стр. 29) Анализировали трансмембранный потенциал митохондрий (краситель TMRE) и активные формы кислорода. Эксперимент был проведен в 3 повторах в одном 6 луночном планшете. Клеточный монослой к моменту анализа занимал от 60 до 70% площади лунок. Так как TT-13 ингибировал выброс TMRE из клеток HepG2, то в данном эксперименте анализировали только клетки под воздействием препарата. Кроме того, в дополнении к представленным экспериментам на проточном цитометре, нами было изучено влияние ТТ-13 на выработку АФК в культуре клеток HepG2 амперометрическим методом с помощью измерения концентрации АФК на платиновых электродах (стр. 31; стр. 34) в соответствии с опубликованной нашим научным коллективом методикой [Erofeev A. et al. Novel method for rapid toxicity screening of magnetic nanoparticles //Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 7462]. В качестве препаратов сравнения были использованы бетулин (положительный контроль согласно данным МТТ) и ТТ-15 (отрицательный контроль согласно данным МТТ). В результате было показано, что на целевой культуре клеток гепатокарциномы в заданных условиях эксперимента под воздействием ТТ-13 наблюдалось максимальное увеличение концентрации АФК, в отличие от контрольных соединений (рис.7, стр. 37). В качестве контрольной культуры использовали клетки рака предстательной железы РС-3. Таким образом, было обнаружено снижение трансмембранного потенциала под воздействием препарата ТТ-13 и образование АФК, что было зафиксировано двумя различными методами. Образования АФК уже после часовой инкубации позволяет предположить, что данное вещество оказывает цитотоксический эффект через генерацию АФК, которые могут вызвать клеточную гибель по пути апоптоза. При этом эффект наблюдается уже через 1 час после инкубации с препаратом. 7. Изучение стабильности отобранных гликоконъюгатов тритерпеноидов при физиологических условиях с помощью инкубирования при различных значениях рН (5.5 и 7.4) в фосфатно-солевом буфере, а также в присутствии эстеразы при рН 7.4. Один из ключевых показателей каждой системы адресной доставки – способность к высвобождению терапевтической или диагностической молекулы в физиологических условиях организма под действием соответствующих ферментов или определенного значения рН среды. В отобранном конъюгате ТТ-13 биологически-активной молекулой является тритерпеноид бетулин, обладающий высоким уровнем IC50 ≈1-5 µМ в отношении гепатоцеллюлярной карциномы (что также было подтверждено в наших собственных эксперимента). В тоже время, молекула ТТ-13 фактически представляет собой пролекарство, в котором адресные лиганды GalNAc «пришиты» через линкер и сложноэфирные связи к бетулину. Разрабатывая данную схему, мы предполагали, что С-3 и С-28 сложные эфиры тритерпеноидов будут способны к гидролизу, что обеспечит реализацию исходных соединений в гепатоцитах. Пролекарственный подход в исследованиях тритерпеноидов широко распространен, в частности С-3 сложный эфир бетулиновой кислоты и ПЭГ3-СООН подробно изучен в работе [Ankit Saneja et al, Materials Science and Engineering C 73 (2017) 616–626]. В связи с этим мы провели эксперимент, при котором конъюгат ТТ-13 инкубировали при 37 °С в соответствующем буфере со значением рН 7.4 или 5.5, или в присутствии смеси ферментов эстераза и проназа. Определение концентрации ТТ-13 в различных временных точках осуществили масс-спектрометрически с помощью ВЭЖХ-МС. В результате было показано, что при рН 5.5 и в присутствии ферментов происходит гидролиз ТТ-13 с высвобождением бетулина. В тоже время, при рН 7.4 не происходило никаких изменения. Таким образом, проведенные тесты показали способность ТТ-13 к селективному гидролизу и высвобождению бетулина в физиологических условиях. 