ИСТИНА

С помощью спектрофотометрии с микросекундным разрешением исследована кинетика окисления полностью восстановленной caa3 цитохромоксидазы из T.thermophilus молекулярным кислородом в режиме одного каталитического оборота. Выявлены 5 переходов, отражающих последовательность спектральных изменений фермента R->A->P->F->OH->EH, включая 4 стадии окислительной фазы и первую стадию восстановительной фазы (переход OH->EH) каталитического цикла. Конечное состояние EH, образующееся из высокоэнергетического окисленного состояния ОH, характеризуется локализацией электронного эквивалента в биядерном центре на CuB. Разрешена кинетика генерации мембранного потенциала встроенной в протеолипосомы цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Показано, что переход P->F (~40 мкс) сопряжен с трансмембранной транслокацией 2 зарядов, включая перекачку одного протона через всю толщину мембранного диэлектрика. Переходы F->OH->EH сопровождаются тремя стадиями генерации мембранного потенциала (~250 мкс, ~1.4 мс и ~4 мс, соответственно) и сопряжены суммарно с транслокацией 4 зарядов через мембрану. Без применения искусственных доноров электронов показано, что перенос первого электрона в восстановительной части каталитического цикла цитохромоксидазы (переход OH->EH) сопряжен с трансмембранной перекачкой протона. Определена константа спонтанной диссоциации CO от гема а3 (~0.37±0.025 c-1) встроенной в азолектиновые протеолипосомы цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Разрешены два переходных процесса обратного тока электронов в цитохромоксидазе caa3 из T.thermophilus: 1) первичный перенос электронов от гема а3 к гему а (~<1 мкс); 2) перенос электронов от гема а и CuB к паре CuA/цитохром с (~30-40 мкс). Перенос электронов от СuB к гему а не разрешается как отдельный переходный процесс вследствие более медленной диссоциацией CO от CuB (~35 мкс вместо ~3 мкс в цитохромоксидазе митохондрий). Обратный перенос электронов к паре СuA/цитохром с сопровождается генерацией мембранного потенциала, амплитуда которой зависит от редокс-состояния всех входных редокс-центров (гем а, CuA и цитохром с), достигая максимального значения при уровне восстановленности в среднем ~3.6 электрона на молекулу фермента. Разрешена кинетика генерации мембранного потенциала, сопряженная c переходом OH ->EH в каталитическом цикле представителя семейства B, цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, характеризующейся сниженной усредненной эффективностью перекачивания протонов. Выявлены 3 электрогенные компоненты: быстрая (~12-22 мкс), средняя (~140-260 мкс) и медленная (~0.67-1.6 мс). Быстрая компонента отражает перенос электрона от CuA на гем b; две другие фазы вызваны транслокацией протонов, сопряженной с реокислением гема b. Результаты изучения мутантых форм с заменами в выходном (D372I) и входном (T312S) протон-проводящих путях свидетельствуют о том, что: 1) в переходе OH ->EH цитохромоксидазы ba3 не происходит перекачивания протона через мембрану; 2) остаток T312 в предполагаемом протон-проводящем К-канале критически важен для переноса субстратных протонов в восстановительной части каталитического цикла фермента. Исследовано влияние мутации D132N в протон-проводящем D-канале цитохромоксидазы аа3 из Rhodobacter sphaeroides на кинетику переноса электрона от гема а в биядерный центр в F->O переходе. Эффект мутации D132N на скорость переноса электрона свидетельствует: 1) о наличии внутренних доноров протонов в D-канале, способных обеспечить протонирование биядерного центра, несмотря на блокирование мутацией входа в D-канал; 2) о влиянии мутации D132N на функциональное состояние протон-переносящих групп и перенос протонов в верхней части D-канала. C помощью многоволновой микросекундной спектрофотометрии исследована рекомбинация CO после фотолиза из биядерного центра хинолоксидазы bd-типа из Escherichia coli в состоянии смешанной валентности и в полностью восстановленном состоянии. Обнаружено, что фотодиссоциация CO от фермента в состоянии смешанной валентности вызывает быстрый (~1.5 мкс) перенос электрона от гема d к гему b595, неописанный ранее. В состоянии смешанной валентности фермента, в отличие от полностью восстановленного состояния, изменения спектра поглощения хинолоксидазы bd в ответ на диссоциацию CO от гема d - незначительны либо отсутствуют вовсе. Предполагается, что фотодиссоциация CO от гема d в состоянии смешанной валентности сопровождается немедленным связыванием эндогенного лиганда с противоположной стороны гема. На следующей стадии, рекомбинация CO с гемом d (~16 мс) приводит к образованию временного гексакоординированного состояния (CO-Fe2+-L). Затем, лиганд медленно диссоциирует от гема d (~30 мс). Проведено исследование взаимодействия хинолоксидазы bd из Escherichia coli с пероксинитритом. Полученные результаты указывают на роль данной оксидазы в защите патогенных микроорганизмов от повреждающего действия пероксинитрита, продуцируемое хозяином.

Выявлены 5 переходов, отражающих последовательность спектральных изменений цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus молекулярным кислородом в режиме одного каталитического оборота. Конечное состояние EH, образующееся из высокоэнергетического окисленного состояния ОH, характеризуется локализацией электронного эквивалента в биядерном центре на CuB. Разрешена кинетика генерации мембранного потенциала встроенной в протеолипосомы цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Без применения искусственных доноров электронов показано, что перенос первого электрона в восстановительной части каталитического цикла цитохромоксидазы (переход OH->EH) сопряжен с трансмембранной перекачкой протона. Разрешены два переходных процесса обратного тока электронов в цитохромоксидазе caa3 из T.thermophilus. Определена константа спонтанной диссоциации CO от гема а3 (~0.37±0.025 c-1) встроенной в азолектиновые протеолипосомы цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Разрешена кинетика генерации мембранного потенциала, сопряженная c переходом OH ->EH в каталитическом цикле представителя семейства B, цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, характеризующейся сниженной усредненной эффективностью перекачивания протонов. C помощью многоволновой микросекундной спектрофотометрии исследована рекомбинация CO после фотолиза из биядерного центра хинолоксидазы bd-типа из Escherichia coli в состоянии смешанной валентности и в полностью восстановленном состоянии. Обнаружено, что фотодиссоциация CO от фермента в состоянии смешанной валентности вызывает быстрый (~1.5 мкс) перенос электрона от гема d к гему b595, неописанный ранее.