Разработка интегральных био-оптических индикаторов патологических состояний при социально значимых заболеванияхНИР

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях
Результаты этапа: Данный проект посвящен разработке оптимального набора интегральных индикаторов, необходимого для детектирования патологических процессов в организме. Данный набор параметров должен включать оптические характеристики, измеряемые на молекулярном, клеточном и органо-тканевом уровнях. На отчетном этапе были проведены эксперименты с использованием флуоресцентной спектроскопии на модельных системах при различных внешних воздействиях, включая (i) растворы белков плазмы крови и (ii) плазму крови крыс с экспериментальным диабетом. Было показано, что полоса в спектрах флуоресценции с максимумом на 420 нм (при возбуждении в области 320 нм) может быть использована для детектирования фибриллоподобных структур, возникающих в результате нарушения конформации белков и последующей агрегации. Было предположено, что природа данной полосы связана со взаимодействием ароматических колец в агрегатах по механизму pi-stacking. Сравнительный анализ флуоресцнтных свойств тирозиновых остатках в гомологичных белках (сывороточных альбуминах) показал, что тирозиновая флуоресценция может быть в ряде случаев более чувствительной к конформационным изменениям белков, чем триптофановая флуоресценция, в частности, данный подход позволяет детектировать связывание лигандов в домены белка, расположенные на удалении от единственного триптофанового остатка в сывороточном альбумине человека. Эксперименты, проведенные на образцах плазмы крови крыс с экспериментальным диабетом, показали, что индикатором гипергликемии может служить отношение интенсивностей пиков на 390 и 450 нм в спектрах флуоресценции при возбуждении на 320 нм. Была дана интерпретация предложенного индикатора, основанная на изменении концентрация НАДФ и конечных продуктов гликирования в исследованных образцах. На отчетном этапе были также исследованы возможности формализма, основанного на уравнении Штерна-Фольмера, для определения числа сайтов связывания и констант комплексообразования в системах белок-лиганд. Был предложен подход для расчета кривых тушения флуоресценции, использующий различные модели комплексообразования в системе. Данный подход может быть использован для детектирования связывания лигандов белками плазмы крови. Оптические измерения агрегационных и деформационных характеристик эритроцитов крови крыс с экспериментально вызванными сахарным диабетом и гипертензией и их комбинацией, а также эритроцитов человеческой крови пациентов, страдающих этими же заболеваниями позволили заключить, что этихарактеристики могут рассматриваться в качестве био-оптических индикаторов этих заболеваний. При этом имеются значительные корреляции с флюоресцентно измеряемыми характеристиками белковых компонентов крови. Результаты корреляционного анализа данных капилляроскопии и кардиографицеских обследований пациентов дают основания предполагать, что повышение артериального давления вызывает ремоделирование как сердца, так и сосудов: значения систолического и диастолического артериального давления коррелировали с коэффициентом ремоделирования капиллярного русла и с индексом массы миокарда. Однако изменения микроциркуляции, по-видимому, наступают раньше, чем развивается гипертрофия миокарда левого желудочка. Таким образом, исследование показало, что перестройка капиллярного русла при артериальной гипертензии предшествует гипертрофии миокарда левого желудочка.
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях
Результаты этапа: При выполнении исследований по оптической индикации конформационных изменений белков плазмы крови были получены следующие результаты: 1) Для одного из важнейших белков плазмы крови - сывороточного альбумина человека (САЧ) были получены зависимости интенсивности тирозиновой флуоресценции от концентрации детергента SDS для различных концентраций белка. На основании совместной обработки полученных зависимостей по простейшей модели образования комплекса были определены параметры связывания (число сайтов, константа реакции образования комплекса), а также изменение сечения флуоресценции тирозина в комплексе SDS-САЧ (Приложение, таблица 1). Полученные параметры связывания согласуются с литературными данными. 2) Было проведено сравнение зависимости интенсивности тирозиновой флуоресценции от концентрации SDS для плазмы крови без патологии и водных растворов основных белков плазмы крови. На основании полученных данных можно сделать вывод, что увеличение интенсивности тирозиновой флуоресценции плазмы крови при повышении концентрации детергента обусловлено конформационными изменениями САЧ. Таким образом, в работе было показано, что 1) параметры комплекса SDS-САЧ (модель комплекса ЖК-САЧ) могут быть определены с помощью собственной флуоресценции САЧ, обусловленной наличием тирозиновых остатков в молекуле белка, в то время, как триптофановая флуоресценция практически не меняется; 2) изменение фотофизических параметров тирозина для плазмы крови при добавлении SDS полностью определяются изменением конформации САЧ. Результаты данной работы были представлены на конференциях