8. Оценка клеточной проницаемости в гепатоциты in vitro для гликоконъюгатов тритерпеноидов, показавших наилучшие показатели цитотоксичности, методом ВЭЖХ лизатов клеточных культур HepG2 и Huh7 или с помощью метода проточной цитометрии конъюгатов с оптической меткой. С целью определения адресных свойств и селективности действия гликоконъюгата TT-13, нами была проведена оценка способности проникать в клетки HepG2 с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Клеточная проницаемость в гепатоциты in vitro была изучена методом проточной цитометрии (стр. 40) флюоресцетно-меченного аналога ТТ-13 – соединения ТТ-50. Данное производное бетулина содержит в себе остаток GalNAc, отвечающий за селективное взаимодействие с ASGPR гепатоцитов, и метку SulfoCy5, которая обеспечивает обнаружение с помощью флюоресцентной микроскопии или цитометрии. Подобные эксперименты проводятся в большинстве научных работ, посвященных адресной доставке в гепатоциты через ASGP-R, например в работе [Marie Monestier et al., ChemBioChem 2016, 17, 590 – 594]. При этом производные цианина – наиболее часто встречающиеся метки для данных экспериментов. По результатам проведенных экспериментов было показано, что на культуре клеток HepG2 (ASGPR+) наблюдалось клеточное поглощение с дозо-зависимым эффектом, положительный эффект увеличивался с ростом концентрации, доля отрицательных сигналов снижалась. В тоже время на контрольной клеточной культуре РС3 (ASGPR -) подобных закономерностей не наблюдалось. Кроме того, дополнительно к заявленному плану исследований нами был проведен аналогичный эксперимент на клеточное поглощение и распределение в печени in vivo с помощью метода Интравитальной микроскопии (стр. 43). Для этого мыши balb/c (самки) получали внутривенно флуоресцентно-меченные конъюгаты ТТ-50 (опытный образец) и ТТ-49 (контрольный образец – отрицательный контроль), в дозе 3 мг/кг. Проникновение конъюгатов в клетки печени исследовали методом интравитальной диагностики (ИВМ) в течение 60-90 мин после введения. Для этого животному, находящемуся под наркозом (золетил + ксилазин внутрибрюшинно) устанавливали внутривенный катетер и вводили через него флуоресцентно меченные антитела к нейтрофилам (Ly6g BV421, 4 мкл), В-лимфоцитам (B220 PE, 7 мкл), макрофагам (F4/80 FITC, 7 мкл). После чего разрезали кожу и брюшину по срединной линии живота, аккуратно выделяли левую долю печени, перерезая печеночно-диафрагмальную и печеночно-желудочную связки, и помещали печень на покровное стекло подогреваемой платформы инвертированного микроскопа Nikon AR1. Видеосъемку осуществляли в 10 полях зрения со скоростью 1-2 кадра в минуту в момент введения конъюгатов. Видеозаписи микроскопии можно посмотреть по следующим ссылкам: Ссылка на видео динамики накопления опытного конъюгата ТТ-50 в клетках печени: https://yadi.sk/i/mGcc4g1PfXMujA Ссылка на видео динамики накопления контрольного соединения ТТ-49 в клетках печени: https://yadi.sk/i/dimFlIO9U6CV3Q Полученные результаты позволяют заключить, что при системном введении исследуемые конъюгаты по-разному взаимодействуют с клетками печени. Так испытуемый конъюгат ТТ-50 способен проникать в гепатоциты, накапливаясь в цитоплазматических везикулах (Рисунок 11А, стрелки, стр. 45), в то время как контрольный образец ТТ-49 в основном адсорбируется на стенке сосуда (Рисунок 11Б, стрелки, стр. 45). Таким образом, показано, что гликоконъюгаты бетулина и GalNAc способны к селективному проникновению в гепатоциты через рецептор-опосредованный эндоцитоз с участием ASGP-R. 9. Анализ закономерности «структура-конъюгата – активность», отбор соединений-лидеров для дальнейших экспериментов in vivo по итогам прохождения тестов цитотоксичности, клеточного накопления и устойчивости в физиологических условиях, выработка рекомендаций для дальнейших исследований с использованием полусинтетических производных тритерпеноидов. По итогам выполненных экспериментов и полученного массива данных нами был проведен анализ закономерностей «структура-активность» для всех синтезированных соединений. В целом их следует разбить на 6 групп по типу исходной молекулы: бетулин, аллобетулин, бетулиновая кислота, олеаноловая кислота, урсоловая кислота и глицирретиновая кислота (таблица 2, стр. 24). Производные аллобетулина оказались полностью нетоксичными по итогам МТТ теста. Бетулин, бетулиновая кислота, олеаноловая кислота и урсоловая кислота проявили высокий уровень значения цитотоксичности против линий гепатокарциномы и др. клеток со значениями IC50 < 10 µM. Глицирретиновая кислота оказалась умеренно активной (IC50 ≈ 45 µM). После конъюгирования для олеаноловой кислоты активность сохранил лишь конъюгат ТТ-30, который, к тому же проявил высокое сродство к ASGP-R согласно данным ППР-спектроскопии. По-видимому, для данного тритерпеноида критично наличие свободной С-28 карбоксильной группы в случае цитотоксического эффекта. Конъюгат ТТ-30 обладал высокой степенью селективности между линиями гепатокарциномы и Hek293 (здоровая