ИСТИНА

В результате широкого скрининга, проведенного среди мицелиальных грибов-продуцентов различных гидролитических ферментов (амилаз, липаз, целлюлаз, пектиназ) отобраны штаммы, характеризующиеся высокой скоростью накопления биомассы с максимальной внеклеточной целевой активностью. Показано, что близкородственные штаммы мицелиальных грибов, принадлежащие к одному роду и даже виду, характеризуются разным уровнем одних и тех же гидролитических активностей при их культивировании в одних и тех же условиях. При анализе целевых ферментативных активностей у всех изученных грибов обнаружено наличие протеаз, но уникальным по уровню секреции протеаз оказался галоалкалофильный гриб Heleococcum alkalinum, ферментативные активности которого впервые исследовались в рамках этого проекта. Разработаны прототипы новых высокоактивных иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток мицелиальных грибов: H. Alkalinum для получения уникальных амилаз с чрезвычайно широким рН-оптимумом действия (рН 4,5-11,0) и протеаз; грибов Aspergillus foetidus, Trichoderma aureoviride, Rhizopus oryzae, включенных в криогель поливинилового спирта (ПВС), обеспечивающие длительную секрецию целевых ферментов (пектиназ, целлюлаз, амилаз и липаз) и предназначенных для использования в различных областях биотехнологии. При этом установлены общие закономерности формирования активных биокатализаторов и условия получения иммобилизованного метаболически активного мицелия на основе полимерных гранул с включенными в них спорами. Особое внимание в ходе исследований было уделено длительности процесса формирования биокатализаторов и составу питательных сред. Впервые продемонстрирована возможность создания полифункциональных биокатализаторов на основе одной и той же культуры гриба при варьировании условий формирования. Также найдены условия получения полимерных матриц (режимы замораживания/размораживания гранул, концентрация полимера определенной молекулярной массы и степени дезацетилирования) на основе криогеля ПВС с улучшенными физико-механическими и операционными характеристиками для иммобилизации клеток мицелиальных грибов. Проведена оптимизация условий длительного культивирования иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих различные внеклеточные ферменты по длительности процесса, концентрациям используемых субстратов и вводимого в систему самого биокатализатора. Показано, что практически все разработанные биокатализаторы могут быть многократно и длительно (до 600 ч) использованы для получения ферментов в непрерывных процессах с регулярной заменой питательной среды, а также храниться длительное время (как минимум до 24 месяцев). Сравнительный анализ биохимических характеристик свободных и иммобилизованных клеток грибов позволил выявить различия в уровнях синтеза ключевых ферментов и в составе комплексов секретируемых ферментов. Показано, что иммобилизация вызывает значительное расширение спектра секретируемых белков или изоформ одних и тех же белков. Установлено влияние условий формирования биокатализаторов, а также условий и длительности их эксплуатации на прочностные характеристики гранул разработанных иммобилизованных биокатализаторов. Созданы модели высокоэффективного использования разработанных биокатализаторов в биотехнологических процессах, сопряженных с использованием ферментативных активностей иммобилизованных клеток грибов. Показано, что биокатализатор, обеспечивающий секрецию амилолитических ферментов, может быть использован для получения L(+)-молочной кислоты в крахмалосодержащих средах. На примере модельных жиросодержащих стоков предприятий пищевой промышленности показана возможность применения разработанного в проекте прототипа биокатализатора для биологической очистки сточных вод. Установлена способность иммобилизованных клеток секретировать комплекс липолитических ферментов, осуществляющих 98%-ный гидролиз различных жиров при их исходной концентрации в среде до 21 г/л. Подобных аналогов у разработанного биокатализатора в мире нет, поэтому результаты, полученные в этой части проекта, вошли в материалы заявки на Патент РФ, получившей положительное решение. Показана возможность комбинированного применения иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток A. foetidus и T. aureoviride, являющихся, соответственно, продуцентами пектиназ и целлюлаз, для гидролитической обработки свекловичного жома с последующей конверсией полученных ферментализатов, содержащих различные сахара, в биоэтанол под действием иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток грибов Mucor circinelloides и Aspergillus terreus, впервые разработанных в рамках этого проекта и не имеющих мировых аналогов. Установлено, что накапливающиеся концентрации этанола в случае применения этих иммобилизованных биокатализаторов были в 8,0- 49,3 раз выше (в зависимости от штамма и исходного рН среды) по сравнению с результатами, полученными в тех же средах на свободных клетках тех же мицелиальных грибов и в 1,2-1.8 раза выше по сравнению с препаратами спиртовых дрожжей, также иммобилизованных в криогель ПВС. Цели проекта достигнуты, его задачи решены, объем запланированных исследований выполнен полностью. Полученные результаты опубликованы в 6 статьях, докладывались на отечественных (1) и международных (12) конференциях; также получено положительное решение по заявке на патент РФ.