International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT-2015), Faro, Portugal, 7-11 Sept. 2015. и International Symposium on Optics and Biophotonics - III, Saratov, Russia, 21–25 September, 2015., а также направлены в сборник Proceedings SPIE (статья принята к публикации редактором сборника). Были измерены кинетики затухания флуоресценции молекулярного зонда, введенного в образцы плазмы крови – флуоресцентного зонда тиофлавина Т. Молекулярный зонд тиофлавин Т селективно встраивается в фибриллярные структуры, при этом его фотофизические параметры претерпевают значительные изменения. Изменения кинетик затухания флуоресцентного зонда тиофлавина Т были измерены для образцов плазмы крови крыс контрольной группы и группы с аллоксановым диабетом. Данные измерения позволили отследить корреляцию между биохимическими анализами и интегральным индикатором конформационных изменений белков плазмы крови. Также изучали микрореологические свойства эритроцитов у больных сахарным диабетом первого (СД1) и второго (СД2) типов, а также у пациентов, страдающих акромегалией. Кинетику агрегации и дезагрегации эритроцитов анализировали методом регистрации обратного светорассеяния, а деформируемость эритроцитов – методом эктацитометрии. Всего обследовано 44 человека (24 женщины и 20 мужчин): из них с СД1 - 16 человек, СД2 - 22 человека, с акромегалией – 6 человек. Диагноз клинически подтвержден, все пациенты на момент исследования находились в стационаре. У всех пациентов был значимо увеличен уровень глюкозы и гликозилированного гемоглобина. В качестве группы сравнения использовали кровь 22 практически здоровых людей, сопоставимых по полу и возрасту. Из локтевой вены всех испытуемых забиралась кровь с добавлением цитрата натрия в качестве антикоагулянта, показатель гематокрита стандартизировали – 40%. С помощью лазерного агрегометра-деформометра (LADE, RheoMedLab, Россия) оценивали способность эритроцитов образовывать агрегаты и кинетику их дезагрегации. Образование крупных агрегатов, их максимальная гидродинамическая прочность и максимальный индекс деформируемости эритроцитов были одинаковым во всех трех группах. Однако при СД2 значимо ниже оказалась внутренняя вязкость эритроцита, а жесткость мембраны выше, чем в двух других группах. В принципе, эритроциты при сахарном диабете хуже деформируются, что может влиять на движение крови в микроциркуляторном русле и приводить к микроангиопатиям. Обнаружено, что СД1 характеризуется замедленным образованием и незатрудненным распадом линейных агрегатов, но быстрым образованием трехмерных агрегатов, которые распадаются с трудом. С-пептид приводил к значимому снижению скорости образования монетных столбиков и повышению общей гидродинамической прочности агрегатов. Поскольку аналитические возможности клинических исследований ограничены, экспериментально воспроизводили на крысах модели социально значимых заболеваний, таких как ишемический инсульт и сахарный диабет. Микрогемореологические параметры изучались при экспериментальной фокальной ишемии головного мозга, развивающейся вследствие окклюзии (ОСМА), или тромбоэмболии средней мозговой артерии (ТЭСМА) у крыс путем введения аутологичного, заранее приготовленного тромба. При отсутствии существенных изменений деформируемости эритроцитов, наблюдалось некоторое ускорение образования их агрегатов. Прочность эритроцитарных агрегатов изменялась разнонаправленно – в модели с ОСМА она повышалась, а при ТЭСМА – снижалась. Таким образом, механизм инициации ишемии играет существенную роль в направлении гемореологических изменений. Результаты данной работы были представлены на конференции International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT-2015), Faro, Portugal, 7-11 Sept. 2015.. Проведенные исследования выявили значимые различия в микроциркуляторной картине между группами пациентов с компенсированным и декомпенсированным СД, а также при сравнении с контрольной группой. Для изучения взаимосвязи нарушения реологических свойств крови in vivo и параметров агрегации клеток крови in vitro все пациенты были разделены на 2 группы: c нормальной агрегацией эритроцитов (n = 15) и с повышенной агрегацией эритроцитов (n = 10) по капилляроскопии. значимые различия между группами обнаружены по параметрам агрегации эритроцитов « t1/2» и «критическое время» (t1/2) и агрегации тромбоцитов. При проведении капилляроскопии выявлено близкое к значимому снижение средней скорости капиллярного кровотока у пациентов с артериальной гипертензией, получающих гипотензивную терапию, и не принимающих кардиомагнил. Значимых различий по параметрам агрегации эритроцитов при исследовании прибором «Rheoscan-A» выявлено не было. Агрегация тромбоцитов по Борну не была нарушена. Значимые различия между группами с нормальной и повышенной агрегацией эритроцитов обнаружены для « t1/2» и «критическое время», (t1/2) и агрегации тромбоцитов. Результаты данной работы были представлены на конференциях: 3rd International Conference «BioPhotonics-2015», Florence, Italy, 20-22 May 2015 и SFM’15 и International Symposium on Optics and Biophotonics - III, Saratov, Russia, 21–25 September, 2015.
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".