линия) и РС3 (ASGPR -). ТТ-30 рассматривался нами в качестве кандидата для соединения-лидера, вместе с ТТ-13. В ряду урсоловой кислоты наблюдалось отсутствие какого-либо эффекта для соединения ТТ-37, в то время как ТТ-35 и ТТ-36 проявили высокую цитотоксичность против гепатокарциномы. В целом, ТТ-35 и ТТ-36 не стали дальше рассматриваться из-за высокой токсичности к здоровой линии клеток Hek293 и низкой селективности действия при сравнении всех данных цитотоксичности. Аналогичные выводы можно сделать и для соединения ТТ-23, которое проявило максимальные значения цитотоксичности (IC50 6 µM) против HepG2, почти двукратную селективность в сравнении с Huh7 и одну из самых высоких аффинностей к ASGPR (KD 0.21 нМ). Однако, значение IC50 = 1 µМ против линии Hek293 не позволило нам выбрать данный конъюгат для расширенных испытаний. В общем виде, для бетулиновой и глицирретиновой кислот была характерна потеря цитотоксических свойств после конъюгирования. Для некоторых производных был выявлен высокий уровень аффинности методом ППР-спектроскопии. Данный факт представляет собой один из самых интересных итоговых результатов проекта, т.к. известно, что тритерпеноиды обладают широким спектром активности против различных заболеваний печени, и отсутствие токсических свойств является первичным требованием к таким агентам. В рамках данного проекта конъюгаты бетулиновой и глицирретиновой кислот в качестве агентов против ГЦК далее не рассматривались. Кроме того, обращают на себя внимание соединения ТТ-41 и ТТ-20, которые содержат свободную гидроксильную группу в положении углеродного скелета С-3. Данный заместитель является одним из самых удобных для функционализации в структуре тритерпеноидов. Учитывая результаты испытаний конъюгатов ТТ-49 и ТТ-50 на клеточный эндоцитоз, нами был сделан вывод о высокой перспективности соединений ТТ-20 и ТТ-41 в качестве лигандов адресной доставки терапевтических и диагностических препаратов в гепатоциты с возможностью конъюгирования через положение С-3. При этом, в рамках данного проекта на примере соединения ТТ-23 был отработан один из возможных вариантов линкера в виде остатка щавелевой кислоты. Соединения ТТ-20 и ТТ-41 также оказались нетоксичны в отношении широкого спектра клеточных культур, что является необходимым требованием к лигандам адресной доставки через ASGPR. Соединение ТТ-58 также было предложено нами в качестве лиганда адресной доставки в гепатоциты. В его структуре находится две свободные гидроксильные группы, по которым можно провести двойную функционализацию с получением, например, тераностических препаратов. Для конъюгатов на основе бетулина четко выраженной закономерности обнаружено не было. Самым активным оказалось соединение ТТ-13, в том числе и по сумме двух показателей «цитотоксичность» и «аффинность» со значением IC50 25.9 µM против HepG2. Суммируя результаты, среди всех соединений в качестве соединения-лидера рассматривались конъюгаты ТТ-30 и ТТ-13, выбор был сделан в пользу бивалентного конъюгата на основе бетулина ТТ-13. Данное соединение проявило достаточно высокий уровень цитотоксичности к клеткам гепатокарциномы, обладало коэффициентом селективности 1.8 между двумя линиями HepG2 и Huh7, проявило низкий уровень активности к линии здоровых клеток Hek293. Значение константы диссоциации «конъюгат-рецептор» KD 1.18 нМ свидетельствует о высоком уровне аффинности ТТ-13 к ASGPR, что также подтверждалось расчетами молекулярного докинга. Значение активности бетулина против ГЦК несколько выше, чем у олеаноловой кислоты. Кроме того, бивалентная структура ТТ-13 является преимуществом перед ТТ-30 для испытаний in vivo. Таким образом, на основании проведенного анализа из всех соединений для расширенных испытаний был выбран бивалентный ASGPR-конъюгат бетулина ТТ-13. В дальнейшем для данного соединения была определена способность вызывать образование АФК и снижение митохондриального потенциала в гепатоцитах, способность к ферментативному расщеплению и гидролизу в кислых условиях, а также к проникновению в клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз. По итогам всех испытаний in vitro, в которых были получены положительные результаты, конъюгат ТТ-13 был передан на испытания in vivo – поглощение и распределение в печени (стр. 43) и острой токсичности (стр. 46). В качестве рекомендации для дальнейшего синтеза нами был сделан вывод о необходимости получения конъюгатов ТТ и GalNAc через водорастворимые линкеры, например через производные триэтиленгликоля. Подобные линкеры могут значительно усилить водорастворимость получаемых конъюгатов и, тем самым усилить цитотоксические свойства. Этиленгликолевые линкеры широко используются в исследованиях различных биотерапевтических молекул, в том числе природных терпеноидов. 10. Исследование токсического эффекта in vivo для соединений-лидеров при условии получения положительных результатов тестов цитотоксичности, клеточного накопления и устойчивости в физиологических условиях. В завершение второй части проекта нами был изучен токсический профиль соединения ТТ-13 in vivo в диапазоне доз от 12,5 мг/мл до 2,47 мг/мл (стр. 46). Для эксперимента на острую токсичность конъюгат TT-13 в водном растворе буфера PBS с 2% DMSO и 3 экв. Pluronic (по массе) вводили внутривенно опытным животным – мышам (самки, белые, беспородные, массой около 25 г). Объем однократной инъекции для каждого животного составил 200 мкл. Мыши были разделены на 5 групп по 5 животных, каждая группа получила инъекции вещества в своей концентрации: 12,5 мг/мл, 8,33 мг/мл, 5,56 мг/мл, 3,70 мг/мл, 2,47 мг/мл (5 разведений с шагом разбавления в 1,5 раза). Контрольной группе мышей (n=4) вводили по 200 мкл буфера PBS с 2% DMSO с 3 экв. Pluronic (по массе). Сразу после инъекции мышей взвешивали и далее отслеживали динамику массы тела, а также отслеживали расход корма и воды в течение недели. В течение первых суток несколько раз в день и далее один раз в день проводили визуальный внешнего состояния и поведения животных. Через неделю наблюдений животных усыпляли, вскрывали грудную клетку и забирали кровь из сердца. Извлекали, взвешивали и фиксировали 10% формалином следующие органы – печень, сердце, легкие, селезенку, почки. Полученные образцы крови центрифугировали и получали около 200 мкл плазмы от каждого опытного животного. Далее проводили биохимический анализ плазмы на анализаторе на уровень аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), креатинина (CRE), общего и прямого биллирубина (T.Bil и D.Bil), азота мочевины (BUN) и мочевой кислоты (UA). По итогам проведенного эксперимента показано, что в выбранном диапазоне доз конъюгат ТТ-13 оказался полностью нетоксичен, LD50 не достигнуто. По результатам выполнения 1 этапа проекта в июне 2019 года запланировано участие с устным докладом на Марковниковском конгрессе в г. Казань (материалы официально приняты оргкомитетом для устной презентации на английском языке). Кроме того опубликовано 3 статьи в журналах: - Известия Академии Наук, Серия Химическая – статья посвящена синтезу предшественников конъюгатов – алкиновых производных тритерпеноидов; - Mendeleev Communications (принята в печать 13.05.2019, журнал Q2) – статья посвящена синтезу и биологической ценке конъюгатов аллобетулина и GalNAc; - Natural Product Communications (принята в печать) – в статье описан синтез полусинтетического производного на основе бетулиновой кислоты (N-метилпиперазиниламид). В рамках проекта данное соединение было протестировано на цитотоксические свойства in vitro против гепатокарциномы. Был выявлен высокий уровень активности, превышающий значения природных тритерпеноидов. Таким образом, принято решение синтезировать адресный конъюгат второго поколения с GalNAc на основе данного производного, что является логичным продолжением настоящего проекта. Еще одна статья отправлена на рассмотрение в журнал Известия Академии Наук, Серия Химическая – в ней описаны перспективные лиганды адресной доставки в гепатоциты - производные ТТ-57 и ТТ-58. Кроме того, до конца 2019 года планируется опубликование как минимум одной статьи в иностранном журнале Q1-Q2 (Bioorganic and Medicinal Chemistry или аналог). В ней на основании полученных результатов будет детально описан первый пример адресного цитотоксического агента против ГЦК на основе бетулина и GalNAc - ТТ-13. На сегодняшний день основной целью наших исследований является синтез адресного ASGPR-конъюгата второго поколения с использованием вышеупомянутого полусинтетического производного N-метилпиперазиниламида бетулиновой кислоты. Кроме того, ведется разработка перспективных ASGPR-лигандов на основе соединений ТТ-20 и ТТ-41: проводится синтез терапевтических адресных конъюгатов ТТ-20 и ТТ-41 с лекарственными препаратами для борьбы с малярией, гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномы. Одновременно, учитывая пример ТТ-23, проводится попытка усиления цитотоксических свойств конъюгатов ТТ-29, ТТ-35 и ТТ-41 с помощью введения остатка щавелевой кислоты. Таким образом, на втором этапе выполнения проекта заявленный план исследований был выполнен в полном объеме. Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном периоде (до 5 стр.) С учетом полученных результатов в 2017-2018 гг, после выполнения предлагаемого плана исследований на 2 этапе проекта были получены следующие основополагающие научные результаты: 1. Будет проведена оптимизация структуры конъюгата бетулина, проявившего цитотоксичность в отношении клеточных культур гепатоцеллюлярной карциномы. Результаты п.1 представлены на схеме 8, стр. 19 дополнительных материалов (далее все схемы синтеза, таблицы, рисунки также представлены в Дополнительных материалах, с указанием страницы в текстовом отчёте) Оптимизацию конъюгата ТТ-13 проводили с использованием 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы (3) в качестве адресного лиганда. Конъюгирование предшественника конъюгата с азидопроизводным GalNAc (3) осуществили с помощью реакции [3+2]-азидалкинового циклоприсоединения по отработанной ранее на первом этапе методики. В результате был получен гликоконъюгат (33) (далее – ТТ-48), содержащий в себе аллилгликозид GalNAc. К сожалению, соединение ТТ-48 не проявило сопоставимой активности с другими конъюгатами. Возможно, что в данном случае не достигается необходимая геометрия молекулы, при которой остатки GalNAc взаимодействуют с углевод-распознающими сайтами рецептора на поверхности гепатоцитов. В дополнение к представленному плану исследований, на втором этапе проекта нами также были получены гликоконъюгаты GalNAc и тритерпеноида аллобетулина (3-5) (схема 1, стр. 3). Кроме того, на основе бетулиновой кислоты был синтезирован гликоконъюгат (9) (схема 2, стр. 5), содержащий в своей структуре свободную карбоксильную группу. Введение фрагмента щавелевой кислоты осуществили действием оксалил хлорида с последующим гидролизом в кислых условиях. 2. Будет проведен синтез серии конъюгатов бетулина и бетулиновой кислоты, в которых фармакофорные центры С-3 и С-28 будут незамещенными. Результаты п.2 представлены на схеме 5, стр. 10 дополнительных материалов В связи с потерей бетулином и бетулиновой кислотой цитотоксических свойств после конъюгирования с GalNAc, нами была предложена схема синтеза конъюгатов с GalNAc, в результате которой в структуру тритерпеноидов была введена N3-группа в положение С-30 углеродного скелета лупана Таким образом, нами предполагалось получить конъюгаты бетулина и бетулиновой кислоты через положение, предположительно не участвующее в механизме цитотоксического действия, при этом фармакофоры С-3 и С-28 остаются свободными. Так, последовательностью реакций ацилирования Ac2O, радикального бромирования NBS в аллильном положении двойной связи и нуклеофильного замещения брома на азидогруппу NaN3 были получены 30-азидопроизводные 3,28-диацетата бетулина и 3-ацетата бетулиновой кислоты. Ключевую стадию конъюгирования пропаргил-гликозида N-ацетил-β-D-галактозамина (4) и азидов ТТ осуществили с помощью CuAAC-реакции. На заключительном этапе реализации синтетической схемы провели снятие ацетильных защитных групп 0.1 н раствором NaOH в метаноле при комнатной температуре в течение 48 часов. Таким образом, с помощью простых химических превращений, были получены новые конъюгаты N-ацетил-D-галактозамина с бетулином TT-58 и бетулиновой кислотой TT-57 через линкер в виде 1,2,3-триазольного цикла в положении С(30) углеродного скелета тритерпенов. 3. Для целей проточной цитометрии будет осуществлен синтез не менее 1 конъюгата бетулина или бетулиновой кислоты с оптической меткой (SulfoCy5). Результаты п.3 представлены на схеме 7, стр. 17 дополнительных материалов Для изучения клеточного накопления in vitro на культуре клеток HepG2 (ASGP-R положительные клетки) нами был осуществлен синтез конъюгата бетулина ТТ-50 (32), содержащего в своем составе как остаток GalNAc, так и оптическую метку SulfoCy5. Кроме того, мы получили контрольное соединение (30), которое не содержит в своей структуре тканеспецифический компонент GalNAc. Данное производное использовалось в качестве отрицательного контроля в опытах на клеточное проникновение и накопление, ему был присвоен шифр ТТ-49 Конъюгирование в синтезе ТТ-50 и ТТ-49 проводили с помощью CuAAC-реакций в отработанных на первом этапе условиях синтеза. В результате нами были получена пара флюоресцентно-меченых соединений, их структура была установлена методами спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии высокого разрешения ESI HRMS. Следует отметить, что несколько сниженный выход ТТ-50 и ТТ-49 связан, скорее всего, с их высокой полярностью, и как следствие потерей на колонке с силикагелем. 4. Будет проведено дополнительное изучение цитотоксического потенциала новых конъюгатов ТТ на клеточных линиях HepG2, Huh7. В результате будет проведен дополнительный отбор конъюгатов тритерпеноидов для расширенных испытаний. Результаты п.4 и 5 представлены в таблице 2 на стр. 25 На втором этапе проекта предстояло завершить определение цитотоксической активности всех синтезированных конъюгатов ТТ и GalNAc. Активность определяли тестом на клеточную выживаемость с использованием МТТ-реагента. В результате на цитотоксическую активность было изучено 34 новых соединения, из которых в качестве соединения-лидера для расширенных испытаний был выбран бивалентный конъюгат ТТ-13 на основе бетулина. Также были выявлены значительные цитотоксические свойства конъюгатов олеаноловой кислоты ТТ-30, бетулиновой кислоты ТТ-23, урсоловой кислоты ТТ-35 и ТТ-36. С учетом контрольных линий для данных соединений были определены первичные параметры цитотоксической селективности in vitro. Для конъюгатов аллобетулина, глицерритиновой кислоты, бетулиновой кислоты показана потеря активности против ГЦК и других клеточных линий в сравнении с природными исходными молекулами. В целом, в каждой серии полученных конъюгатов имелись примеры потери активности. Отбор соединения лидера был сделан, учитывая результаты теста на цитотоксичность, молекулярного докинга in silico (первый этап проекта) и аффиности к рецептору (спектроскопия поверхностно-плазмонного резонанса или ППР-спектроскопия страница 38, тестирование проведено дополнительно к заявленному плану). 6. Будет проведена оценка предполагаемого механизма цитотоксического действия отобранных конъюгатов тритерпеноидов в сравнении с исходным соединением (влияние на аутофагию клеток in vitro или оценка мембранного потенциала митохондрий). Результаты п.6 представлены на стр. 26-37 дополнительных материалов После отбора соединения-лидера нами была проведена оценка влияния препарата TT-13 на трансмембранный потенциал митохондрий и выработку реактивных форм кислорода в клеточной линии HepG2 (гепатокарцинома человека). Для этого был проведен ряд экспериментов: 1. 72 часовая инкубация с препаратом TT-13 (стр. 28). Было обнаружено, что тестируемое вещество вызывает гибель клеток, при этом популяция жизнеспособных клеток сокращается на 38,8% (1 эксперимент) и на 19,76 % (2 эксперимент). Суммируя результаты двух экспериментов процент снижения популяции равен 29,3%. В том же время под воздействием тестируемого препарата увеличивается медиана интенсивности флуоресценции DCF (маркера АФК) на 48,55% в популяции живых клеток. Усиление образования свободных радикалов в клетке может приводить к запуску программы апоптоза, что позволяет предположить, что гибель клеток под воздействием TT-13 может быть обусловлена воздействием АФК. Кроме того, было обнаружено, что при 1 часе инкубации с препаратом в популяции живых клеток, которые были определены на основании параметров прямого FSC-А и бокового SSC-А светорассеивания (в предыдущих экспериментах данные параметры гейтирования клеток совпадали с параметрами высокого уровня трансмембранного потенциала митохондрий), было обнаружено 2 визуально различные субпопуляции HepG2: с низким значением TMRE (Low TMRE) и c высоким значением TMRE (High TMRE). Пример гейтирования приведен на Рисунке 1 (стр. 30). При этом данные популяции различались не только по параметру трансмембранного потенциала митохондрий, но и по медиане интенсивности флуоресценции DCF (маркер АФК). Таким образом, под воздействием TT-13 в клетках HepG2 в 18,36% популяции жизнеспособных клеток происходит снижение на 57,66% трансмембранного потенциала митохондрий (с 94 023,55 до 39 808,74) и значение повышение (на 73,9 %)АФК. Аналогичные данные были получены с помощью амперометрического метода измерений уровня образования АФК под действием ТТ-13 на культуре HepG2 (стр. 31-37). Таким образом, снижение трансмембранного потенциала под воздействием препарата и образование АФК уже после часовой инкубации позволяют предположить, что данное вещество оказывает цитотоксический эффект через генерацию АФК, которые могут вызвать клеточную гибель по пути апоптоза. При этом эффект наблюдается уже через 1 час после инкубации с препаратом. Для того, чтобы оценить длительное воздействие препарата на трансмембранный потенциал клеток, требуется модификация протокола, а именно использование ингибиторов P-gp во время инкубации с TMRE. 7. Будет изучена стабильность отобранных конъюгатов тритерпеноидов при физиологических условиях инкубированием при различных значениях рН (5.5 и 7.4) в фосфатно-солевом буфере, а также в присутствии эстеразы при рН 7.4. Результаты п.7 представлены на схеме 8, стр. 39. Один из ключевых показателей каждой системы адресной доставки – способность к высвобождению терапевтической или диагностической молекулы в физиологических условиях организма под действием соответствующих ферментов или определенного значения рН среды. В связи с этим мы провели эксперимент, при котором конъюгат ТТ-13 инкубировали при 37 °С в соответствующем буфере со значениями рН 7.4 или 5.5, или в присутствии смеси ферментов эстераза и проназа. Определение концентрации ТТ-13 в различных временных точках проводили масс-спектрометрически с помощью ВЭЖХ-МС. В результате было показано, что при рН 5.5 (95% гидролиз за 24 часа) и в присутствии ферментов (50% расщепление за 24 часа) происходит гидролиз ТТ-13 с высвобождением бетулина. В тоже время, при рН 7.4 не происходило каких-либо изменения. Таким образом, проведенные тесты показали способность ТТ-13 к селективному гидролизу и высвобождению бетулина в физиологических условиях. 8. С целью определения адресных свойств и селективности действия будет проведена оценка способности конъюгатов ТТ проникать в клетки-мишени с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Результаты п.8 представлены на стр. 40-45 дополнительных материалов. Клеточная проницаемость в гепатоциты in vitro была изучена методом проточной цитометрии (стр. 40) флюоресцетно-меченного аналога ТТ-13 – соединения ТТ-50. По результатам проведенных экспериментов было показано, что на культуре клеток HepG2 (ASGPR +) наблюдалось клеточное поглощение с дозо-зависимым эффектом: при увеличении концентрации с 0 нМ до 500 нМ имело место увеличение положительных клеток с 0.1% до 86,5 %, соответственно. Доля негативных клеток снижалась со 100% до 15.8 %. В тоже время на контрольной клеточной культуре РС3 аналогичные закономерности отсутствовали – между концентрациями конъюгата ТТ-50 в 0 нМ и 100 нМ в клетках отсутствовали различия. Одни из наиболее значимых результатов проекта были получены в эксперименте клеточного поглощения и распределения конъюгатов ТТ-50 и ТТ-49 в печени in vivo. Эксперимент проводили методом интравитальной диагностики на мышах balb/c. Оба конъюгата контрастировали печеночные синусоиды сразу после введения, а через 5-10 минут наблюдалось окрашивание мембран гепатоцитов. В случае с TT-50 наблюдали появление флуоресцентно окрашенных везикул в гепатоцитах примерно с 10-й мин после инъекции. Их количество и размеры увеличивались на всем протяжении съемки; через 30-60 мин большинство из них локализовалось в околоядерной зоне. Кроме того, отмечалось гомогенное окрашивание цитоплазмы, уступающее по интенсивности сигнала окраске везикул. Не отмечено накопление TT-50 внутри печеночных синусоидов, а также на лейкоцитах (нейтрофилах, купферовских клетках, лимфоцитах). Конъюгат TT-49 также не связывался с иммунными клетками, однако наблюдалось его накопление внутри сосудов, на поверхности клеток, морфологически сходных с эндотелиальными. В отличие от ТТ-50, не было выявлено накопления ТТ-49 в цитоплазматических везикулах гепатоцитов, однако наблюдалось гомогенное окрашивание клеток. Возможно, такое окрашивание связано с адсорбцией конъюгатов на мембране гепатоцитов. Таким образом, показано, что при системном введении исследуемые конъюгаты по-разному взаимодействуют с клетками печени. Так испытуемый конъюгат ТТ-50 способен проникать в гепатоциты, накапливаясь в цитоплазматических везикулах (Рисунок 11А, стрелки, стр. 45), в то время как контрольный образец ТТ-49 в основном адсорбируется на стенке сосуда (Рисунок 11Б, стрелки, стр. 45). Таким образом, показано, что конъюгаты бетулина и GalNAc селективно связываются с ASGP-R и проникают внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Указанная совокупность результатов подтверждает правильность выбранной концепции адресной доставки тритерпеноидов через конъюгирование с остатками GalNAc. Учитывая данные аффиности методом ППР-спектроскопии, отмечен синергетический эффект терпеновых и галактозаминовых молекул после конъюигирования. 9. На основании полученных данных будут выявлены и проанализированы закономерности «структура-конъюгата – активность». По итогам прохождения фармакологических тестов (цитотоксичность, клеточное накопление, устойчивость в физиологических условиях) будут определены соединения-лидеры для дальнейших экспериментов in vivo. По итогам выполненных экспериментов нами был проведен анализ закономерностей «структура-активность» для всех синтезированных соединений. Среди всех конъюгатов в качестве соединения-лидера было выбрано бивалентное производное на основе бетулина ТТ-13. Данное соединение проявило достаточно высокий уровень цитотоксичности к клеткам гепатокарциномы, обладало коэффициентом селективности 1.8 между двумя линиями HepG2 и Huh7, проявило низкий уровень активности к линии здоровых клеток Hek293. Значение константы диссоциации «конъюгат-рецептор» KD 1.18 нМ свидетельствует о высоком уровне аффинности ТТ-13 к ASGPR, что также подтверждалось расчетами молекулярного докинга. Значение активности бетулина против ГЦК несколько выше, чем у олеаноловой кислоты. Кроме того, бивалентная структура ТТ-13 является преимуществом перед моновалентной структурой ТТ-30 для испытаний in vivo. В качестве рекомендации для дальнейшего синтеза нами предложено синтезировать конъюгаты ТТ и GalNAc через полярные биосовместимые линкеры, например через производные триэтиленгликоля. Подобный линкер может значительно усилить водорастворимость получаемых конъюгатов и тем самым усилить цитотоксические свойства. 10. Для соединений-лидеров, прошедших отбор по итогам биологических экспериментов in vitro (цитотоксичность, клеточное накопление, устойчивость в физиологических условиях) будут проведены исследования токсического эффекта in vivo. В результате будут предложены структуры соединений для доклинических исследований. Результаты п.10 представлены на стр. 46-52 дополнительных материалов. В завершение второй части проекта нами был изучен токсический профиль соединения ТТ-13 in vivo в диапазоне доз от 12,5 мг/мл до 2,47 мг/мл (стр. 46) с помощью внутривенного введения мышам (самки, белые, беспородные, массой около 25 г). В результате значительных изменений в массе тела мышей, их поведении, потреблении корма, биохимических показателей крови, морфологии внутренних органов не отмечено. Гибель животных отсутствовала, по итогам проведенного эксперимента показано, что в выбранном диапазоне доз конъюгат ТТ-13 оказался полностью нетоксичен, LD50 не достигнуто. Соединение ТТ-13 рекомендовано нами для расширенных испытаний in vivo, в первую очередь для изучения противоопухолевых свойств против ГЦК в диапазоне доз до 12,5 мг/мл, что соответствует дозе 125 мг / кг массы тела животного. Таким образом, основной результат второго этапа проекта заключается в завершении синтетической части всего проекта, определении основных параметров полученных конъюгатов ТТ и GalNAc – цитотоксичность и аффинность к рецептору и последующем определении соединения-лидера. Для выбранного конъюгата ТТ-13 проведен ряд расширенных фармакологических испытаний in vitro и in vivo, в результате которых выявлен высокий потенциал данного соединения в качестве противоопухолевого агента для борьбы с гепатоцеллюлярной карциномой. Кроме того, определены перспективные агенты для тестирования других видов активностей против заболеваний печени (метаболические расстройства, малярия, гепатит В и С): ТТ-4, ТТ-48, ТТ-19, ТТ-20, ТТ-21, ТТ-29, ТТ-31, ТТ-37, ТТ-41, ТТ-42, ТТ-43, ТТ-44, ТТ-57, ТТ-58. Важно, что по итогам второй части проекта выявлены потенциальные лиганды адресной доставки лекарственных препаратов в печень: ТТ-20, ТТ-41, ТТ-57. Кроме того, подтверждена способность конъюгатов ТТ и GalNAc к селективной адресной доставки в печень и селективному взаимодействию с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".